Abstract
L'étude des interactions entre protéines dans le contexte de cellules vivantes peut générer des informations essentielles sur la localisation, la dynamique et partenaires d'interaction. Cette information est particulièrement utile dans le contexte des interactions hôte-pathogène. De nombreuses protéines de pathogènes fonctionnent dans des cellules hôtes dans une variété de telle sorte que, ce qui permet l'évasion du système immunitaire de l'hôte et la survie dans l'environnement intracellulaire. Pour étudier ces interactions hôte-pathogène cellulaires protéiques, plusieurs approches sont couramment utilisés, y compris: l'infection in vivo avec une souche exprimant une protéine marquée ou mutant, ou l'introduction de gènes de pathogènes par transfection ou transduction. Chacune de ces approches a ses avantages et ses inconvénients. Nous avons cherché un moyen d'introduire directement des protéines exogènes dans les cellules. L'électroporation est couramment utilisé pour introduire des acides nucléiques dans les cellules, mais a été plus rarement appliquée aux protéines bien que la base biophysique est exactement le même.Une électroporation standard a été utilisée pour introduire des effecteurs bactériens affinité marqué dans des cellules de mammifères. Cellules macrophages épithéliales humaines et de souris ont été cultivées par des méthodes traditionnelles, détachés, et placés dans 0,4 cm cuvettes d'électroporation écart avec une protéine bactérienne pathogène exogène d'intérêt (par exemple Salmonella Typhimurium GtgE). Après l'électroporation (0,3 kV) et une courte période de récupération (4 h), la protéine intracellulaire a été vérifiée par marquage par fluorescence de la protéine par l'intermédiaire de son marqueur d'affinité et en examinant la distribution spatiale et temporelle par microscopie confocale. La protéine a également été montré une électroporation pour être fonctionnel dans la cellule et capable de trafic intracellulaire correct et l'interaction protéine-protéine. Bien que les protéines exogènes ont tendance à se accumuler sur la surface des cellules, les échantillons ont électroporées fortes augmentations de la concentration intracellulaire effecteur par rapport à incubation seul. Le protocole est simple et assez rapide pour être fait dans apParallèle mode, permettant la caractérisation à haut débit de protéines pathogènes dans des cellules hôtes, y compris le ciblage et la fonction des protéines de virulence subcellulaire.
Introduction
De nombreuses bactéries Gram-négatives utilisent des systèmes de sécrétion spécialisés pour injecter des protéines liées à la virulence (appelés effecteurs) directement dans les cellules hôtes 1-5. Ces effecteurs ont une large gamme de fonctions biologiques, notamment: la suppression de l'immunité de l'hôte, des modifications cytosquelettiques, la modification du trafic intracellulaire et la signalisation, les changements transcriptionnels et des altérations de protéasome hôte 9.6. Les fonctions d'effecteurs certains sont connus, mais les cibles de l'hôte et de l'action biochimique (s) de nombreux autres restent à déterminer. En comparant de type sauvage et les infections bactériennes recombinantes est une approche valable pour étudier les mécanismes effecteurs de virulence intracellulaires, il est souvent avantageux d'introduire un effecteur individu dans la cellule hôte. Ainsi, des méthodes simples pour l'introduction et la caractérisation de protéines effectrices bactériennes dans le contexte de cellules hôtes est hautement souhaitable.
Simplifier l'analyse expérimentale wie un seul effecteur est essentiel que d'autres effecteurs peuvent avoir des fonctions opposées ou redondantes. Pour réaliser cette simplification, les chercheurs ont déjà présenté des macromolécules dans des cellules par de nombreux procédés différents, y compris la transduction virale 10, la micro-injection 11, gratter chargement 12,13, la fusion cellulaire avec la micro-injection induite chimiquement 14, protéine de propriété «transfection» réactifs 15, des précipitations de phosphate de calcium 16, 17 à 20 et l'électroporation. Les molécules introduites vont d'acides nucléiques, y compris les espèces de l'ADN, l'ARN, les protéines et d'ARNi, des colorants cellulaires imperméable, et des anticorps pour des cibles intracellulaires 21,22. Certaines méthodes ont des limites, y compris le type de macromolécule qui peut être introduite, et notamment des analyses en aval peuvent être limitées en raison de la toxicité élevée cellulaire, mécanismes dommageables d'action, faible efficacité, ou l'efficacité d'introduction. Transfection, un ofteProcédé de n-utilisée pour l'expression de gènes bactériens dans les cellules de mammifères, souffre également que la limitation de certains types de cellules hôtes appropriées, telles que les macrophages et les cellules primaires, sont particulièrement résistants à la transfection. Au-delà, il est difficile de contrôler les niveaux de protéine bactérienne produite lors de l'introduction de l'ADN étranger.
Beaucoup de travail a établi électroporation d'acides nucléiques dans les cellules bactériennes et de mammifères comme une technique de laboratoire commun; Cependant, il ya des recherches en cours sur les meilleures méthodes pour délivrer des protéines dans les cellules dans des conditions physiologiques. Rapports sur les protéines transfection sont prometteurs, mais nécessitent des réactifs coûteux et optimisation. Le désir d'introduire effecteurs bactériens potentiellement toxiques dans une grande variété de cibles cellulaires avec un coût minimal nous a conduit à envisager l'électroporation comme une méthode pour l'étude de ces protéines in vivo.
