Abstract
알츠하이머 병은 고령화에 영향을 미치는 신경 퇴행성 질환이다. 질병의 주요 신경 병리학 적 특징은 아밀로이드 - 베타의 과잉 생산과 고통받는 사람들의 뇌 영역에서 아밀로이드 베타 플라크의 증착이다. 지난 몇 년 동안 과학자들은 아밀로이드 - 베타 병리를 복제하려고 많은 알츠하이머 병 마우스 모델을 생성했다. 불행히도, 마우스 모델은 선택적 질환 특징을 모방. 신경 세포 사망, 알츠하이머 병 환자의 뇌에서 현저한 효과가 현저 이들 마우스에서 부족하다. 뉴런 가장 독성임이 입증되었다 아밀로이드 - 베타의 형태 - - 따라서, 우리 등은 직접 아밀로이드 - 베타의 수용성 올리고머 종을 주입하는 방법을 채용 한 stereotaxically 뇌로. 이 보고서에서 우리는 선택 뇌 영역에 아밀로이드 - 베타 수준을 증가의 수술 기법을 문서화하는 남성 C57BL / 6J 마우스를 사용합니다.콜린성 회로에 의해 접속되어 기저 전뇌와 함께이 뇌 구조체가 변성 질환의 영역 중 하나 나타내므로 투여 대상은 해마의 치아 이랑이다. 브로카의 대각선 대역의 수직 사지에서 세포 사멸 및 콜린성 뉴런 손실에 수반하는 증가가있을 정위 주입을 통해 치아 이랑에서 아밀로이드 베타 상승의 결과, 1 주 내에 치아 이랑에서 신경 세포 손실의 증가를 나타내 기저 전뇌의. 이러한 효과는 2 주까지 관찰된다. 우리의 데이타는 현재 아밀로이드 베타 주입 모델은 단기간에 특정 영역의 신경 세포 사멸을 해결하기위한 대안이 마우스 모델을 제공한다는 것을 시사한다. 이 모델의 이점은 아밀로이드 - 베타가 시공간하게 증가 될 수 있다는 것이다.
Introduction
아밀로이드 - 베타 (Aβ 1-42)으로 구성되어 아밀로이드 플라크 예금, 알츠하이머 병 (AD)의 병리의 핵심 기능입니다. 많은 연구는 신경 세포의 죽음, 시냅스 영양 장애, 손실 및 기능 장애를 유발 재조합 올리고머 Aβ 1-42의 높은 독성 수준을 보여 주었다; 뿐만 아니라 학습과 기억 적자 1-4으로. 영향을받는 뇌 영역은 해마, 대뇌 피질, 그리고 기저 전뇌와 편도체 (5, 6)와 같은 피질 하 구조를 포함한다. 지금까지 광고의 Aβ 1-42 병리학을 시뮬레이션하려고 여러 형질 전환 마우스 모델이있다. 변형에 따라이 동물은 AD의 선택 병리학 적 기능을 검사에 유용하다는 것을 증명한다. 불행하게도,이 트랜스 제닉 라인들, 및 APP23 5XFAD 제외한 이들 마우스는 완전히 신경 손실, AD의 핵심 양태를 복제하지 않는다. 심지어 APP23 및 5XFAD에서 관찰되는 신경 세포의 손실, 신경 세포의 죽음 obser와VED는 몇 가지 선택 지역 7,8에, 미묘한 나이 의존하고 분리 하였다.
