Abstract
Studien av proteininteraktioner i samband med levande celler kan generera kritisk information om lokalisering, dynamik, och som interagerar partner. Denna information är särskilt värdefullt i samband med värd-patogen interaktioner. Många patogena proteiner fungerar i värdceller i en mängd olika sätt, såsom, vilket möjliggör undvikande av värdimmunsystemet och överlevnad inom den intracellulära miljön. För att studera dessa patogen-protein värd-cell interaktioner, finns flera metoder som vanligen används, inklusive: in vivo infektion med en stam som uttrycker en taggad eller mutant protein, eller införande av patogena gener via transfektion eller transduktion. Var och en av dessa metoder har sina fördelar och nackdelar. Vi sökte ett sätt att direkt införa exogena proteiner i celler. Elektroporering används ofta för att introducera nukleinsyror in i celler, men har mer sällan tillämpas på proteiner fastän den biofysiska grunden är exakt densamma.En standard elektroporator användes för att införa affinitetsmärkt bakteriella effektorer i däggdjursceller. Mänskliga epitelceller och mus makrofagceller odlades med traditionella metoder, fristående, och placeras i 0,4 cm gap elektroporation kyvetter med en exogen bakteriell patogen protein av intresse (t.ex. Salmonella Typhimurium GtgE). Efter elektroporering (0,3 kV) och en kort (4 tim) återhämtningsperiod, var intracellulärt protein verifieras av fluorescerande märkning proteinet via dess affinitet tagg och undersöka rumsliga och tidsmässiga fördelningen av konfokalmikroskopi. Den electroporated proteinet visade sig också vara funktionella inuti cellen och har förmåga att korrekt subcellulär trafficking och protein-proteininteraktion. Medan de exogena proteinerna tenderade att ansamlas på ytan av cellerna, electroporated proven hade stora ökningar i intracellulärt effektor koncentration i förhållande till inkubering ensam. Protokollet är enkelt och tillräckligt snabb för att göras i aparallel mode, vilket möjliggör hög genomströmning karakterisering av patogena proteiner i värdceller inklusive subcellulär inriktning och funktion virulensproteiner.
Introduction
Många Gram-negativa bakterier använder specialiserade sekretionssystem för att injicera virulens relaterade proteiner (kallas effektorer) direkt i värdceller 1-5. Dessa effekten har ett brett utbud av biologiska funktioner inklusive: undertryckande av värdimmunitet, cytoskelettala förändringar, modifiering av intracellulär människohandel och signalering, transkriptions förändringar, och värd proteasom förändringar 6-9. Funktionen för vissa effektorer är kända, dock värd mål och biokemisk verkan (er) av många andra återstår att bestämmas. Medan jämföra vildtyp och rekombinanta bakteriella infektioner är en giltig metod för att studera intracellulära effektor virulensegenskaper mekanismer, är det ofta fördelaktigt att införa en individuell effektor i värdcellen. Således är det mycket önskvärt enkla metoder för att införa och karaktärisera bakteriella effektor-proteiner i samband med värdceller.
Förenkla experimentell analys with en enda effektor är kritisk som andra effektorer kan ha motsatta eller redundanta funktioner. För att åstadkomma denna förenkling, har forskare tidigare införda makromolekyler i celler genom många olika metoder, bland annat viral transduktion 10, mikroinjektion 11, skrapa laddar 12,13, cellfusion med kemiskt inducerad mikroinjektion 14, proprietär protein "transfektion" reagens 15, kalciumfosfat utfällningar 16, och elektroporering 17-20. De införda molekyler sträcker sig från nukleinsyror inkluderande DNA, RNA, & RNAi art till proteiner, celltäta färgämnen och antikroppar för intracellulära mål 21,22. Vissa metoder har begränsningar, inklusive den typ av makromolekyl som kan införas, och särskilt nedströms analyser kan vara begränsad på grund av hög cellulär toxicitet, skadliga verkningsmekanismer, låg effekt, eller introduktion effektivitet. Transfektion, en Often-använd metod för att uttrycka bakteriella gener i däggdjursceller, även lider begränsningen att vissa relevanta värdcelltyper, såsom makrofager och primärceller, är särskilt motståndskraftiga mot transfektion. Bortom detta är det svårt att kontrollera nivåerna av bakteriellt protein som produceras vid införande av främmande DNA.
Mycket arbete har etablerat elektroporering av nukleinsyror i både bakterie- och däggdjursceller som en gemensam laboratorieteknik; Det finns dock pågående forskning de bästa metoderna för administration av proteiner i celler under fysiologiska betingelser. Rapporter om protein transfektion är lovande, men kräver dyra reagens och optimering. Önskan att införa potentiellt toxiska bakteriella effektorer i en mängd olika mål cell med minimal kostnad ledde oss att betrakta elektroporation som en metod för att studera dessa proteiner in vivo.