Protein électroporation 23-25 est une rencontreHod d'introduire des protéines dans des cellules vivantes par électroperméabilisation, aussi connu comme électro-transfection ou électro-injection 26. Cette technique utilise des impulsions à haute intensité de courant pour créer des pores dans les membranes cellulaires. Ces pores réversibles permettent macromolécules qui sont normalement exclues de l'espace intracellulaire d'entrer dans la cellule. Lors de l'enlèvement du champ électrique externe, la membrane peut refermer, permettant à la cellule de retenir les molécules qui sont passés à travers les pores 27,28.
Un électroporateur standard a été utilisé dans cette étude pour introduire systématiquement effecteurs bactériens dans les deux cellules de type macrophage souris et des cellules épithéliales humaines. La méthode est rapide, efficace et peu coûteux, sans diminution sensible de la viabilité cellulaire. Les protéines introduites peuvent être visualisées par microscopie d'immunofluorescence ou utilisés pour des tests fonctionnels. Cela a été démontré en utilisant la protéine fluorescente verte (GFP) en tant que norme non toxique, ainsi quedeux protéines effectrices Salmonella, SspH1 et GtgE. Nous proposons protéines électroporation comme un outil supplémentaire dans le répertoire pour l'étude des protéines de virulence bactérienne et leurs fonctions dans des cellules hôtes eucaryotes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Préparez à l'avance
- Chaud stérile saline tamponnée phosphate (PBS) à 37 ° C.
- Modification de Dulbecco chaud de milieu de Eagle (DMEM) et le milieu essentiel minimal (MEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 UI / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine à 37 ° C. Remarque: Ils représentent croissance normale Media (NGM) pour les cellules RAW et HeLa respectivement.
2. Préparation des cellules
- Cultiver les cellules RAW 264.7 à 70-90% de confluence dans NGM.
- Maintenir les cellules à 37 ° C dans 95% d'air / 5% de CO2 atmosphère humidifiée.
- Cultiver les cellules HeLa à 70-90% de confluence dans NGM.
- Maintenir les cellules à 37 ° C dans 95% d'air / 5% de CO2 atmosphère humidifiée.
- Avant le prélèvement, laver monocouche cellulaire une fois avec PBS stérile.
- Recueillir des cellules pré-confluentes dans un tube conique stérile.
- Grattez délicatement les cellules RAWavec une spatule en caoutchouc dans du PBS, avec pipetage répété pour disperser les agrégations cellulaires.
- Détacher les cellules HeLa avec une solution de trypsine à 0,25% jusqu'en examen visuel montre une dissociation de la surface de culture. Par exemple, utiliser 2-3 ml pour un flacon T-75. Réglez le volume en conséquence pour assurer une solution de trypsine couvre toute la surface de croissance.
- Étancher réaction de dissociation avec NGM contenant 10% de FBS.
- Utiliser au moins deux fois le volume de NGM à la trypsine, avec un pipetage répété pour disperser les agrégations cellulaires.
- Légèrement sédimenter les cellules par centrifugation à 900 g pendant 4 min.
- Remettre en suspension dans même volume que solution de trypsine / de trempe en utilisant du PBS stérile.
- Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre ou compteur de particules.
- Légèrement sédimenter les cellules par centrifugation à 900 g pendant 4 min.
- Remettre en suspension dans un volume adéquat de solution PBS pendant 5,5 x 10 6 à 6,0 x 10 6 cellules / ml. Remarque: Par exemple, un flacon T-75 donnera Approximment 7,5 x 10 6 cellules 29.
- Gardez la suspension de cellules sur la glace jusqu'à l'électroporation.
3. Préparation à électroporation
- Cuvettes pré-refroidissement électroporation (0,4 cm d'écart) sur la glace.
- Allumez appareil d'électroporation et de régler la tension à 0,3 kV.
REMARQUE: La capacité et la résistance ne étaient pas les paramètres réglables sur notre électroporateur (fixé à 10 pF et 600 Ω par le fabricant). - Remplissez plaques de recouvrement avec NGM et équilibrer dans l'air humidifié / 5% de CO 2 atmosphère de 95% à 37 ° C
4. électroporation
- Placer 400 ul de suspension de cellules dans la cuve de pré-réfrigérés et ajouter 20 pg de protéine sélectionnée à cuvette (50 ug / ml).
- Flick cuvette doucement à environ 10 fois pour mélanger sans endommager les cellules. Remarque: La cuvette peut aussi être inversé plusieurs fois pour bien mélanger, mais Ne pas pipeter de haut en bas ou vortex pour éviter d'endommager les cellules.
- Échantillon électroporation à 0,3 kV pour 1.5 à 1.7 ms. Remarque: Ce était typique pour cette étude.
- Immédiatement après l'électroporation film cuvette doucement ~ 10 fois pour bien mélanger.
5. Placage des cellules
- cuvette de magasin avec des cellules électroporées sur la glace jusqu'au moment de placer dans des plaques de recouvrement.
- Pour la plupart des analyses en aval, laver les cellules avec 1x préchauffé NGM pour éliminer les protéines effectrices étrangère.
- Éliminer les cellules d'analyse et de suspendre 3-5 ml de NGM.
- Pellet les cellules par centrifugation à 900 g pendant 4 min.
- Remettre en suspension dans un volume adéquat de NGM pour la taille de la plaque désirée (par exemple 2 ml pour boîte de 35 mm).
- Retirer quantité appropriée de cellules pour l'analyse en aval.
