Radial Mobilidade e função citotóxica de Retroviral Replicando Vector transduzidas, Alloresponsive não aderentes Linfócitos T
Summary
We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.
Abstract
Relatamos uma nova adaptação do ensaio de migração celular radial monocamada, relatada pela primeira vez para medir a migração radial das células tumorais aderentes em proteínas de matriz extracelular, para medir a motilidade das células imunitárias fluorescentemente marcado, humano ou não-aderente efectoras de murino. Esta técnica utiliza um colector de aço inoxidável e 10 bem corrediça de Teflon para focalmente depositar as células T não-aderentes preparadas em poços quer com monocamadas confluentes de células de tumor ou proteínas da matriz extracelular. Microscopia de fluorescência de luz e / ou multi-canal é usado para rastrear o movimento eo comportamento das células efetoras ao longo do tempo. Corantes fluorescentes e / ou vectores virais que codificam transgenes fluorescentes são usados para marcar diferencialmente os tipos de células para a imagiologia. Este método é distinta da de tipo semelhante em ensaios in vitro que rastreiam migração horizontal ou vertical / invasão utilizando câmaras de slides, agar ou transwell placas. O ensaio permite que os dados detalhados de imagem para be coletados com diferentes tipos de células que se distinguem por marcadores fluorescentes específicos; mesmo subpopulações específicas de células (isto é, transduzidas / nontransduced) pode ser monitorizado. Superfície parcelas intensidade de fluorescência são gerados usando canais de fluorescência específicas que correspondem ao tipo de célula de migração. Isto permite uma melhor visualização da mobilidade celular imune não-aderente em momentos específicos. É possível a obtenção de provas de outras funções das células efectoras, tais como citotoxicidade ou a transferência de vectores virais a partir de células de efector para alvo, bem como. Assim, o método permite que os investigadores microscopicamente documentar célula-a-célula interacções de diferencialmente marcado, não-aderente com células aderentes de vários tipos. Tais informações podem ser especialmente relevante na avaliação dos tipos de células do sistema imunológico biologicamente manipulados ou ativados, onde a prova visual de funcionalidade é desejados com células-alvo tumor antes de sua utilização para a terapia do câncer.
Introduction
O ensaio de migração celular radial monocamada foi originalmente desenvolvido para medir as propriedades infiltrativas de células tumorais aderentes 1-4 em lâminas revestidas com matriz extracelular (ECM) 5-7 proteínas ou com componentes de ECM individuais, tais como fibronectina ou laminina 1,2. A técnica de semeadura envolvida uma única suspensão celular de células de tumor no centro de poços, utilizando um colector de células de sedimentação aço inoxidável (CSM). Após a sedimentação, as células tumorais se aderir ao fundo do poço e a mudança no diâmetro da população inicial de células ao longo do tempo foi usada para estabelecer uma taxa de motilidade horizontal. O ensaio de migração celular Radial Monolayer proporcionaram uma vantagem visual sobre outros métodos existentes que empregavam transwell placas de ensaio in vitro os recursos migratórios de células; estes ensaios não são propícias à geração de imagens 8. Como assim, ele também forneceu uma grande quantidade de liberdade na escolha do timepointé quando a migração é avaliada, sem limite do número de pontos no tempo um pesquisador pode optar por imagem após a sedimentação.
Porque a capacidade de migrar é uma funcionalidade importante para as células não aderentes, em especial na área da imunoterapia ou onde eles podem ser utilizados como veículos de administração para os vectores virais, nós adaptamos o uso do MCS para avaliar a migração de células não-aderentes tipos sobre monocamadas de células de tumor, além das proteínas de ECM. O benefício adicional de microscopicamente visualizando a migração de células não-aderentes em monocamadas de células tumorais viáveis, em ECM complexo isolado a partir do tumor, ou sobre os componentes da ECM individuais torna este ensaio versátil. Os ensaios que utilizam poços revestidos com uma única proteína extracelular não refletem exatamente o substrato tecido ECM ou tumor das células que migram através in vivo.
Aqui, usamos alorreativas linfócitos T citotóxicos (alloCTL), sensibilizados a major histocompcomplexo atibility (MHC) proteínas utilizando reacções unidireccional mista de linfócitos de células de tumor (MLTR) ou reacções de linfócitos mistos (MLR) 9, como o nosso tipo de células não-aderentes representativo. Testamos células de origem humana e murina. Quando a migração foi medida em monocamadas de tumor, as células tumorais utilizadas foram alvos ou parcialmente relevantes, exibindo algumas das mesmas proteínas MHC encontrados na população de células usadas para sensibilizar as efetoras, ou alvos totalmente pertinentes, com um conjunto completo de moléculas MHC que o efetores foram sensibilizados no sentido. Em algumas experiências, foi utilizado CellTracker fluorescente vermelha CMPTX ou corante proliferação celular eFluor 670 para diferenciar entre células efectoras e alvo. Utilizou-se também a transdução com vectores virais para codificação de proteínas fluorescentes como uma forma adicional de visualizar as células. Para certos ensaios, nós transduced o alloCTL com vetores retrovirais replicantes (RRV) que codificam para o verde esmeralda (EMD) proteína fluorescente 10,11; para others, as células tumorais foram transduzidas com vectores lentivirais que codificam para mStrawberry.
O alloCTL foram semeadas por meio de um canal do colector para o centro de qualquer monocamadas de células tumorais ou de ECM colhidas a partir de monocamadas de células de tumor. Interacções de células aderentes e não aderentes foram visualizadas por luz e / ou por microscopia de fluorescência ao longo do tempo. Perturbação na monocamada de células tumorais em baixa potência, ou tumorais células com núcleos fragmentados em alta potência foram indicadores de lesão celular por lise e apoptose, respectivamente. Nós digitalmente criados mapas de intensidade fluorescente superfície que mostram a migração de células fluorescentes T não aderentes sobre as culturas em monocamada. Observamos, também, a citotoxicidade engendrado para a monocamada de células de glioma aderente após a formação do cluster do alloCTL não aderente sobreposta. Assim, foi observada a transdução horizontal de RRV-EMD do alloCTL à monocamada de glioma.
Protocol
Representative Results
Discussion
As células tumorais em uma única suspensão de células foram pipetadas para os poços de uma lâmina de Teflon-mascarado. As células foram deixadas aderir e, em seguida, formado monocamadas numa atmosfera humidificada com 5% de CO2, 37 ° C incubadora (Figura 1A). Monocamadas estabelecidas ou proteínas da MEC derivados de monocamada podiam ser colhidas para estes ensaios (Figura 1B). Linfócitos T efectoras marcadas com corantes fluorescentes vitais ou transduzidas com v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apoiado em parte pelo NIH R01 CA121258, CA125244 R01, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI Grant Número UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, e do Fundo de Investigação Holmes Memorial Joan S.. MJH e GCO recebeu suporte do Joan S. Holmes Memorial pós-doutorado na Universidade da Califórnia. O dispositivo CSM foi obtido da Creative métodos científicos: www.creative-sci.com. O vector lentiviral foi recebido a partir da UCLA Vector Core, que é suportado por CURA / P30 DK041301.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μL Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μL Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μL pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
References
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