Protein elektroporation 23-25 är en method att införa proteiner i levande celler via electropermeabilization, även känd som elektro transfektion eller elektro injektion 26. Denna teknik använder högintensiva elektriska pulser för att skapa porer i cellmembran. Dessa reversibla porer tillåter makromolekyler som normalt är undantagna från intracellulära utrymme att komma in i cellen. Vid avlägsnande av det yttre elektriska fältet, kan membranet återförslut, vilket gör att cellen bibehåller molekyler som passerade genom porerna 27,28.
En standard elektroporator användes i denna studie för att konsekvent införa bakteriella effektorer in i båda mus makrofag-liknande celler och humana epitelceller. Metoden är snabb, effektiv och billig, utan någon märkbar minskning i cellulär viabilitet. De införda proteiner kan visualiseras via immunofluorescensmikroskopi eller användas för funktionella analyser. Detta har demonstrerats med användning av grönt fluorescerande protein (GFP) som en icke-toxisk standarden, såväl somtvå Salmonella effektorproteiner, SspH1 och GtgE. Vi föreslår protein elektroporering som ytterligare ett verktyg i repertoaren för studier av bakterie virulensproteiner och deras funktioner i eukaryota värdceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered i förväg
- Varm steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till 37 ° C.
- Varm Dulbeccos Modifikation av Eagles medium (DMEM) och minimalt essentiellt medium (MEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 lU / ml penicillin och 100 pg / ml streptomycin till 37 ° C. OBS: Dessa representerar Normal Growth Media (NGM) för RAW och HeLa-celler respektive.
2. Beredning av celler
- Väx RAW 264.7-celler till 70-90% konfluens i NGM.
- Behåll cellerna vid 37 ° C i en fuktad 95% luft / 5% CO 2 atmosfär.
- Väx HeLa-celler till 70-90% konfluens i NGM.
- Behåll cellerna vid 37 ° C i en fuktad 95% luft / 5% CO 2 atmosfär.
- Innan samling, tvätta cellmonolager gång med steril PBS.
- Samla pre-sammanflytande celler i ett sterilt koniskt rör.
- Försiktigt skrapa RAW cellermed en gummiskrapa i PBS, med upprepad pipettering för att dispergera cell aggregeringar.
- Lossa HeLa-celler med 0,25% trypsin lösning tills visuell undersökning visar dissociation från odlingsytan. Använd till exempel 2 till 3 ml för en T-75-kolv. Justera volymen följaktligen att säkerställa trypsinlösning täcker hela tillväxtytan.
- Släck dissociationsreaktionen med NGM innehållande 10% FBS.
- Använd minst två gånger volymen av NGM till trypsin, med upprepad pipettering att skingra cell aggregeringar.
- Lätt Pelletera celler genom centrifugering vid 900 xg under 4 minuter.
- Resuspendera i samma volym som trypsin / släckningslösning med användning av steril PBS.
- Räkna celler med användning av hemocytometer eller partikelräknare.
- Lätt Pelletera celler genom centrifugering vid 900 xg under 4 minuter.
- Resuspendera i tillräcklig volym PBS för 5,5 x 10 6-6,0 x 10 6 celler / ml. Anmärkning: Till exempel kommer en T-75 kolv erhållande approximbart 7.5 x 10 6 celler 29.
- Håll cellsuspensionen på is tills elektroporering.
3. Förberedelse för elektroporation
- Pre-chill elektroporation kyvetter (0,4 cm gap) på is.
- Slå på elektroapparater och ställ in spänningen till 0,3 kV.
OBS: Kapacitans och motstånd inte var justerbara inställningar på vår elektroporator (inställd på 10 uF och 600 Ω av tillverkaren). - Fyll återställnings plattor med NGM och jämvikta i fuktad 95% luft / 5% CO2 atmosfär vid 37 ° C.
4. Elektroporation
- Placera 400 pl av cellsuspensionen i förväg kyld kyvett och tillsätt 20 | ig av valda proteinet till kyvetten (50 pg / ml).
- Flick kyvett försiktigt ~ 10 gånger för att blanda utan att skada cellerna. Obs: Kuvetten kan även inverteras flera gånger för att blanda väl, men inte pipettera upp och ned eller vortex för att undvika att skada cellerna.
- Electroporate prov vid 0,3 kV för 1,5-1,7 ms. Obs: Detta var typiskt för denna studie.
- Omedelbart efter elektroporering flick kyvett försiktigt ~ 10 gånger för att blanda väl.
5. Plätering av celler
- Store kyvett med elektroporerade celler på is tills att placera i återhämtningsplattor.
- För de flesta nedströms analyser, tvätta cellerna 1x med förvärmda NGM att avlägsna främmande effektorprotein.
- Ta bort celler för analys och suspendera i 3-5 ml NGM.
- Pelletera celler genom centrifugering vid 900 xg under 4 minuter.
- Resuspendera i tillräcklig volym av NGM för önskad plattstorlek (t.ex. 2 ml för 35 mm skål).
- Ta lämplig mängd celler för nedströms analys.
- Exempel 1: plattan i glas botten rätter för mikroskopi analys.
- Exempel 2: platta into cellodlings plast för proteinanalys, såsom affinitets reningar.