- Exemple 1: plaque dans des boîtes à fond de verre pour analyse au microscope.
- Exemple 2: Plaque into plastique de culture de cellules pour l'analyse des protéines telles que des purifications par affinité.
- Laisser les cellules de récupérer en plaques équilibrée dans humidifié 95% d'air / 5% de CO 2 atmosphère à 37 ° C pendant au moins 4 heures.
6. Microscopie Analyse
6.1) La fixation / coloration par immunofluorescence
- Laver les cellules avec du PBS 1x stérile après la période de récupération de 4 heures.
- Fixer les cellules de methanol à 100% pendant 2 min à la température ambiante. Utiliser suffisamment de méthanol pour couvrir complètement cellules (par exemple 2 ml pour boîte de 35 mm).
- Laver 3x avec PBS stérile.
- Perméabiliser les cellules avec 0,4% de Triton X-100 dans du PBS pendant 15 min. Par exemple, en utilisant 1 ml pour une plaque de 35 mm de diamètre.
- Ajuster la longueur de perméabilisation et la force de Triton X-100 selon l'épitope et la localisation de la protéine cible. Remarque: Les meilleurs résultats devront être déterminé de manière empirique pour chaque cible, mais les conditions ci-dessus doivent être adéquates pour la plupart cytosolic cibles.
- Bloquer avec 5% de sérum-albumine bovine (BSA) dans du PBS pendant 1 heure à température ambiante. Par exemple, en utilisant 1 ml pour une plaque de 35 mm de diamètre.
- Laver 3x avec PBS.
- Incuber anticorps primaire dans la solution de liaison d'anticorps (0,1% de Triton X-100 et 1% de BSA dans du PBS) pendant une nuit à 4 ° C avec doux balancement. Par exemple, utiliser 0,5 ml pour une boîte de 35 mm de diamètre.
- Suivez les recommandations du fabricant pour l'anticorps dilution. Remarque: Par exemple, l'anticorps marqueur peptidique de liaison à la streptavidine (SBP-tag) a été utilisé à 1: 1000 dilution, tandis que l'anticorps a été utilisé à PKN1 dilution 1: 200.
- Laver 4x avec PBS.
- Incuber avec l'anticorps approprié fluorescence conjugué secondaire en solution de liaison d'anticorps pendant 1 heure à température ambiante, à l'abri de la lumière.
- Par exemple, utiliser Alexa 488 ou Alexa 647 pendant 1 heure à température ambiante.
- Suivez les recommandations du fabricant pour antibody dilution. (Par exemple environ 1: 1000 pour la présente étude).
- Ajouter d'autres taches, au besoin, par exemple, 5 uM germe de blé agglutinnin (WGA) conjugué à Alexa 647 ou DAPI selon les recommandations du fabricant, pendant 1 heure à température ambiante.
- Par exemple, utiliser Alexa 488 ou Alexa 647 pendant 1 heure à température ambiante.
- Laver 5x avec du PBS et conserver à 4 ° C, à l'abri de la lumière jusqu'au moment de l'image.
6.2) microscopie confocale et analyse d'images
- échantillons de l'image sur un microscope confocal inversé en utilisant un objectif à immersion 63x d'huile.
- canal vert d'image en utilisant la ligne de 488 nm d'un laser à l'argon, avec une bande passante de 492 à 542 nm émission entre.
- Image canal rouge utilisant une diode laser de 633 nm, avec une bande passante de 640 à 718 nm émission entre.
- canal bleu de l'image en utilisant une diode laser à 405 nm, avec une bande passante de 407 à 453 nm émission entre.
- Assurer le canal multiples z piles couvrent l'intégralité du volume cellulaire.
- Traiter les images avec un logiciel de traitement d'image approprié.
7. Affinity Purification
- Laver les cellules électroporées deux fois avec 4 ° C PBS après la période de récupération de 4 heures.
- Lyse à ~ 1,0 ml de tampon de lyse (1% de Triton X-100 avec un cocktail inhibiteur de protease et l'inhibiteur de la phosphatase dans du PBS) sur de la glace. Utilisez inhibiteurs selon les instructions du fabricant. Remarque: Par exemple, à la fois les inhibiteurs de la protéase et la phosphatase utilisées dans cette étude ont été fournis à 100x, mais d'autres formulations devraient fonctionner aussi bien.
- Rapidement gratter cellules avec spatule en caoutchouc et de recueillir dans des tubes coniques.
- Lyse par vortex vigoureux et sonication. Note: D'autres méthodes de lyse peuvent travailler tout aussi bien, mais l'efficacité devront être déterminée empiriquement quant à la pertinence des exigences de dosage.
- Sonication 3 x 30 s avec un vortex intermittent.
- Centrifuger à 10 000 xg pendant 10 min à 4 ° C pour recueillirdes débris cellulaires et des agrégats insolubles; sauver le surnageant.
- Moissonneuse volumes égaux (~ 1,0 ml) de lysat de cellules à une électroporation avec 50 ul de streptavidine agarose suspension de résine à 4 ° C pendant une nuit avec rotation par rapport à l'extrémité extrémité. Note: Cette résine capture la protéine électroporation (et complexes associés) par l'intermédiaire de son peptide marqueur d'affinité de liaison à la streptavidine.
- Centrifuger à 2500 g pendant 2 min et éliminer le surnageant.
- Laver deux fois avec 40 volumes de lit (~ 1 ml) PBS.