야생형 마우스의 뇌에 Aβ 올리고머 1-42의 직접 주입 amyloidopathy 1,9,10의 신경 세포 죽음의 측면을 복제 생체 모델의 우수한을 제공합니다. 일반적으로 사용되는 형질 전환 마우스 모델과 달리 Aβ 올리고머 1-42 주입 모델은 급성 공간 및 시간 방식으로 Aβ에게 1-42 수준을 높이기에 이상적입니다. 이 모델 야생형 마우스를 사용하는 장점은 트랜스 제닉 마우스에 도입 라인 돌연변이 잠재적 보상 또는 부작용을 제거한다. 과거의 연구는 해마에 Aβ 1-42의 독성 수준을 주입하여 일주 (1)의 내부에 주입 부위의 근방에서 신경 세포 사멸을 유도하는 것으로 나타났다. 또한, Aβ 1-42은 콜린성 뉴런 (11) 기저 전뇌 독성 관찰과 일관성이 있음을해마에 프로젝트 콜린성 신경 세포 (BFCN) 인구는 효과적으로 뇌에서 고립 된 신경 회로의 시험을 허용, 생쥐에서 베타 - 아밀로이드 주입 1,10 다음 7~14일 내 20-50% 감소된다. 대부분의 제어 / 차량 및 올리고머 Aβ 1-42 솔루션 해마 (12)의 치아 이랑에 동측 BFCN 프로젝트 때문에 비교가 좌우 반구 (1) 사이에 만들어 질 수 뇌의 양쪽에 주입 될 수있다.
이 보고서에서 우리는 성인 야생 형 C57BL / 6J 마우스에 대한 자세한 수술과 주사 방법을 제공 할 것입니다. 이 마우스 변형 때문에 연구의 광범위한 사용으로 선택된다. 기술적으로, 임의의 뇌 영역은 그러나 여기서 우리는이 기술을 설명하기 위해 대상으로 해마의 치아 이랑을 사용, 주입 대상이 될 수있다.
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Protocol
참고 : 모든 동물 실험의 경우, 기관 및 관리 및 실험 동물의 사용을위한 국가 가이드 라인을 따라야했다.
1. 외과 수술 도구 및 솔루션을 준비
- 모든 스테인레스 스틸 수술 도구를 압력솥.
- 멸균 분자량 그레이드 탈 증류수 200 증명 무수 에탄올을 희석하여 70 % 에탄올을 준비한다.
- 해밀턴 주사기에 29 G 바늘을 연결합니다. 1 분 동안 반복 그리기 및 배출 nanopure 물에 의해 해밀턴 주사기와 바늘의 내부를 청소합니다. 70 % 에탄올로이 절차를 반복합니다.
- 해밀턴 주사기의 플런저와 바늘을 제거합니다. 공기는 층류 후드 O / N에서 부분 건조.
- 사용 전에 30 분 동안 자외선 바늘과 주사기를 조사.
- 0.9 %의 체적 농도로 최종 중량에 대한 분자 수준의 물에 용해하여 염화나트륨 식염수 용액을 준비한다. Sterili0.2 ㎛의 기공 필터를 통해 여과하여 용액을 ZE.
2. 올리고머 Aβ 1-42 준비
- 빠 '등 13 책에서 설명한대로 Monomerize과 정확히 5 mm로 DMSO에 재조합 인간 Aβ 1-42을 재현 탁.
- 수술 전 하루에 100 μm의 멸균 (1X) PBS로 5 mM의 Aβ 1-42 희석.
- 분쇄가 잘 솔루션을 섞는다.
- 4C에서 12 시간 동안 Aβ 1-42 솔루션을 품어.
참고 : 이러한 PBS에 DMSO를 희석 또는 스크램블로 제어 솔루션 / Aβ 1-42 펩타이드는 Aβ 1-42와 같은 방법으로 준비되어야한다 역.
사출 좌표를 결정 (3)
- 정확한 전후방 (AP), 중간 - 측면 (ML)를 결정하기 위해 성인 마우스 뇌 아틀라스를 사용하고 지느러미 - 복부 (DV)는 관심 (14)의 뇌 영역 좌표.
아니테 : 우리는 브레 그마에서 다음 좌표를 대상으로 해마의 치아 이랑을 고른 기술 설명하기 : AP를, -2.00 mm; ML은 1.3 mm의 ±; DV, -2.2 mm이다. AP 값을 선행 음의 부호는 브레 그마의 2.00 mm의 후방을 나타냅니다. ML 값을 선행 ± 기호 중앙에서 왼쪽과 오른쪽 방향을 나타냅니다. 마지막으로, DV 앞에 음의 부호는 뇌의 표면으로부터 복부 이동 나타낸다.