- Låt cellerna att återhämta sig i ekvilibrerad plattor i fuktad 95% luft / 5% CO2 atmosfär vid 37 ° C under minst 4 timmar.
6. Mikroskopi Analys
6.1) Fixering / immunofluorescensfärgning
- Tvätta cellerna 1x med steril PBS efter 4 tim återhämtningsperiod.
- Fix celler i 100% metanol under 2 min vid rumstemperatur. Använd tillräckligt med metanol för att helt täcka celler (t.ex. 2 ml för 35 mm skål).
- Tvätta 3x med steril PBS.
- Permeabilisera celler med 0,4% Triton X-100 i PBS under 15 min. Använd till exempel 1 ml till en platta 35 mm diameter.
- Justera längd permeabilisering och styrka av Triton X-100 enligt epitop och lokalisering av målproteinet. Obs: Bästa resultat måste empiriskt bestämmas för varje mål, men ovanstående villkor bör vara tillräckligt för de flesta cytosolic mål.
- Blockera med 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS under 1 h vid RT. Använd till exempel 1 ml till en platta 35 mm diameter.
- Tvätta 3x med PBS.
- Inkubera primära antikroppen i antikroppsbindningslösning (0,1% Triton X-100 och 1% BSA i PBS) över natten vid 4 ° C med försiktig skakning. Använd till exempel 0,5 ml till en platta 35 mm diameter.
- Följ tillverkarens rekommendationer för späd antikropp. Anmärkning: Till exempel var den streptavidin-bindande peptidmärkningen (SBP-taggen) antikropp som användes vid 1: 1000 spädning, medan PKN1 antikropp användes vid 1: 200 utspädning.
- Tvätta 4x med PBS.
- Inkubera med lämplig fluorescent konjugerad sekundär antikropp i antikroppbindningslösning under 1 h vid rumstemperatur, skyddad från ljus.
- Använd till exempel Alexa 488 eller Alexa 647 under 1 timme i rumstemperatur.
- Följ tillverkarens rekommendationer för myraibody utspädning. (T.ex. ca 1: 1000 för denna studie).
- Lägg till andra fläckar som behövs, till exempel 5 iM Vetegroddar agglutinnin (WGA) konjugerat till Alexa 647 eller DAPI enligt tillverkarens rekommendation, under 1 timme i rumstemperatur.
- Använd till exempel Alexa 488 eller Alexa 647 under 1 timme i rumstemperatur.
- Tvätta 5x med PBS och förvara vid 4 ° C, skyddas mot ljus tills den ska bilden.
6.2) konfokalmikroskopi och bildanalys
- Bild prover på ett inverterat konfokalmikroskop med hjälp av en 63x oljeimmersionsobjektiv.
- Bild grön kanal med 488nm linje en argon laser, med emissions bandbredd mellan 492-542 nm.
- Bild röda kanalen med hjälp av en 633 nm diodlaser, med emissions bandbredd mellan 640-718 nm.
- Bild blå kanalen med hjälp av en 405 nm diodlaser, med emissions bandbredd mellan 407-453 nm.
- Se till multipelkanal z-stackar täcker helheten av den cellulära volym.
- Process bilder med lämplig bildbehandlingsprogram.
7. Affinitetsrening
- Tvätta elektroporerade celler två gånger med 4 ° C PBS efter 4 h återhämtningsperiod.
- Lyse med ~ 1,0 ml lysbuffert (1% Triton X-100 med proteasinhibitorcocktail och fosfatasinhibitor i PBS) på is. Använd hämmare enligt tillverkarens anvisningar. Obs: Till exempel, både de fosfatas och proteashämmare som används i denna studie tillfördes med 100x, men andra formuleringar borde fungera lika bra.
- Genast skrapa celler med gummiskrapa och samla in koniska rör.
- Lyse genom kraftig skakning och ultraljudsbehandling. Obs: Andra lys metoder kan fungera lika bra, men effektiviteten måste empiriskt bestämmas så att lämpligheten analyskrav.
- Sonikera 3 x 30 sek med intermittent virvling.
- Centrifugera vid 10000 xg under 10 min vid 4 ° C för att samla incellrester och olösliga aggregat; spara supernatanten.
- Kombinera lika volymer (~ 1,0 ml) av electroporated cellysatet med 50 pl av Streptavidin agarosharts suspensionen vid 4 ° C över natten med ände-över-ände rotation. Obs: Detta harts fångar electroporated protein (och tillhörande komplex) via sin streptavidin bindande peptidaffinitetsmärkning.
- Centrifugera vid 2500 xg under 2 minuter och kassera supernatanten.
- Tvätta två gånger med 40 bäddvolymer (~ 1 ml) PBS.
- Lägg 30 pl 4x LDS laddningsbuffert (141 mM Tris-bas, 2% LDS, 10% glycerol, 0,51 mM EDTA, 0,22 mM SERVA Blue G, 0,175 mM fenolrött, pH 8,5), 20 | il DIH 2 O och 1 | il 0,5 M tris (2-karboxietyl) fosfin (TCEP), medge en viss volym för att förbli i pärlor.