- Ajouter 30 ul 4x LDS tampon de charge (141 mM de base Tris, 2% SI, 10% de glycerol, EDTA 0,51, 0,22 mM SERVA Bleu G, 0,175 mM de rouge de phénol, à pH 8,5), 20 ul diH 2 O, et 1 ul de 0,5 M de tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP), ce qui permet un certain volume pour rester en perles.
- Chauffer à 95 ° C pendant 10 min et laisser refroidir sur glace.
- Spin> 10 000 xg à 4 ° C pendant 5 min.
- Recueillir surnageant.
- Effectuer un western blot utilisant des anticorps appropriés Remarque: Ilre, anticorps primaire anti-PKN1 est utilisé.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Comme une preuve initiale de concept, la protéine fluorescente verte purifié a été introduit avec succès dans des cellules de mammifères en utilisant l'électroporation. GFP, environ un 27 kD d'une protéine de poids moléculaire sont couramment introduits dans des cellules de mammifères (normalement exprimées à partir d'ADN de plasmide) comme un outil de biologie moléculaire sans toxicité cellulaire significative. Des cellules HeLa ont été incubées (figure 1A) ou par électroporation (figure 1B) avec 25 ug / ml de GFP, suivie par immunofluorescence microscopie confocale pour vérifier le signal de la GFP fluorescente. Pour démontrer que la GFP était à l'intérieur du cytosol cellulaire, les cellules ont été également colorées avec de germe de blé agglutinine (WGA) pour délimiter la frontière cytosolique (rouge) ainsi que d'un colorant d'acide nucléique, DAPI (bleu) pour indiquer le noyau. Signal GFP intracellulaire n'a été observée que sur électroporation, alors qu'aucune protéine intracellulaire a été observée dans des cellules incubées avec la GFP. Des résultats similaires ont été observés avec la souris RAW264.7des cellules de type macrophage (Figure 1C et 1D). Notez que WGA est une lectine qui se lie de manière préférentielle à des résidus dans la membrane plasmatique et donc peut présenter une coloration ponctuée fonction de la longueur d'incubation. Comparer la figure 1A et la figure 2A, où la figure 2A a été incubé pendant une durée plus longue que la figure 1A.
L'électroporation a ensuite été étendu à un balisé, effecteur Salmonella purifié, GtgE. GtgE, un facteur de virulence connu 30, a été découvert par notre groupe pour être sécrétées dans les cellules hôtes 31, et a été récemment montré être un cystéine protéase 32. Des cellules HeLa ont été incubées ou une électroporation avec 50 pg / ml GtgE. Pour l'analyse d'immunofluorescence, les cellules ont été colorées avec un anticorps contre le peptide marqueur d'affinité de liaison à la streptavidine sur GtgE. Les cellules ont été également colorées avec du DAPI et WGA. Dans les cellules HeLa incubées (Figure 2A), il n'y a pas GtgE intracellulaire comme visualisé par un manque de foyers fluorescents vert. En revanche, les cellules électroporées HeLa (Figure 2B) montrent le signal intracellulaire significative protéine effectrice indiquant fluorescent était entré dans les cellules en raison du processus d'électroporation. Cellules RAW ont montré une propension à accumuler légèrement augmenté protéine sur la surface cellulaire pendant l'incubation (figure 2C), mais le signal intracellulaire a été observée seulement à électroporation (figure 2D).
Détermination de la limite de détection pour la visualisation de la localisation sous-cellulaire par microscopie confocale est important de se assurer suffisamment de protéines est entré dans la cellule, tout en évitant une surcharge de la cellule avec des effecteurs bactériens potentiellement toxiques. Sur la figure 3, GtgE a été électroporé dans des cellules de type macrophage RAW à 2,5, 25, et 50 ug / ml. Les cellules ont ensuite été fixées et colorées avec un anticorps contre l'étiquette sur GtgE. Oeul un très petit nombre de foyers ont été observés à 2,5 ug / ml GtgE (figure 3A), avec augmentation du nombre de foyers apparente à 25 pg / ml, (figure 3B), mais le plus grand nombre de foyers distincts ont été vus à la protéine maximale concentration testée, 50 ug / ml (Figure 3C). Motifs de coloration similaires ont été observées entre les échantillons indiquant à ces concentrations de protéines protéine intracellulaire pourrait être facilement vérifiée par microscopie confocale. Les concentrations en protéines de plus de 50 ug / ml ont été testés pas parce que la concentration de protéine élevé, plus la tendance à la protéine cible de se adsorber à la surface des cellules. Pour éviter ces agrégats de protéine associée à la membrane, il est devenu nécessaire de mettre en commun deux cuvettes d'électroporation d'obtenir suffisamment de protéine d'interaction hôte de visualiser sur un western blot (figure 6, la voie de droite).
Pour démontrer davantage que l'introduit protéine ne était pas simplement adsorbé à la surface de la cellule, les articles optiques consécutifs ont été imagées à tous les plans focaux de 0,35 à 0,43 micromètres (Z-piles) en utilisant la microscopie confocale. Cellules RAW ont été électroporés avec 50 ug / ml GtgE et colorées comme décrit ci-dessus (figure 4, A et B). Les piles Z ont montré que GtgE était en effet intracellulaire et les foyers se étendent à partir du fond (figure 4A, plan 6 de 36) à la partie supérieure de la cellule (Figure 4B, plan 26 de 36). Des résultats similaires ont été obtenus pour toutes les protéines électroporation. Le profil de fluorescence intrinsèque des populations de cellules de commande avec ou sans protéine effectrice ou l'électroporation a été examinée par microscopie confocale à fluorescence, et a été trouvée comme étant négligeable.