4. 정위 프레임 설정
- 수술 얼굴 마스크, 깨끗한 실험실 코트, 멸균 수술 장갑을 착용 할 것.
- 정위 악기와 70 % 에탄올로 마우스 어댑터를 닦습니다.
- 카운터에 무균 수술 드레이프를 놓습니다.
- 무균 수술 드레이프의 상단에 마우스 어댑터 정위기구를 놓습니다.
- 70 % 에탄올로 마우스 가열 패드를 닦습니다. 정위 프레임 침대 위에 가열 패드를 놓습니다. 범용 LABORA를 사용하여마우스 어댑터 침대 위에 가열 패드 아래 테이프에 토리 라벨 테이프.
- 제조업체의 지시에 따라 온수 순환기 펌프에 전기 패드를 부착합니다.
- 따뜻한 물 순환기 펌프의 전원을 켜고 37 ° C의 온도를 설정하고,이 온도에 도달 할 때까지 기다립니다.
- 제조업체의 지시에 따라 전동 수직 주입 축에 그것을 돌려서 정위 프레임에 29 G 바늘 50 μL 해밀턴 주사기를 부착합니다.
- 비드 살균기를 켜고는 제조업체의 설정 온도에 도달 할 때까지 기다립니다.
참고 :이이 동물 사이에 스테인레스 스틸기구를 살균하는 데 사용됩니다. 이 악기를 살균 구슬과의 접촉 20 초 걸립니다. - 핫 플레이트의 전원을 켜고 42 ° C로 설정하고 꼭대기 깨끗한 빈 새장을 배치합니다.
- 해밀턴 주사기를 고정대에 고정시킨 상태에서, 상기 전동 정위의 I를 사용njector Aβ 1-42 솔루션을 그립니다.
참고 : 주사기로 솔루션의 4 개 이상의 μL를 그려 후 주입 볼륨을 설정합니다 정위 인젝터를 사용합니다. 제조업체의 지시에 따라 인젝터를 작동.
5. 동물 준비
- 규모의 무게를 이용하여 마우스의 무게를 결정합니다.
- 복강 (IP)을 주입하여 100 ㎎ / ㎏ 케타민 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진에서 케타민 / 자일 라진 칵테일 마우스를 마취. 발가락 핀치 반사의 손실에 의해 마취의 깊이를 모니터링합니다.
- 마우스가 진정 된 후 머리 깎기을하고 두개골을 통해 피부를 노출 머리를 면도.
- 정위 침대 위에 가열 패드 위에 마우스를 놓습니다.
- 치아 가드 내부의 앞니의 치아를 입을 열고 배치 할 주걱을 사용합니다. 마우스의 얼굴에 코 부분을 고정합니다. 부드럽게 너무 꽉을 단속.
- 포지머리를 보호하는 청각 (外耳道)에 양자 귀 크로스바를 기. 이 두개골을 돌 때까지 각 크로스바를 이동 한 다음 그것을 고정 나사를 켭니다.
- 머리가 부드럽게 머리를 아래로 밀어 검지 손가락을 사용하여 고정되어 있는지 확인하십시오. 머리가 제대로 고정되어 있다면 그것은 포기하지 않거나 누르면 이동합니다.
- 촉촉한 그들을 유지하는 눈 아이 크림 또는 점안제의 드롭을 적용한다. 눈 수술을 통해 습기가 있는지 확인합니다.
- 수술 부위는 70 % 에탄올이어서 두개골 위에 피부에 betadine 용액을 적용 멸균 면봉을 사용하여 소독. 교류 betadine 2 회 이상 세정 70 % 에탄올을 수행한다.