- Värm vid 95 ° C under 10 minuter och kyl på is.
- Spin> 10.000 xg vid 4 ° C under 5 min.
- Samla supernatanten.
- Utför en western blot med hjälp av lämpliga antikroppar Notera: Hanre, är anti-PKN1 primär antikropp används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som en första proof of concept, renades grönt fluorescerande protein framgångsrikt införts i däggdjursceller med hjälp av elektroporering. GFP, en ungefärlig 27 kD en molekylvikt protein brukar introduceras i däggdjursceller (normalt uttrycks från plasmid-DNA) som en molekylärbiologi verktyg utan signifikant cellulär toxicitet. HeLa-celler inkuberades (Figur 1A) eller elektroporeras (Figur 1B) med 25 | ig / ml GFP, följt av immunofluorescens konfokalmikroskopi att kontrollera för fluorescerande GFP-signal. För att visa att GFP var inuti den cellulära cytosolen cellerna också färgas med vetegroddagglutinin (WGA) för att avgränsa det cytosoliska gräns (röd) samt en nukleinsyra fläck, DAPI (blå) för att indikera kärnan. Intracellulär GFP signal observerades endast vid elektroporering, medan ingen intracellulärt protein observerades i celler inkuberade med GFP. Liknande resultat observerades med RAW264.7 musmakrofag-liknande celler (figur 1C och 1D). Observera att WGA är ett lektin som företrädesvis binder till rester i plasmamembranet och därmed kan uppvisa punktformig färgning baserad på hur lång inkubationstiden. Jämför figur 1A och figur 2A, där Figur 2A inkuberades under en längre varaktighet än Figur 1A.
Elektroporation utvidgades sedan till ett taggat, renat Salmonella effektor, GtgE. GtgE, en känd virulensfaktor 30, upptäcktes av vår grupp som ska utsöndras i värdceller 31, och har nyligen visat sig vara ett cystein proteas 32. HeLa-celler inkuberades eller elektroporeras med 50 | ig / ml GtgE. För immunofluorescensanalys cellerna färgas med en antikropp mot streptavidin bindande peptidaffinitetsmärkningen på GtgE. Cellerna färgades också med WGA och DAPI. I inkuberade HeLa-celler (Figure 2A), finns det ingen intracellulär GtgE som visualiseras genom en brist på grönt fluorescerande foci. Däremot elektroporerade HeLa-celler (figur 2B) visar signifikant fluorescerande intracellulär signal indikerande effektorprotein hade trätt cellerna på grund av elektroporation processen. RAW celler visade en något ökad benägenhet att ackumulera protein på cellytan under inkubation (Figur 2C), men intracellulär signal sågs endast vid elektroporering (figur 2D).
Fastställande av detektionsgränser för att visualisera sub-cellulär lokalisering via konfokalmikroskopi var viktigt att se tillräckligt med protein in i cellen, och samtidigt undvika överbelastning cellen med potentiellt giftiga bakteriella effektorer. I fig 3, var GtgE elektroporerades in RAW makrofagliknande celler vid 2,5, 25, och 50 | ig / ml. Cellerna fixeras och färgas med en antikropp mot taggen på GtgE. Ondast ett mycket litet antal härdar observerades vid 2,5 mikrogram / ml GtgE (Figur 3A), med ökat antal härdar uppenbar vid 25 ug / ml, (Figur 3B), men det största antalet distinkta härdar sågs vid maximal protein testade koncentrationen 50 | ig / ml (Figur 3C). Liknande färgningsmönster observerades mellan proverna indikerar på dessa proteinkoncentrationer intracellulärt protein kan lätt kontrolleras av konfokalmikroskopi. Proteinkoncentrationer över 50 | ig / ml testades inte eftersom som koncentrationen av protein ökade, så gjorde benägenheten för målproteinet för att bli adsorberad på ytan av cellerna. För att undvika dessa aggregat av membran associerat protein, blev det nödvändigt att samla två elektroporation kyvetter att få tillräckligt med värd samverkande protein för att visualisera på en western blöt (Figur 6, längst till höger körfält).
För att ytterligare visa att introducerad protein inte bara adsorberas till ytan av cellen, var konsekutiva optiska sektioner avbildad vid fokalplan vart 0,35-0,43 mikrometer (Z-stackar) med användning av konfokalmikroskopi. RAW celler elektro med 50 mikrogram / ml GtgE och färgas enligt ovan (Figur 4, A och B). De Z-stackar visade att GtgE verkligen var intracellulära och de foci sträcker sig från botten (figur 4A, planet 6 av 36) till toppen av cellen (Figur 4B, plan 26 av 36). Liknande resultat erhölls för samtliga elektroporerade proteiner. Den inneboende fluorescerande profil kontrollcellpopulationer med och utan effektorprotein eller elektroporering undersöktes av fluorescerande konfokalmikroskopi, och befanns vara försumbar.