En outre, la protéine électroporation a été examinée pour voir si elle a été ciblée pour une dégradation par voies d'endocytose. Les cellules ont été colorées pour liés Ras-protéines 5A (Rab5), unmarqueur pour endosomes précoces (figure 4C), ou Lysosome-associated membrane protein 1 (Lamp1), un marqueur de la fin des endosomes et lysosomes (Figure 4D). Co-localisation entre la protéine électroporation et ces marqueurs cellulaires indiquerait une interaction physique étroite entre eux (ce est à dire que la protéine électroporation était à l'intérieur des endosomes / lysosomes). La microscopie confocale a montré que la protéine électroporation (GFP ou GtgE) ne est pas co-localiser avec LAMP1 ou Rab5. Il a été déduit que la protéine introduite ne était pas directement endocytose dans les cellules ou ciblée à la voie d'endocytose dans les quatre heures de traitement.
L'introduction de la protéine exogène peut avoir des effets cellulaires au cours de plusieurs heures ou jours, et il est donc souvent bénéfique d'examiner la persistance de protéines introduites. Pour déterminer combien de temps une protéine électroporation persisterait sans dégradation après l'électroporation. O Sur la basen visualisation de l'attachement et l'étalement cellulaire, 4 heures a été établie à la durée minimale de récupération approximative de cellules électroporées. Pour observer le temps protéines persistance d'une expérience du temps bien sûr a été réalisée, coloration des cellules 4, 24, ou 96 heures après l'électroporation. Après 4 heures (figure 5A), lorsque la morphologie des cellules a suggéré récupération, il y avait une quantité appréciable de protéines intracellulaires. Après 24 heures (figure 5B), il y avait encore la protéine électroporation substantielle à l'intérieur des cellules. Même si la durée après l'électroporation a été étendu à 96 h avant la fixation et la coloration (figure 5C), il y avait des foyers observables mais à un abondance apparente réduite, démontrant jours protéines de persistance après le traitement initial.
Deux mises en garde importantes ont été observées au cours de ces expériences. Cellules RAW présentaient une plus grande tendance que les cellules HeLa à accumuler des protéines exogènes sur le IRRE de surface cellulaireincubation de perspective (figure 6A) ou l'électroporation (figure 6B). Malgré cela, tous les échantillons avaient augmenté électroporées protéine interne (Figures 1, 2, 5b). En outre, la protéine associée à la membrane a disparu au cours du temps. Une deuxième mise en garde est une petite population de cellules présentant un phénotype comprenant de plus petit, les cellules chargées avec des quantités élevées de protéines exogènes à la fois le contrôle arrondie (incubé) et des cellules traitées (électroporation) (figure 6 C et D, les échantillons d'incubation représenté). Les noyaux de ces cellules ont montré chromatine condensée sur la base de la coloration DAPI, et rempli la totalité du volume cellulaire, suggérant l'apoptose. Il est donc possible que les cellules apoptotiques (résultant en tant que partie normale du cycle cellulaire ou à cause de récolte / traitement) ont une propension à absorber la protéine à partir de la mémoire tampon.
Pour démontrer que les protéines électroporation étaient fonctionnels et pourraient localiser Correcte l'intérieur de la cellule hôte, la co-localisation et l'interaction protéine-protéine entre la protéine effectrice Salmonella SspH1 et son hôte cible connue, la protéine kinase N1 (PKN1) 33 a été représenté. Après électroporation, l'interaction physique entre SspH1 et PKN1 a été vérifiée par une immunoprécipitation base d'affinité suivie par western blot (figure 7A). Co-localisation a été également observé par microscopie confocale, ce qui indique les fluorophores sont suffisamment proches pour chevaucher l'espace 34. Après électroporation avec 50 pg / ml SspH1, les cellules HeLa (figure 7b) sont fixées et colorées pour SspH1 (vert) et PKN1 (rouge). À la puissance de laser de faible foyers distincts (jaune) ont été observés dans le noyau indiquant SspH1 et PKN1 étaient physiquement assez proche pour interagir. Cette interaction a été établi dans la littérature; Cependant, cette étude est la première à montrer la co-localisation dans le noyau.
= "Always"> 
Figure 1: L'électroporation de la GFP - HeLa ou des cellules RAW 264.7 cellules ont été incubées ou électroporation avec 25 pg / ml de purifié la protéine fluorescente verte (GFP) et colorées avec l'anticorps anti-GFP (Green), DAPI, une sonde spécifique nucléaire (Bleu. ), et WGA (Rouge) pour délimiter la frontière cytosolique. Cellules (A) HeLa incubées montrent une absence de fluorescence verte indiquant un manque d'internalisation de la GFP. (B) montre une microphotographie représentative de la GFP électroporation. On note l'apparition de foyers intracellulaire indiquant GFP était entré dans les cellules. (C) et (D) sont des images représentatives de cellules RAW incubées (C), ou électroporation (D) avec 25 pg / ml de la protéine fluorescente verte purifiée.
