Introduction
O câncer de bexiga é um dos cânceres mais comuns do trato urogenital, com cerca de 75.000 novos casos por ano nos EUA 1. As altas taxas de recorrência ao longo da vida exigem acompanhamento, o que torna o câncer de bexiga um dos cancros mais caras para tratar. O tratamento padrão ouro para o alto grau NMIBC é a ressecção trans-uretral, seguida de imunoterapia intravesical com BCG. Embora o mecanismo exacto da actividade anti-tumoral de BCG continua a ser totalmente elucidado, admite-se que a activação de uma resposta imune mediada por células enriquecida em células T auxiliares (Th) e um T citotóxicas (Tc) um células é crucial para o sucesso da terapia de dois.
Apesar do fato que a BCG continua a ser o tratamento de escolha para NMIBC, uma elevada proporção de pacientes não responde à terapia; além disso, pode provocar um número de efeitos secundários: cerca de 70% dos tumores tratados recorrer após algum tempo e ~ 15% para a forma de progresso músculo-invasiva dadoença. Outros efeitos secundários associados com o tratamento com BCG incluem disúria, cistite e infecção renal 3-6.
O desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas deve levar em consideração a utilização de modelos pré-clínicos, seguindo in vitro de avaliação inicial; isto é particularmente relevante em tumores cuja microambiente pode influenciar significativamente o seu desenvolvimento e capacidade de resposta ao tratamento.
Ao longo da última década, têm abordado vários aspectos da actividade de modulação imunitária de HP-PNA, uma proteína produzida pela bactéria Helicobacter pylori, inicialmente identificados como capazes de promover a adesão endotelial de células polimorfonucleares (PMN) 7. Estruturalmente, HP-NAP pertence à proteína-protegendo o DNA sob condições de privação (DPS) da família 8 e é composto por 12 subunidades idênticas dispostas em um shell dodecameric.
Nós demonstramos que a HP-NAP éum receptor de tipo Toll (TLR) 2 agonista, com uma forte actividade de imuno-regulação responsáveis por dirigir a diferenciação de linfócitos T no sentido do fenótipo Th1, tanto in vitro como in vivo 9-10. Em virtude desta actividade, HP-NAP é capaz de redirecionar a resposta imune Th2 na resposta mais benéfico Th1 em um modelo murino de asma alérgica 11.
Para avaliar o potencial anti-tumoral Th1-dependente de HP-NAP, aproveitamos um mouse modelo de cancro da bexiga desenvolvido há vários anos por O'Donnel e colegas 12 para avaliar o impacto da vacina BCG.
Com este protocolo, demonstramos que a HP-NAP tem um potencial anti-tumoral forte contra o cancro da bexiga e que a eficácia da administração de HP-NAP é paralela à acumulação significativa, dentro de nós tumorais e linfonodos regionais, de ambos os linfócitos Th1 e Tc1 produtoras de Interferon ( IFN) -γ 13
O presente relatório proporciona um protocolo stepbystep, detalhando a preparação dos animais e dos respectivos cateterismo uretral, a queima química necessária para a fixação de células à mucosa da bexiga, e a injecção das células tumorais. Nós também descrevem a administração tópica de HP-PNA que pode ser considerada como um protótipo de quaisquer agentes terapêuticos desenvolvidos para o tratamento de cancro da bexiga. A prova obtida através da comparação de tumores isolados de controle e-tratados com NAP HP animais enfatiza não só o fato de que a HP-NAP pode ser um bom candidato para imunoterapia do cancro de bexiga, mas também a eficácia geral da montagem experimental.
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Protocol
Todos os procedimentos para lidar com os animais foram aprovados pelo Ministério italiano da Saúde (204/2011-B DM).
1. Os animais
- Crescer camundongos fêmeas C57BL6 / J 8 semanas de idade em gaiolas ventiladas individualmente com filtros microisolation.