Dessutom var den elektro proteinet undersöktes för att se om det var riktat till nedbrytning via endocytiska vägar. Celler färgades för Ras-relaterade protein 5A (Rab5), enmarkör för tidiga endosomer (Figur 4C) eller lysosom-associerat membranprotein 1 (Lamp1), en markör för sena endosomer och lysosomer (Figur 4D). Samlokalisering mellan electroporated proteinet och dessa cellulära markörer skulle indikera en nära fysisk interaktion mellan dem (dvs. att electroporated proteinet var inne i endosomer / lysosomer). Konfokalmikroskopi visade att electroporated protein (GFP eller GtgE) inte samar lokalisera med LAMP1 eller Rab5. Det var slutsatsen av detta att introduceras protein inte direkt endocyteras i cellerna eller riktade till endocytotisk väg inom fyra timmars behandling.
Exogent protein introduktion kan ha cellulära effekter under loppet av några timmar eller dagar, och därför är det ofta fördelaktigt att undersöka ihållande införda proteiner. För att avgöra hur länge en elektro protein skulle kvarstå utan nedbrytning efter elektroporering. Baserat on visualisering av kvarstad och cellspridning, var 4 timmar bestämdes till den ungefärliga minimi återhämtningstid för elektroporerade celler. För att temporärt observera protein uthållighet ett tidsförlopp experiment utfördes, färgning cellerna 4, 24 eller 96 timmar efter elektroporering. Efter 4 h (figur 5A), när cellmorfologi föreslog återhämtning, det fanns en avsevärd mängd av intracellulärt protein. Efter 24 timmar (Figur 5B), fanns det fortfarande betydande elektro protein inuti cellerna. Även när tiden efter elektroporering förlängdes till 96 timmar före fixering och färgning (Figur 5C) fanns det observer foci om än i minskad skenbar överflöd, visar protein persistens dagar efter initial behandling.
Två viktiga förbehåll noterades under dessa experiment. RAW celler uppvisade en större tendens än HeLa-celler ansamlas exogena proteiner på cellytan irretiv av inkubation (Figur 6A) eller elektroporering (figur 6B). Trots detta hade alla elektroporerade prover ökad intern protein (figurerna 1, 2, 5B). Dessutom försvann den membranassocierade proteinet över tid. En andra varning var en liten population av celler som uppvisar en fenotyp som består av mindre, rundade celler laddade med höga mängder av exogena proteiner i både kontroll (inkuberas) och behandlade (elektroporerade) celler (Figur 6 C och D, inkubation prover visade). Kärnorna i dessa celler visade kondenserat kromatin baserad på DAPI-färgning, och fyllde hela den cellulära volym, tyder på apoptos. Det är därför möjligt att apoptotiska celler (som uppstår som en normal del av cellcykeln eller på grund av skörd / behandling) har en benägenhet att absorbera protein från bufferten.
För att visa att elektroporerade proteiner var funktionella och kunde lokalisera motsvactly inuti värdcellen, samlokalisering och protein-proteininteraktion mellan Salmonella effektorprotein SspH1 och dess kända värdmålet, proteinkinas N1 (PKN1) 33 visades. Efter elektroporering, var den fysiska interaktionen mellan SspH1 och PKN1 kontrolleras av en affinitet baserad immunoprecipitation följt av western blot (Figur 7A). Samlokalisering observerades också av konfokalmikroskopi, vilket indikerar fluoroforema är tillräckligt nära rumsligt att överlappa 34. Efter elektroporering med 50 | ig / ml SspH1 ades HeLa-celler (figur 7B) fixeras och färgas för SspH1 (grön) och PKN1 (röd). Vid låg lasereffekt distinkt foci (gul) observerades i kärnan indikerar SspH1 och PKN1 var fysiskt tillräckligt nära för att interagera. Denna interaktion har etablerats i litteraturen; men denna studie är den första som visar samlokalisering i kärnan.
= "Always"> 
Figur 1: Elektroporation av GFP - HeLa eller RAW 264.7-celler inkuberades cellerna eller elektroporerade med 25 | ig / ml renat grönt fluorescerande protein (GFP) och färgades med anti-GFP-antikropp (grönt), DAPI, en nukleär specifik sond (blått. ), och WGA (Röd) för att avgränsa det cytosoliska gränsen. Ruvade (A) HeLa-celler visar en avsaknad av grön fluorescens indikerar en brist på internalisering av GFP. (B) visar ett representativt mikrofotografi av electroporated GFP. Notera utseendet på intracellulär härdar indikerar GFP hade kommit in i cellerna. (C) och (D) är representativa bilder av RAW-celler inkuberade (C) eller elektro (D) med 25 ug / ml renat grönt fluorescerande protein.
es / ftp_upload / 52296 / 52296fig2highres.jpg "/>
Figur 2:. Elektroporation av Salmonella effektor GtgE - HeLa-celler Celler inkuberades (A) eller elektroporeras (B) med 50 ng / ml av en affinitet taggade Salmonella effektor, GtgE, och färgades med en anti-effektor tag-antikropp (grönt), DAPI, en nukleär mask (Blå) och WGA (Röd) för att avgränsa det cytosoliska gränsen. I (A), inkuberade HeLa-celler visar en avsaknad av grön fluorescens indikerar en brist på internalisering av GtgE. (B) visar ett representativt mikrofotografi av elektro GtgE, visar intracellulära elektro effektorprotein. (C) och (D) är representativa bilder av RAW celler som antingen hade inkuberats eller electroporated, respektive, på samma sätt med 50 ^ g / ml Salmonella GtgE. Ljusblå är kombinationen, eller overlay, av röd fluorescens från WGA ochgrön fluorescens från den sekundära antikroppen.