es / ftp_upload / 52296 / 52296fig2highres.jpg "/>
Figure 2:. Electroporation de Salmonella effecteur GtgE - cellules HeLa Des cellules ont été incubées (A) ou une électroporation (B) avec 50 ug / ml d'une affinité marqués Salmonella effecteur, GtgE, et colorées avec un anticorps marqueur anti-effectrice (Vert), DAPI, un masque nucléaire (bleu) et WGA (Rouge) pour délimiter la frontière cytosolique. Dans (A), incuber les cellules HeLa montrent une absence de fluorescence verte indiquant un manque d'internalisation des GtgE. (B) montre une microphotographie représentative d'électroporation GtgE, montrant intracellulaire électroporation protéine effectrice. (C) et (D) sont des images représentatives de cellules RAW qui ont été soit incubés à une électroporation ou, respectivement, de la même manière avec 50 ug / ml de Salmonella GtgE. Bleu clair est la combinaison ou superposition, de la fluorescence rouge de la WGA etla fluorescence verte de l'anticorps secondaire.
Figure 3: Titrage de protéine électroporation - cellules de type macrophage RAW Les cellules ont été électroporées avec 2,5 ug / ml (A), 25 pg / ml (B) ou 50 ug / ml (C) Salmonella effecteur GtgE et on les laisse récupérer pendant. 4 h. Les cellules ont été fixées et colorées avec un anticorps anti-SBP-tag (vert) et le masque noyaux, DAPI (bleu). Il est possible de visualiser foyers fluorescents, indiquant GtgE intracellulaire à 2,5 ug / ml par microscopie confocale, bien que de meilleurs résultats sont obtenus quand la valeur de départ plus élevé de la protéine ont été utilisés. Des résultats satisfaisants (y compris les protéines intracellulaires facilement observé par microscopie confocale sans agrégats associés excessive de la membrane) ont été obtenus à 50 ug / ml de n et donc GtgEo des concentrations supérieures ont été testés.
Figure 4:. Protein internalisation et l'absence de co-localisation avec des marqueurs de endosomes tranches optiques consécutifs (z-piles) obtenues par microscopie confocale de visualiser si la protéine électroporation était interne. Cellules RAW ont été électroporés avec 50 ug / ml GtgE. (A) montre tranche optique de 36 6, le z-pile (2,1 micromètres) au-dessus du fond de la boîte. (B) montre le même champ de vision mais à tranche de 26 36. Les foyers intracellulaires se étendent à travers la cellule pour indiquer que la protéine intracellulaire est vraiment pas agrégé et sur la surface de la cellule. Bleu clair est la combinaison de WGA rouge, anticorps secondaire vert et bleu DAPI. Test de co-localisation avec des marqueurs de endosomes / lysosomes, Rab5, (C) ou un marqueur lysosome, LAMP1 
Figure 5: Protein persistance après l'électroporation micrographie confocale montrant la persistance de GtgE électroporation au fil du temps.. 50 ug / ml GtgE a été électroporé dans des cellules HeLa. Les cellules ont ensuite été fixées et colorées avec un anticorps anti-SBP-tag (vert) et le masque noyaux, DAPI (bleu). 4 h (A) était déterminé à être le montant minimum de temps pour permettre aux cellules de se rétablir et comme prévu montre la protéine intracellulaire maximale. Après 24 heures (B) et 96 h (C), foyers vert, à la fois intracellulaire et sur le cellular surface, montrent la persistance effecteur indiquant que la protéine ne est pas dégradées jours après le traitement initial. La couleur bleu clair dans cette image est la superposition des DAPI bleu et la coloration d'anticorps vert. 
Figure 6:. L'agrégation des protéines de surface cellulaire et un phénotype d'électroporation des cellules de type macrophage RAW ont été soit incubés (A) ou une électroporation (B) avec 50 ug / ml GtgE et colorées avec anti-SBP-tag antibody (vert), WGA (Rouge ), et avec du DAPI (bleu). Les deux cellules HeLa RAW 264.7 et dans une moindre mesure, ont tendance à se agréger effecteur sur la surface de la cellule; toutes les cellules électroporées ont été montrées avoir augmenté protéine interne (HeLa non représenté). Le jaune est la superposition de rouge de vert et de WGA protéine cible. RAW (C) et HeLa (D) cellules showing un phénotype modifié après incubation avec GtgE (montré). Plusieurs expériences ont montré un phénotype constitué de petites cellules avec coloration au DAPI différentiel et une perte de cytoplasme. Bleu clair est la superposition de la WGA rouge, anticorps secondaire vert et bleu DAPI. La microscopie confocale a été utilisée pour montrer la protéine cible d'accumulation dans le noyau. Depuis ce phénotype de cellules de protéines chargées exogènes survient après l'incubation et l'électroporation, on pourrait émettre l'hypothèse ce phénotype être suggestive de l'apoptose. 