Nota: As fêmeas são preferidos devido à conformação anatómica do seu aparelho de uro-genital externa torna o cateterismo mais fácil do que nos machos.
2. Cultura celular
- Manter a linha celular de carcinoma urotelial rato MB49 em RPMI 1640 meio suplementado com 10% de soro bovino fetal inactivado pelo calor e 50 ng / ml de gentamicina, a 37 ° C em 5% humidificada de CO 2.
- Cultivar células MB49 em frascos T-75 a 80% de confluência. Tripsinizar e ressuspender em 0,5 × 10 5-0,5 x 10 6 células por 150 ul de PBS antes da implantação em ratos.
3. Intravesical tumor Implant
- Anestesiar ratos, utilizando uma mistura de anestésicos e o Zoletil xylor (33 mg / kg e 20 mg / kg, respectivamente), injectada intraperitonealmente.
- Coloque os animais em decúbito dorsal e corrigir as patas traseiras para a almofada com fita adesiva. Patas têm de ser suficientemente separadas para processar o meato uretral bem visíveis e facilmente acessível para a inserção do cateter.
- Nota: Para a cateterismo, um cateter venoso pediátrica 24 G é adequado para ratinhos 8 a 10 semanas de idade. A escolha do cateter é muito importante a fim de evitar a fuga de líquido entre a parede da uretra e do cateter. Cateteres furo maior deve ser utilizado para ratinhos maiores ou mais velhos.
- Usando uma pequena pinça, beliscar uma borda da parte externa da uretra e torcê-lo muito suavemente em direção ao "fim cabeça" dos ratinhos. Esta ação expõe o meato uretral.
- Retirar a agulha do cateter interno e inserir este último na uretra com um ângulo de 45 °, orientada ligeiramenteno sentido da "extremidade posterior" dos ratinhos. Não force a entrada do cateter; em caso de resistência, basta girar o cateter muito suavemente, até que desliza para dentro da uretra. Quando cerca de 0,5-0,8 cm do cateter na uretra é, colocar cuidadosamente o cateter paralelo para a cauda dos ratos e inseri-lo completamente.
- Usando uma seringa de 1 ml, a agulha de que tem de ser inserido no cateter, lava-se a partir de urina residual da bexiga através da injecção de 200-300 ul de PBS estéril e aspirar o líquido a partir da bexiga.
- Nota: Ao injetar PBS, a bexiga vai encher-se e um inchaço será visível entre as patas traseiras dos ratos; isto confirma que o cateterismo é correto. A maioria dos cateteres têm um volume morto que tem de ser considerada quando se calcula o volume de injecção.
- Usando uma seringa esterilizada de 1 ml, injectar 200 ul de 0,1 N de HCl. Preencha a bexiga a fim de queimar toda a sua parede. Após 10 segundos, retire todo o ácido e imediatamente neutralize por injecção de 200 uL de NaOH 0,1 N, com uma seringa estéril. No caso de injecção de maior número de células (0,5 x 10 6), o passo de acidificação não é necessária.
- Aspire todo o líquido residual e imediatamente lavar a cavidade com 300 � de PBS estéril.
- Esvaziar a bexiga por aspiração, e injectar 150 ul de PBS contendo células MB49 (intervalo de 0,5 x 10 5-0,5 x 10 6) no interior da bexiga. Deixar a seringa montada no cateter a fim de evitar a fuga de células. É melhor para garantir a seringa, fixando-lo à almofada com fita adesiva.
- Após 1 hora, extrair suavemente o cateter da uretra, e colocar os murganhos na gaiola, sob uma lâmpada incandescente até despertaram: este ocorre geralmente entre 1 e 2 horas após o fim do tratamento.
4. Entrega de Intravesical HP-NAP
- Nota: pelo menos 3 dias após a instilação de células, é possível começar atratamento.
- Cateterize como descrito nas etapas 3.1 a 3.4. Nesta fase, não é necessário para queimar a parede da bexiga com HCl.