6. 수술 및 주입
- 두피의 중간 선에 2-3mm 절개를 만들기 위해 메스를 사용하고 두개골, 랜드 마크의 시상 봉합, 브레 그마 및 람다을 노출 1.0-1.5 cm에 절개 라인을 확장하는 직선 미세 가위를 사용정위 좌표에 기반들. 떨어져 피부를 유지하기 위해 마이크로 클램프를 사용합니다.
참고 : 브레 그마 및 람다 위치는 마우스 뇌지도 책 "정위 좌표에서 마우스 뇌"(14)에 설명되어 있습니다. - , 면봉을 가지고 멸균 식염수에 담가하고 두개골을 청소하는 데 사용합니다. 그런 다음, 두개골을 건조 깨끗하고 마른 면봉을 사용합니다.
- 브레 그마에 점을 표시하기 위해 멸균 고급 볼펜을 사용합니다. 바늘의 끝이 바로 브레 그마의 점에 닿을 수 있도록 해밀턴 주사기의 위치를 정위 미세 조작기를 사용합니다.
- DV 좌표를 기록합니다.
- 두개골의 AP 축이 레벨이 바늘의 끝이 람다 지점을 터치 있도록 후방 해밀턴 주사기를 이동할 수 있는지 확인합니다.
- DV 위치를 기록합니다. 0.5 mm 내에있는 DV는 브레 그마 및 람다 좌표를 확인하십시오.
주 : 목표는 브레 그마 및 람다 간의 DV 차이를 최소화하는 것이다.
- M을 사용하여icromanipulator는 브레 그마 점에 다시 해밀턴 주사기 바늘 끝을 반환합니다.
- 시작 AP의 위치를 기록합니다.
- 좌표 시작 AP로부터 2.00 mm를 감산하여 끝 AP의 위치를 계산한다.
- 좌표 최종 AP에 해밀턴 주사기 바늘의 위치를 변경하기 위해 미세 조작기를 사용합니다.
- 현재 ML 좌표를 기록합니다.
- 왼쪽 계산과 오른쪽 ML을 종료하면 추가 또는 좌표 ML 시작에서 1.3 mm를 차감하여 조정한다.
- 끝 ML 좌표 중 하나에 해밀턴 주사기 바늘을 이동하는 미세 조작기를 사용합니다.
- 모두 종료 ML 좌표에 두개골의 표면에 바늘 끝을 터치 DV 좌표를 기록하고 값이 0.5 mm 내에 있는지 확인하십시오.
주 : 목표 ML 좌표 끝 둘 사이 DV 차이를 최소화하는 것이다. - 결말에 두개골이 지남에 0.5 cm의 바늘을 끌어 조정한다. 일에 점을 표시하기 위해 멸균 고급 볼펜을 가지고두개골의 전자 표면. 두개골의 반대쪽에 대해이 단계를 반복합니다.
- 모두 종료 ML 좌표에 두개골의 표면에 바늘 끝을 터치 DV 좌표를 기록하고 값이 0.5 mm 내에 있는지 확인하십시오.
- 방법 중 명확한 해밀턴 주사기를 스윙.
- 드릴 0.8 mm의 드릴 헤드를 연결합니다. 두 손으로 드릴을 가지고 안정성을 위해 테이블의 표면에 팔꿈치를 설정하고 왼쪽 또는 오른쪽 ML 하나가 좌표에 샤피 점보다 약간 드릴 헤드를 배치합니다. 두개골에 구멍을 소개하는 두개골 표면에 드릴 팁을 내려 드릴을 활성화합니다. 반대편에 대해이 단계를 반복합니다.
참고 : 일부 출혈은 새로 도입 된 구멍에서 발생할 수 있습니다. 다음이 출혈이있는 경우 피를 가볍게 두 드리 깨끗한 마른 면봉을 사용합니다. - 새로 도입 된 ML 구멍 중 하나를 통해 다시 위치로 해밀턴 주사기를 이동합니다. 바로 두개골을지나 해밀턴 바늘을 낮 춥니 다. 이 시점에서 뇌에 구멍을하지 않도록주의. 확인하려면 바늘 쉬르 두개골이 당신의 검지 손가락을 부드럽게 만들기 위해 두개골에 바늘을 밀어 통과전자 바늘 구멍을 종료하지 않습니다.