Figure 7:. Les interactions entre protéines de l'hôte avec électroporées Salmonella SspH1 - cellules HeLa Des cellules ont été électroporés dans les concentrations indiquées avec SspH1, on laisse récupérer pendant 4 heures avant de procéder à une purification par affinité modifiée suivi par Western Blot (A) pour enrichir etdétecter le partenaire interagissant eucaryote connu: la protéine sérine / thréonine kinase N1 (PKN1). Notez que la voie de droite (2x EP) comprend deux cuvettes communs, comme le signal d'une cuvette mélangé à fond, encore PKN1 était encore enrichi par le manque de liaison vu dans le contrôle sans appât. Le transfert de Western a été effectuée avec un lysat HeLa natif, purifié SspH1, et les échantillons de purification d'affinité avant d'être sondée avec un anticorps monoclonal contre PKN1. la détection de la cible a été obtenue par l'intermédiaire d'un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort réactivité contre l'isotype de l'anticorps primaire. Des cellules HeLa (B) montrant la co-localisation (jaune) entre PKN1 (rouge) et SspH1 (vert) par l'intermédiaire par microscopie confocale après électroporation avec 50 pg / ml SspH1. Ce chevauchement optique indique que l'effecteur et la protéine de l'hôte sont suffisamment proches pour interagir physiquement. Le fait que l'interaction a été montré dans le noyau pour la première fois, qui offre un support additionnella protéine a été victime de la traite correctement par l'hôte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Effecteurs sécrétée par les bactéries pathogènes ont évolué pour fonctionner dans l'environnement de la cellule hôte et il est donc utile de les étudier in situ dans l'hôte. Introduction d'effecteurs spécifiques d'intérêt dans des cellules hôtes permet les interactions pathogène-hôte pertinentes à étudier dans l'isolement, sans interférence avec d'autres protéines bactériennes. Le but était d'explorer électroporation comme un moyen d'introduire des protéines effectrices bactériennes dans des cellules hôtes eucaryotes, évitant ainsi certains des défis associés à la transfection ou transduction. La protéine fluorescente verte a été utilisé comme témoin et les protéines effectrices de Salmonella ont été testés. En raison de l'intérêt chez les bactéries pathogènes qui ciblent les cellules épithéliales accueillir ainsi que les cellules immunitaires, une lignée humaine de cellules épithéliales de type (HeLa) et les cellules de type macrophage souris (RAW 264.7) ont été utilisés. L'électroporation peut fournir des protéines exogènes dans des cellules hôtes, sans diminution sensible de la cellule de viabiliTy, et les protéines étaient livrés détectable dans les cellules pour jusqu'à quatre jours.
Pour isoler les effets de la protéine électroporation, protéine pure est nécessaire. Dans cette étude, les protéines ont été exprimées dans E. coli souche BL21 avec des étiquettes polyhistidine N-terminale et streptavidine-peptidiques. Les protéines ont été purifiées avec de la résine Ni-NTA, dosés pour la concentration (en général entre 5 à 25 mg / ml) et de pureté, et stockés à -80 ° C jusqu'à ce que l'électroporation. Protéines produites commercialement seraient également acceptable pour l'électroporation, car ils ont tendance à être de haute pureté et bien caractérisé.
Les principales étapes de ce protocole inclus enlever complètement le milieu de culture cellulaire par lavage et la suspension de cellules dans un tampon exempt de protéines. Cela garantit que toutes les phénotypes observés sont dus en aval de la protéine exogène d'intérêt et pas aux protéines présentes dans le milieu de culture. Une meilleure efficacité de l'électroporation a été observée quand la densité cellulaire étaitplus élevé (par exemple 6 x 10 6 par rapport à 1 x 10 6 cellules), bien que le meilleur nombre de cellules peut varier avec la taille et le type de cellule. Une autre étape cruciale dans l'expérience était de permettre aux cellules de temps pour récupérer et remettre en place aux plats; cela était nécessaire parce que les cellules adhérentes ont été utilisés dans cette étude. Une période de récupération doit être moins importante pour les cellules en suspension, bien qu'il puisse être nécessaire pour donner des protéines de temps appropriée pour le trafic intracellulaire, les interactions protéine-protéine, ou d'une activité enzymatique, en fonction de la nature de l'étude prévue. Depuis protéines livrées ont été observés dans les cellules pour jusqu'à 96 h, il ya beaucoup de place pour l'ajustement à la période d'incubation avant la microscopie visualisation ou de dosage cellulaire.
Plusieurs variables dans ce protocole peuvent être optimisés pour différents types de cellules, des protéines cibles, ou des systèmes d'analyse en aval. La quantité de protéine à électroporation peut être affiné pour la concentration intracellulaire souhaitée. For visualisation de la localisation des protéines, aussi peu que 1 mg peut être utilisé. Pour les études fonctionnelles, la hausse des montants de départ de protéines peuvent être nécessaires. En outre, la quantité de temps pour la récupération de la cellule post-électroporation peut être court-circuité ou prolongée. Cibles protéiques labiles ou des procédés rapides en aval, il faudrait un temps d'incubation plus court. En outre, la quantité de cellules étalées peut être réglée au-delà des suggestions ici. Les cellules peuvent être ensemencées à faible densité de plus si la protéine introduite doit être contrôlée par microscopie, ou en métal plus dense si la protéine électroporation doit être récupéré pour des applications telles que des transferts de Western.
Alors que l'électroporation est une méthode simple et directe pour introduire des protéines dans des cellules vivantes, il ya certaines limites à la technique. La méthode nécessite protéines très purs en quantités de l'ordre du microgramme. Aussi peu que 1 pg a été électroporé et visualisées par microscopie confocale, mais des montants plus élevés de départ de la protéine a bettER résultats visuels. Bien que fonction de la protéine n'a pas été évaluée à toutes les concentrations après l'électroporation, les concentrations en protéines égale ou supérieure à 50 ug / ml ont été nécessaires pour le signal adéquat pour western blot. En outre, en raison des contraintes de taille des cuvettes d'électroporation, mise à l'échelle peut nécessiter le traitement de plusieurs cuvettes de cellules. Toutefois, compte tenu que le processus d'électroporation ne prend que quelques secondes une fois les cellules sont préparés, traitement parallèle nécessite peu de temps et d'efforts.