Figur 3: Titrering av electroporated protein - RAW makrofagliknande celler Celler elektroporerades med 2,5 | ig / ml (A), 25 | ig / ml (B) eller 50 | ig / ml (C) Salmonella effektor GtgE och fick återhämta sig efter. 4 tim. Cellerna fixerades och färgades med en anti-SBP-tag-antikropp (grönt) och kärnorna masken, DAPI (blå). Det är möjligt att visualisera fluorescerande foci, indikativt för intracellulär GtgE vid 2,5 | ig / ml via konfokal microcopy, fastän bättre resultat erhölls när högre start mängd protein användes. Tillfredsställande resultat (inklusive intracellulärt protein lätt observeras av konfokalmikroskopi utan alltför membran tillhörande aggregat) erhölls vid 50 ug / ml för GtgE och därmed no större koncentrationer testades.
Figur 4:. Protein interna och brist på samlokalisering med endosom markörer varandra följande optiska skivor (z-stackar) som erhållits genom konfokalmikroskopi att visualisera om electroporated proteinet var internt. RAW celler elektro med 50 mikrogram / ml GtgE. (A) visar optisk skiva 6 av 36, z-stack (2.1 mikrometer) ovanför botten av skålen. (B) visar samma synfält men skiva 26 av 36. De intracellulära foci sträcker sig genom cellen indikerar att proteinet verkligen är intracellulär och inte aggregeras på ytan av cellen. Ljusblå är kombinationen av rött WGA, grön sekundär antikropp, och blått DAPI. Samlokalisering analys med markörer för endosomer / lysosomer, Rab5, (C) eller en lysosom markör, LAMP1 
Figur 5: Protein uthållighet efter elektroporering Confocal mikrofotografi som visar ihållande electroporated GtgE över tiden.. 50 | ig / ml GtgE elektroporerades in i HeLa-celler. Cellerna fixerades sedan och färgades med en anti-SBP-tag-antikropp (grönt) och kärnorna masken, DAPI (blå). 4 h (A) var fast besluten att vara den minsta tid för att låta cellerna att återhämta sig och som förväntat visar maximal intracellulärt protein. Efter 24 h (B) och 96 h (C), grön foci, både intracellulär och på cellular yta, show effektor persistens indikerar att proteinet inte är degraderade dagar efter den inledande behandlingen. Den ljusblå färg i den här bilden är överlagring av blå DAPI och den gröna antikroppsfärgning. 
Figur 6:. Cellyteprotein aggregering och en elektroporation fenotyp RAW makrofagliknande celler antingen inkuberades (A) eller elektroporeras (B) med 50 | ig / ml GtgE och färgades med anti-SBP-tag-antikropp (grönt), WGA (Röd ), och med DAPI (blå). Både RAW 264.7 och i mindre grad HeLa-celler, tenderade att aggregera effektor på ytan av cellen; alla elektroporerade celler visade sig ha ökat internt protein (HeLa visas ej). Gult är en överlagring av rött från WGA och grönt från målprotein. RAW (C) och HeLa (D) celler showing en förändrad fenotyp efter inkubation med GtgE (visas). Flera experiment visade en fenotyp som består av mindre celler med differentiell DAPI färgning och en förlust av cytoplasma. Ljusblå är overlay från röda WGA, grön sekundär antikropp, och blått DAPI. Konfokal mikroskopi användes för att visa målproteinet ackumulera i kärnan. Eftersom denna fenotyp av exogena proteinladdade celler dök efter både inkubation och elektroporering kan man hypotes denna fenotyp att tyda på apoptos. 