- 시작 DV 좌표를 기록합니다.
- 끝 DV가 시작 DV 좌표를 2.2 mm를 뺀 좌표 계산합니다.
- 좌표 아래로 종료 DV에 바늘을 낮 춥니 다.
- 0.5 μL / 분의 속도로 치아 이랑 Aβ 1-42 4 μl를 펌핑하도록 정위 인젝터 펌프를 활성화.
- 주입이 완료되면 바늘은 주사 부위에서 용액의 역류를 최소화하기위한 추가적인 1 분 동안 그대로 유지하자.
- 뇌의 다른 측면에 바늘을 이동하고 6.13-6.18 단계를 반복합니다.
7. 동물 제거 및 수술 후 관리
- 귀 바, 얼굴 / 코 가드를 풉니 다. 장치에서 마우스를 제거합니다.
- 두피를 닫습니다 끌어 후 봉합과 상처를 봉인 한 학생 표준 패턴 집게를 사용합니다.
- 수화에 대한 IP를 통해 마우스로 멸균 생리 식염수 1 ㎖를 주입한다.
- 에JECT의 프레 노르 핀 (0.1 ㎎ / ㎏) 피하는 통증을 완화합니다.
- 이 깨어날 때까지 42 ° C 핫 플레이트 위에 설정 깨끗한 빈 새장에 마우스를 유지하고 충분한 음식과 물과의 주택 케이지로 돌아갑니다.
- 피하 주사를 통해 통증 완화를위한 3 일간 매 12 시간을 부 프레 노르 핀을 관리합니다.
8. 봉합사 제거
- IP 100 ㎎ / ㎏ 케타민 10 ㎎ / ㎏ xlyazine에서 케타민 / 자일 라진 칵테일 마우스를 마취. 참고 :이이 7~10일 수술 후 이루어집니다.
- 봉합사를 제거하기 위해 학생 표준 패턴 집게 똑바로 미세 가위를 사용합니다.
- 수화에 대한 IP를 통해 마우스로 멸균 생리 식염수 1 ㎖를 주입한다.
- 이 깨어날 때까지 42 ° C 핫 플레이트 위에 설정 깨끗한 빈 새장에 마우스를 유지하고 충분한 음식과 물과의 주택 케이지로 돌아갑니다.
9. 동물의 희생 및 조직 처리
- 마우스 및 P 마취4 % 파라 포름 알데히드 (15)와 함께 erfuse 뇌를 제거하고 16 냉동 절편을 위해 그것을 처리합니다.
참고 : 동물 희생의 타이밍이 실험에 따라 달라집니다. 그러나 우리의 연구에 우리는 7, 14 일 수술을 게시 선택했다.
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Representative Results
인간 재조합 올리고머 Aβ 1-42의 제조 본 방법은 단량체, 이량 체, 삼량 체 및 사량 체 (도 1A)으로 이루어진 수용성 올리고머 종을 산출한다. 이러한 저 분자량 Aβ 1-42 종 아니지만 브릴과 플라크 뉴런 1,4,9,17-19 가장 독성 수많은 설정에 도시되어있다. 올리고머 Aβ 1-42은 마우스의 뇌에서 Aβ 1-42 신경 세포 사멸을 유도하는지 여부를 결정하기 (100 μM 원액 4 μL)를 9개월 오래 야생형 C57BL 하나 반구에서 해마의 DG에 주입 하였다 / 6J 마우스. C57BL / 6J위한 해마의 중량은 약 0.018 g을 것으로 추정되므로 Aβ 1-42의 전달은 약 100 μg의 / g이었다된다. 아밀로이드 베타 1 용해에 사용 된 DMSO의 동일한 볼륨으로 구성 - 같은 마우스 뇌의 반대편 DG는 제어 / 차량 용액을 주입했다42 (1X) PBS에 희석 - 비교를 위해. 앞서 언급 한 스크램블 또는 Aβ를 역으로 우리가 이전에 해마 신경 세포 일에 영향을 찾을 수 없기 때문에 1-42 펩타이드는 비교를위한 대조군으로 사용 할 수있다. 뇌 내로 바늘의 도입은 지방 조직 손상 (도 1b)을 작성하고, 우리가 포스트 분사를 수행하도록 선택한 최종 DG 붕괴 원인으로서 조직은 아직도 그대로 주입 관에 인접하여 분석한다. Aβ 1-42 주입 1 주일 이내에 DG는 분자 층과 주사 부위 (도 2a) 부근의 다형성 전지 층의 상승 된 Aβ 1-42 수준을 나타내었다. Aβ 1-42 (그림 2B)의 신경 퇴행성 효과를 확인, 7 14 일에서 Aβ 1-42는 TUNEL 양성 염색의 증가를 유도하고 DG 두께 감소한다.