- Usando uma seringa de 1 ml, lava-se a partir de urina residual da bexiga através da injecção de 200-300 ul de PBS estéril e aspirar o líquido a partir da bexiga.
- Injectar 50 ug de HP-NAP por 150 ul de PBS para dentro da bexiga. Deixar a seringa ligado ao cateter para evitar fugas da solução de proteína. Fixe a seringa, fixando-lo à almofada com fita adesiva.
- Após 1 hora, extrair suavemente o cateter da uretra e colocar os murganhos na gaiola, sob uma lâmpada incandescente, até que acordado.
5. tumor explantes e da análise histológica
- No final do tratamento, sacrificar os animais, colocá-los em posições supina e corrigir as patas traseiras para a almofada com fita adesiva.
- Usando um bisturi cirúrgico, fazer uma incisão vertical sobre a 1,52 centímetros de comprimento através da pele e doperitônio, começando logo acima genitália externa para o "fim cabeça" dos ratinhos. Para minimizar o risco de danificar a bexiga, preste especial atenção para a profundidade do corte.
- A bexiga será posicionado no centro-esquerda do corte e do tumor será visível como uma massa rosa / violeta escuro. Após a sua excisão, colocar toda a bexiga numa gaiola histológica e fixar em 10% de formalina tamponada antes de ser embutido em parafina.
- Para análise histológica e histoquimica imune, preparar secções em série da bexiga (46 uM de espessura) usando um micrótomo padrão.
- Corar as secções com hematoxilina / eosina e prosseguir com o cálculo do tamanho do tumor (D xd 2) e determinar a porcentagem de necrose por área transversal usando um computador assistida analisador de imagem.
- Para a contagem navio, proceder por coloração das secções para o marcador endotelial CD31 / PECAM, usando uma técnica de imunoperoxidase padrão. Digitalizar as seções umt baixa potência (4 x) para identificar a área de maior densidade vascular. Dentro desta região, contar microvasos individuais em cinco campos aleatórios separados em alta potência (20 ×).
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Representative Results
A Figura 1 mostra a técnica de cateterização; o mouse é cateterizada e instilada com 0,5 × 10 6 células MB49. O tratamento com HP-NAP foi iniciado 3 dias após a injecção de células tumorais, para lhes permitir fixar à parede da bexiga e proliferar. Todos os animais que pertencem ao grupo de controlo desenvolver o tumor; alguns deles podem morrer, antes do final do período de 13 dias, devido à oclusão da uretra.
Após a primeira injecção com HP-PNA, os animais são tratados a cada três dias, para um total de quatro injecções. No final da experiência, no dia treze, os animais são sacrificados e as bexigas recolhidos para análise histológica e histoquimica imune. Como mostrado na Figura 2A, o volume do tumor dentro da bexiga de ratinhos tratados com HP-NAP é significativamente menor do que a do tumor de ratos tratados com veículo (220 ± 62 milímetros 3 vs 830 ± 13 80 milímetros).
Curiosamente, enquanto que nos animais tratados com o veículo o tumor invade o tecido adiposo subjacente, em 7 dos 8 animais tratados com HP-NAP do tumor está confinado dentro da parede da bexiga (Figura 2B). Finalmente, a vascularização é reduzida e a extensão de necrose é aumentado em ratinhos tratados com HP-NAP, em relação aos animais de controlo (Figura 2B e C).