Figur 7:. Värdproteininteraktioner med electroporated Salmonella SspH1 - HeLa-celler Celler electroporated vid de angivna koncentrationerna med SspH1, tilläts återhämta sig under fyra h före utförande av en modifierad affinitetsrening följd av Western blöt (A) för att anrika för ochupptäcka kända eukaryota samverkande partner: serin / treonin proteinkinas N1 (PKN1). Observera att längst till höger körfält (2x EP) omfattar 2 poolade kyvetter, eftersom signalen från en kyvett blandas i bakgrunden, men PKN1 fortfarande berikad ovanför avsaknaden av bindning ses i no-bete kontroll. Western blöt kördes med nativt HeLa-lysat, renat SspH1, och affinitetsrening proverna innan de sonderades med en monoklonal antikropp mot PKN1. Måldetektering erhölls via en pepparrotsperoxidas konjugerad sekundär antikropp med reaktivitet mot isotypen av den primära antikroppen. HeLa-celler (B) som visar sam-lokalisering (gul) mellan PKN1 (röd) och SspH1 (grön) via genom konfokal mikroskopi efter elektroporering med 50 | ig / ml SspH1. Denna optiska överlappning indikerar att effektorn och värdproteinet är tillräckligt nära för att interagera fysiskt. Det faktum att interaktionen visades i kärnan för första gången, erbjuder ytterligare stöd somproteinet korrekt trafikerade av värden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utsöndrade effekten från patogena bakterier har utvecklats för att fungera i värdcellen miljön och därför är det bra att studera dem på plats i värden. Införande av specifika effektorer av intresse i värdceller möjliggör relevanta patogen-värd interaktioner studeras isolerat utan inblandning från andra bakteriella proteiner. Målet var att undersöka elektroporering som ett sätt att introducera bakteriella effektorproteiner i eukaryota värdceller och därmed undvika en del av de utmaningar som är förknippade med transfektion eller transduktion. Grönt fluorescerande protein användes som en kontroll och Salmonella effektorproteiner testades. På grund av intresset för bakteriella patogener som målvärd epitelceller liksom immunceller, en human epitelial-liknande cellinje (HeLa) och mus makrofagliknande celler (RAW 264.7) används. Elektroporation kan leverera exogena proteiner i värdceller utan märkbar minskning i cell viabiliTy, och de levererade proteinerna var detekterbart i celler i upp till fyra dagar.
För att isolera effekterna av elektro protein, är rent protein krävs. I denna studie överfördes proteiner uttrycktes i E. coli-stam BL21 med N-terminal polyhistidin och streptavidin bindande-peptid taggar. Proteiner renades med Ni-NTA-harts, analyserades för koncentration (i allmänhet mellan 5-25 mg / ml) och renhet, och lagrades vid -80 ° C tills elektroporering. Kommersiellt producerade proteiner skulle också vara acceptabelt för elektroporering, eftersom de tenderar att ha hög renhet och väl karakteriserade.
Viktiga steg i detta protokoll ingår helt ta bort cellodlingsmediet genom tvättning och suspendera celler i proteinfritt buffert. Detta säkerställer att eventuella nedströms fenotyper som observerats beror på det exogena proteinet av intresse och inte till proteiner som är närvarande i odlingsmediet. Bättre effektivitet elektroporering observerades när celltätheten varhögre (t.ex. 6 x 10 6 vs. 1 x 10 6 celler), även om den bästa mobilnummer kommer att variera med cellstorlek och typ. En annan avgörande steg i experimentet var att låta cellerna tid att återhämta sig och återansluta till rätter; detta var nödvändigt eftersom vidhäftande celler användes i denna studie. En återhämtningsperiod bör vara mindre viktigt för suspensionsceller, även om det kan bli nödvändigt att ge proteiner tid för ordentlig intracellulära människohandel, protein-proteininteraktioner, eller enzymatisk aktivitet, beroende på vilken typ av planerade studien. Eftersom levererade proteiner observerades inne cellerna i upp till 96 timmar, det finns mycket utrymme för anpassning till inkubationstiden före mikroskopi visualisering eller cellulär analys.
Flera variabler i detta protokoll kan optimeras för olika celltyper, protein mål, eller nedströms system analys. Mängden protein som ska elektroporeras kan finjusteras för den önskade intracellulära koncentrationen. For visualisering av protein lokalisering, kan så lite som 1 ug användas. För funktionella studier, kan högre utgångs mängder av proteiner behövas. Dessutom kan den tid för efter elektroporation cellutvinning kortslutas eller utvidgas. Labilt protein mål eller snabba nedströmsprocesser skulle kräva en kortare inkubationstid. Dessutom kan den mängd celler utstrukna justeras bortom förslag här. Celler kan pläterade glesare om introducerade proteinet skall övervakas av mikroskopi, eller klädd tätare om electroporated proteinet skall återvinnas för applikationer såsom Western blotting.
Medan elektroporering är en enkel och okomplicerad metod för att införa proteiner in i levande celler, finns det vissa begränsningar för tekniken. Metoden kräver mycket rena proteiner i mikrogrammängder. Så lite som 1 ug var electroporated och visualiseras med konfokalmikroskopi, men högre utgångs mängder protein gav better visuella resultat. Även proteinfunktionen inte bedömdes vid alla koncentrationer efter elektroporering, var protein koncentrationer som är lika med eller större än 50 mikrogram / ml krävs för tillräcklig signal för western blot. Också, på grund av de storleksbegränsningar hos elektroporation kyvetter, uppskalning kan kräva behandling av flera kyvetter av celler. Men med tanke på att den elektro tar bara några sekunder när cellerna är beredda, kräver lite extra tid och ansträngning parallell bearbetning.