BF의 콜린성 신경 세포는 DG에 프로젝트 때문에DG에서 신경 세포의 손실이 BF 변성을 유발하는 경우 해마의 우리는 다음 결정. 이 연구를 위해 역행 추적 fluorogold (2 % 현탁액) 공동 주입 DG에 Aβ 1-42와 함께했다. 주입 fluorogold 다음 칠일은 콜린성 신경 세포를 통해 라벨의 역행 수송을 제안 BF (그림 2C)에서 검출되었다. 이 신경 터미널 DG에서 Aβ 1-42에 노출 된 것을 나타 내기 때문에 따라서, BF에 정량의 목적을 위해 우리는 fluorogold 양성 신경 세포를 선택했다. DG Aβ 1-42 주입 다음 모두 1, 2 주에, 대각선 밴드의 핵 - 콜린성 신경 세포가 DG에 프로젝트 BF의 하위 영역 - Aβ 1-42 주사 하였을 사이트로 동측은 TUNEL 염색의 증가를 나타내었다 과 콜린성 뉴런 (그림 2D) 감소한다. BF에서 관찰 된 신경 세포의 손실은 파괴를 연결 과거의 연구를 확인BF-해마 통로 1,10에 Aβ 1-42의 효과. 또한 제어 / 차량 용액이 TUNEL 염색에서 추가적인 증가가 있었고, DG에 주입 하였다 대각선 밴드 핵 측 일주 시점에 이주 시점의 비교로부터 점에 유의하는 것이 중요 콜린성 뉴런 (그림 2D, 테이블) 감소한다. 이러한 결과는 바늘로 인한 신체적 외상에 기여하는 것을 시사이 포스트 분사 시점 간의 비교 차량 주입 측 DG의 TUNEL 양성 표지 (도 2B, 테이블)에 상당한 GCL 두께의 감소 및 증가를 반영 시간이 지남에 따라 변성. 심지어 바늘이 바람직하지 않은 부작용으로, Aβ 1-42의 신경 변성 효과는 여전히 제어 / 차량 용액 (도 2D)에 비해 현저하게 크다. 이와 함께, 현재의 주입 모델 effectivelY는 단기 Aβ 1-42 자극을 연구하는이 매력적인 모델을 7 일 이내 마우스 뇌의 Aβ 1-42의 독성을 재생합니다.