Figura 1. Ratos cateterismo. Ratos fêmea são anestesiados e cateterizados usando uma cânula estéril 24 G. O painel direito é a ampliação da caixa preta. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A actividade anti-tumoral de HP-NAP. Ratos, implantado no dia 0 com MB49 células (0,5 x 10 6), são tratados com 50 ug de HP-NAP ou PBS (veículo) nos dias 3, 6, 9 e 12. Todos os animais são mortos no dia 13. (A) análise histológica Representante sobre bexigas isoladas de ratinhos de controlo e animais tratados com HP-NAP, e quantificação do volume tumoral. (B) Ampliação das secções do painel A e a percentagem de necrose nos dois grupos de animais. (C) bexigas ressecada, coradas para CD31 / PECAM; secções representativas de controlo e animais tratados com HP-NAP são mostrados. Quantificação da densidade de microvasos (C, painel direito); HPF, campos HighPower. Os dados representam a média ± SD; N = 8 ratinhos por grupo. A significância estatística foi determinada pelo teste t de Student (** p <0,01). Figura modificado a partir Codolo etal. 13. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A maioria dos avanços na terapia do cancro requerem testes em modelos animais antes de começar testes clínicos. A possibilidade de estudar a biologia do tumor in vivo, aproveitando-se de modelos animais, representa uma ferramenta crucial para os pesquisadores que investigam patogênese do câncer, permitindo a avaliação de diferentes abordagens terapêuticas. Modelos ortotópicos sendo o padrão-ouro 14-15, tanto por causa da enorme quantidade de linhas celulares disponíveis para configurar um modelo de tumor e porque eles imitam o ambiente do tumor que ocorre naturalmente 16.
Além disso, a criação de modelos ortotópicos de câncer em camundongos singeneicos, como descrito aqui, é particularmente relevante no caso de estudos destinados a investigar novas estratégias terapêuticas baseadas em imunoterapia, uma vez que estes últimos não são possíveis em ratinhos imunodeficientes que sofrem xenoimplants.
A metodologia descrita neste protocolo descreve tele cateterização de uma uretra feminina rato que permite tanto à inoculação de células tumorais e a administração de agentes terapêuticos na cavidade da bexiga.
A vantagem de pré-condicionamento, a parede da bexiga por meio de uma queimadura de ácido (tal como descrito acima, em vez de outras abordagens, tais como a utilização de tripsina ou poli-lisina), é a de promover o desenvolvimento de tumores grandes e altamente invasivas. Pelo contrário, o pré-condicionamento com tripsina e poli-lisina, resulta em tumores menores e menos invasivos, provavelmente devido a um efeito prejudicial de resíduos destas substâncias sobre a viabilidade das células tumorais 17. A queimadura de ácido também é o preferido para outro sistema de pré-condicionamento com base na cauterização elétrica, porque este pode causar a perfuração da parede da bexiga e da disseminação do tumor no peritônio 18.
O protocolo foi otimizado para estudos de curta duração (~ 13 dias). Implantar o proper número de células é crucial, já que um maior número de células irá resultar em mais rápido crescimento do tumor e perda de animais possivelmente devido a grande carga tumoral. Além disso, até que o utilizador se torna confiante com a técnica, existe um certo grau de risco de danificar a uretra ou da bexiga, causando assim a morte dos animais. Em nossa experiência, no entanto, se os animais são adequadamente operados (e, portanto, não morrem durante o procedimento), eles vivem sem sofrimento para a duração dos experimentos (13 dias). Além disso, através da redução do número de células injectadas, é possível prolongar a duração das experiências.
Utilizou-se este modelo para avaliar a actividade anti-tumoral da proteína HP-NAP produzida por Helicobacter pylori, com a finalidade de melhorar, e eventualmente substitua, a terapia actual com base em BCG com um novo dotado com um maior benefícios / efeitos colaterais proporção. De modo mais geral, esta abordagem experimental pode ser adotado em todos os pré-cliniavaliações cal que requerem a entrega de agentes terapêuticos na cavidade da bexiga.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, italiano Ministério da Universidade e da Pesquisa, projetos Prin e Progetti di Ricerca di Ateneo, conceder N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo, conceder N ° 2011-0485 para MDB, e por Finanziamento Giovani studiosi, da Universidade de Pádua, para Gaia Codolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System | |
References
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