Si la protéine introduite doit être visualisée par western blot, microscopie, ou utilisé pour la purification par affinité, la protéine doit avoir une étiquette 35 pour la purification d'affinité ou un anticorps disponible pour la détection. Cependant, pour des raisons inconnues, certaines interactions connues de la littérature ou d'autres méthodes biochimiques (données non présentées) ne ont pas pu être récapitulé après l'électroporation. Il se peut que l'hôte reconnaît certaines protéines électroporation que fÉTRANGERS et rapidement les marque pour dégradation par le protéasome.
Électroporation détient plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes existantes pour la délivrance de protéines. Par rapport à la micro-injection, l'électroporation est beaucoup plus rapide et plus simple, et un grand nombre de cellules peut être traité à la fois avec près de 100 pour cent viabilité pour les conditions testées. L'électroporation est aussi moins cher que les protéines transfection avec des réactifs disponibles dans le commerce. transfections d'ADN sont souvent utilisés pour étudier des protéines effectrices bactériennes dans des cellules hôtes; Toutefois, cela entraîne des protéines bactériennes à synthétiser non idéalement par l'hôte. D'autre part, l'électroporation de protéines bactériennes supprime la dépendance à l'égard machinerie d'expression de protéine de mammifère, ce qui permet une meilleure représentation du processus infectieux où les protéines effectrices sont exprimés par les bactéries.
Plusieurs applications peuvent utiliser les protéines électroporation comme une méthode dans l'étude de intera bactérienne hôtections. Tout d'abord, des cellules primaires qui sont souvent difficiles à transfecter peuvent être plus sensibles à l'électroporation pour la délivrance de protéines. Cela permettra l'étude de la fonction effectrice dans des types cellulaires pertinents biologiquement plus. L'électroporation donne également la possibilité de protéines et / ou des traitements de multiplexage. Par exemple, plusieurs protéines peuvent être introduits simultanément ou médicaments et d'autres petites molécules peuvent être livrés aux côtés de protéines. Le plus important pour obtenir une compréhension fonctionnelle de l'effet des protéines introduites, protéine électroporation peut être couplé à des essais pour la fonction des protéines et des interactions, tels que la purification par affinité, des transferts Western contre des cibles connues, l'analyse d'expression de cellule entière, et la microscopie à déterminer subcellulaire la localisation de la protéine introduite. Par conséquent, cette méthode a un grand potentiel comme outil pour élucider la biologie bactérienne pathogène aux côtés d'autres techniques de biologie cellulaire et moléculaire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ne ont rien à divulguer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Cellgro | 25-050-Cl | |
| 0.4 cm Gap-disposable electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2088 | |
| 100% Methanol | Any | N/A | Flammable, Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter | Beckman Coulter | Model Z1 | |
| Cell Culture Incubator | Any | N/A | Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C |
| Cell Culture Plastic | Any | N/A | Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman |
| Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013 | Warm to 37 °C |
| Electroporator | Bio-Rad | E. coli Pulser | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-016-CV | |
| Fluorescent confocal microscope | Ziess | Model LSM 710 | |
| Glass Bottom Dishes for Microscopy | Wilco Wells | HBSt-3522 | |
| HALT Protease Inhibitor Cocktail | Pierce | 78430 | Corrosive, Toxic |
| HeLa Cell Line | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| LDS 4X Loading Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Cellgro | 10-010 | Warm to 37 °C |
| Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent | Any | N/A | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-Cl | |
| RAW 264.7 Cell line | ATCC | TIB-71 | |
| Primary Antibody Against Target of Interest | Any | N/A | |
| Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore | Any | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Chill to 4 °C |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Warm to 37 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptavidin Agarose Resin Suspension | Pierce | 20353 | |
| Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) | Any | N/A | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | 646547 | Corrosive, Toxic |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8585 | Irritant, Toxic |
References
- Mota, L. J., Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).
- Galan, J. E., Collmer, A. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science. 284, 1322-1328 (1999).
- Hueck, C. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).
- Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. Assembly and function of type III secretory systems. Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).
- He, S. Y. Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).
- Dean, P. Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection. FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).
- Espinosa, A., Alfano, J. R. Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity. Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).
- Orchard, R. C., Alto, N. M. Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens. Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).
- Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74 (2013).
- Sreelatha, A., et al. Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).
- McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).
- Lafon, M., Lafage, M. Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus. The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).
- Kriegler, M. P., Livingston, D. M. Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells). Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).
- Nossa, C. W., et al. Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).
- Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells. Mutation Research. 225, 49-53 (1989).
- Cortes, F., Ortiz, T. Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells. International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).
- Cortes, F., Ortiz, T. Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments. Mutation Research. 246, 221-226 (1991).
- Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method. Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).
- Lewis, R. Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery. Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).
- Kotzamanis, G., et al. CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).
- Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake. Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).
- Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).
- Prasanna, G. L., Panda, T. Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology. Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).
- Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A.
- Weaver, J. C. Electroporation theory. Concepts and mechanisms. Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).
- McAteer, J. A., Douglas, W. H.
- Ho, T. D., et al. Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).
- Niemann, G. S., et al. Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants. Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).
- Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).
- Haraga, A., Miller, S. I. A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1. Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images. Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino ... [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).
- Kimple, M. E., Sondek, J., et al. Overview of affinity tags for protein purification. Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).