도 1 올리고머 Aβ 1-42 제제 및 마우스 뇌 주입 관 시각화. (A) 2 μM 올리고머 Aβ 1-42 10-20 %의 트리 신 겔상에서 분리하고, 니트로 셀룰로오스 막에 전사 하였다. 멤브레인은 Aβ 1-42 항체 6E10 (: 1000 1)로 블 롯팅 하였다. (B)는 Aβ 1-42 또는 제어 / 차량 (100 μM 용액 4 μL)을 9개월 오래 C57BL / 6J 생쥐의 각각 해마의 좌우 총재에 주입 하였다. 마우스는 7 일간 생존했다. 뇌는 직렬 섹션 당 20 μm의에서 절단되었다. 해마 부분은 DAPI에 대한 염색 하였다. 해시 마크는 묘사주입 관. 화살표 DG 붕괴 보여줍니다. 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2는 올리고머 Aβ 1-42 DG 및 BF 뉴런 사멸을 유도한다. 제어 / 차량 또는 Aβ 1-42 (100 μM 용액 4 μL)을 (9)의 각각 해마의 좌우에 주입 하였다 총재 개월 된 C57BL / 6J 마우스. 마우스 중 하나를 7 또는 14 일 동안 생존했다. 뇌는 직렬 섹션 당 20 μm의에서 절단되었다. () 칠일은 (2,000 1, NU4 항체) Aβ 1-42 스테인드 주입 해마 부분을 게시합니다. ML, 분자 층; GCL, 신경절 세포 층; PCL, 다형성 세포 층. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. (B (C)은 차량이나 Aβ 1-42 fluorogold (2 % 용액)와 공동 주입. Fluorogold 라벨은 BF 칠일 주입 후 결정. BF가 포함 된 슬라이드는 무작위로 선택되었다. Fluorogold 표지는 관심 영역을 결정하는 데 사용되었다. 관심 영역이 동정되면 인접한 뇌 조각은 관심 마커 염색하기 위해 사용되었다. 세트는 (D)에 이미지가 선택되어있는 지역이다. 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. (: 100, 염소 폴리 클로 날 1) 또는 TUNEL (D) 7 또는 14 일 채팅 스테인드 주입 BF 섹션을 게시 할 수 있습니다. *** P <0.001 일주에 비해. * p <0.05에 비해 차량. 정량은 전체 지역에 이루어졌다관심. 내측 격벽과 대각선 밴드 간의 경계는 전방 접합면의 위치에 따라 묘사된다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. (N = 5 쥐). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
1) 무균 기술을 사용합니다 : 실험자 또는 외과 의사가 반드시 성공적으로 Aβ 1-42 주사를 달성하기 위해 2) 올바르게 정확한 좌표와 관심의 뇌 영역을 식별; 3) 적절 AP 및 ML 축 평준화 뇌 정위 프레임에 마우스를 보호 할 수; 4) 정밀 미세 조작기를 작동 할 수있는 능력을 가지고; 5) 적절한 수술 치료를 보장합니다. 이러한 주요 단계는 다음 경우 마우스없이 관찰 감염으로 수술을 생존해야한다.
시험관에 있던 연구는 우리와 다른 Aβ 1-42 직접 해마에 주입이 광고의 주요 기능 중 하나를 묘사, 신경 세포 죽음 1,4,9,10을 이끌어내는 것으로 나타났습니다. 변성 한 마커의 증가에 의해 보완된다 치아 이랑의 체적 감소에 의해 도시 된 바와 같이, 변성은 주사 부위의 부근에서 명확하게 알 수있다. 또한, T그는 콜린성 라벨링 감소 및 BF 1,10에서 TUNEL 양성 염색의 증가에 의해 도시 된 바와 같이 해마 뉴런으로 돌출 역행 방식으로 다이 콜린성. 따라서,이 생체 내 모델은 로컬 Aβ 1-42의 반 급성 효과를 조사하기 위해 우수한 모델 역할을한다. 