Om den införda proteinet skall visualiseras genom western blöt, mikroskopi, eller användas för affinitetsrening, bör proteinet ha en tagg 35 för affinitetsrening eller en tillgänglig antikropp för detektion. Men av okänd anledning, vissa interaktioner är kända från litteraturen eller andra biokemiska metoder (data visas ej) kunde inte vara rekapituleras efter elektroporering. Det kan vara att värden känner igen vissa electroporated proteiner som foreign och snabbt markerar dem för proteasom nedbrytning.
Elektroporation har flera fördelar jämfört med andra befintliga metoder för proteinleverans. Jämfört med mikroinjektion, är elektroporering mycket snabbare och enklare, och ett stort antal celler kan behandlas på en gång med nästan 100 procent livskraft för de testade förhållanden. Elektroporering är också billigare än protein transfektion med kommersiellt tillgängliga reagens. DNA-transfektioner används ofta för att studera bakteriella effektor-proteiner i värdceller; Men orsakar detta bakterieproteiner syntetiseras icke-idealt av värden. Å andra sidan, elektroporation av bakteriella proteiner avlägsnar beroendet däggdjursproteinexpressions maskiner, vilket möjliggör en bättre representation av den infektiösa processen där effektor proteiner uttrycks av bakterierna.
Flera ansökningar kunde använda protein elektroporering som metod i studien av bakteriell-värd Interasfunktione r. Först, kan primära celler som ofta är svåra att transfektera vara mer mottaglig för elektroporering för protein leverans. Detta kommer att möjliggöra studier av effektorfunktion i flera biologiskt relevanta celltyper. Elektroporering ger också möjlighet att multiplexera proteiner och / eller behandlingar. Till exempel kan flera proteiner introduceras samtidigt, eller läkemedel och andra små molekyler kan levereras tillsammans proteiner. Viktigast för att erhålla en funktionell förståelse av effekten av de introducerade proteinerna, protein elektroporering kunde kopplas med analyser för proteinfunktion och interaktioner, såsom affinitetsrening, western blottar mot kända mål, helcells-expressionsanalys, och mikroskopi för att bestämma subcellulär lokalisering av den införda proteinet. Därför har denna metod stor potential som ett verktyg för att belysa bakteriell patogen biologi vid sidan av andra cellulära och molekylärbiologiska tekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Cellgro | 25-050-Cl | |
| 0.4 cm Gap-disposable electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2088 | |
| 100% Methanol | Any | N/A | Flammable, Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter | Beckman Coulter | Model Z1 | |
| Cell Culture Incubator | Any | N/A | Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C |
| Cell Culture Plastic | Any | N/A | Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman |
| Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013 | Warm to 37 °C |
| Electroporator | Bio-Rad | E. coli Pulser | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-016-CV | |
| Fluorescent confocal microscope | Ziess | Model LSM 710 | |
| Glass Bottom Dishes for Microscopy | Wilco Wells | HBSt-3522 | |
| HALT Protease Inhibitor Cocktail | Pierce | 78430 | Corrosive, Toxic |
| HeLa Cell Line | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| LDS 4X Loading Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Cellgro | 10-010 | Warm to 37 °C |
| Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent | Any | N/A | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-Cl | |
| RAW 264.7 Cell line | ATCC | TIB-71 | |
| Primary Antibody Against Target of Interest | Any | N/A | |
| Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore | Any | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Chill to 4 °C |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Warm to 37 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptavidin Agarose Resin Suspension | Pierce | 20353 | |
| Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) | Any | N/A | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | 646547 | Corrosive, Toxic |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8585 | Irritant, Toxic |
References
- Mota, L. J., Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).
- Galan, J. E., Collmer, A. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science. 284, 1322-1328 (1999).
- Hueck, C. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).
- Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. Assembly and function of type III secretory systems. Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).
- He, S. Y. Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).
- Dean, P. Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection. FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).
- Espinosa, A., Alfano, J. R. Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity. Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).
- Orchard, R. C., Alto, N. M. Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens. Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).
- Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74 (2013).
- Sreelatha, A., et al. Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).
- McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).
- Lafon, M., Lafage, M. Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus. The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).
- Kriegler, M. P., Livingston, D. M. Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells). Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).
- Nossa, C. W., et al. Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).
- Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells. Mutation Research. 225, 49-53 (1989).
- Cortes, F., Ortiz, T. Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells. International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).
- Cortes, F., Ortiz, T. Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments. Mutation Research. 246, 221-226 (1991).
- Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method. Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).
- Lewis, R. Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery. Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).
- Kotzamanis, G., et al. CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).
- Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake. Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).
- Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).
- Prasanna, G. L., Panda, T. Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology. Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).
- Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A.
- Weaver, J. C. Electroporation theory. Concepts and mechanisms. Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).
- McAteer, J. A., Douglas, W. H.
- Ho, T. D., et al. Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).
- Niemann, G. S., et al. Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants. Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).
- Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).
- Haraga, A., Miller, S. I. A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1. Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images. Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino ... [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).
- Kimple, M. E., Sondek, J., et al. Overview of affinity tags for protein purification. Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).