이 주입 모델의 주요 이점은 그 동적 특성이다 : 임의의 뇌 영역은 대상이 될 수 있고, 다른 세 동물이 이용 될 수있다. 9개월 된 수컷 마우스는 우리가 더 나이가 생쥐에서 Aβ에게 1-42 수준을 증가 믿기 때문에 우리의 실험에서 선택 노년층에서 발생하는 질병을 시뮬레이션했다. 또한, 우리는 같은 나이의 마우스를 사용하여 일관된 실험을 유지하는 것을 목표로하고 있습니다. 그러나, 모든 연령의 마우스는 주사에 사용될 수 있습니다. 과거에 우리는 16 개월이었다 쥐에 실험하고 다른 사람은 9,10 2 세 개월이었다 마우스를 사용하고 있습니다. 만 수컷 마우스는 여성 마우스 전시 ESTRO으로 연구에 사용되어야한다겐 레벨 변동 및 에스트로겐은 신경 보호 효과 (20)을 갖는 것으로 알려져있다. Aβ 1-42의 병리학 적 효과의 많은 관심 연구 분야의 중심이지만, 또한 낮거나 생리 Aβ 1-42 레벨이 학습과 기억 (21, 22)에 대한 정상적인 기능을 위해 필요하다고이 증거이다. 이 연구에서 연구진은 Aβ 1-42의 농도가 주입 감소하고 효과적으로이 패러다임의 유틸리티의 동적 특성의 또 다른 예를 공개, 해마 22, 23로를 주입. 성공적으로 stereotaxically 주입 된 다른 화합물은 세포 죽음 / 생존에서 동물의 행동에 이르기까지 다양한 효과를 조사하기 위해 약물, 바이러스, siRNA를, 항체 및 펩티드 1,22-26을 포함한다. 따라서,이 주입 패러다임을 사용하는 수많은 응용 프로그램이 있습니다.
설명 주입 방법, V에 대한 다양한 잠재력을 발휘하면서IVO,이 기술을 사용하여 연구 또한 본질적인 한계와 함께 제공됩니다. 첫째,이 모델은 단지 격리 뇌 영역에서 Aβ 1-42의 효과를 재현하기 위해 시도한다. 둘째, 주사 부위는 뇌에 바늘의 도입에서 손상된다. 이 추가 세포 죽음과 신경교 증에 기여한다. 따라서, 분석은 주입 관으로부터 떨어져 수행되어야한다. 같은 뇌의 반대편에 적합한 차량 제어와 함께이 주변 조직에 주입 된 차량과 Aβ 1-42 솔루션의 확산으로 문제가되지 않습니다. BF의 콜린성 신경 세포는 해마에 프로젝트 때문에 셋째, 바늘 (그림 1B)로 DG의 붕괴에 의해 분명 같은 해마의 물리적 손상이 실수로 일부 BFCNs을 죽일 수 있습니다. 다행히, 단기적으로 신경 회로 검사 - 싱글 - 샷 주입 1 주일 이내를 - 우리의 데이터가 증가 제안하기 때문에 문제가 제기되지 않습니다기저 전뇌의 콜린성 죽음은 Aβ 1-42의 결과가 아닌 바늘의 외상; 제어 주사는 적절한 분석을 제공합니다. 데이터는 이러한 뉴런들이 시냅스 대상 (그림 2B)을 잃게로 DG의 변성도 BF의 콜린성 신경 세포의 손실에 필요한 것이 좋습니다. 불행하게도 2 주까지 생존 동물을위한 차량 주입 측의 물리적 외상으로 인한 치아 이랑의 변성과 숱이 부분적으로 인해 나타납니다 일주 후 차량 주입 동물을 통해 BFCN 죽음의 의미있는 상승을 보여줍니다 바늘. 그러나,이 단계에서 데이터가 Aβ 1-42 주사 하였을 사이트 BF 동측 유의 사망가 나왔다. 넷째, 미묘한 해부학 적 경계를 식별하는 것은 달성하기가 어려울 수있다. 예를 들어, 상기 내측 격벽과 대각선 밴드 간의 경계가 결정 전방의 위치에 기반접합면이었다 기술 이전 (27)을 설명했다. 또한, 동측 BF 콜린성 신경 세포 돌기 때문에 - 주로 중간 격막과 대각선 밴드 (MS / DB)의 수직 사지에서 - 해마 12,28,29의 치아 이랑에 우리는 Aβ 하나의 반구를 주입하기로 결정 1-42과는 비교를위한 대조군으로 반대 반구를 사용합니다. 그것은이 패러다임 우려가 좌우 MS / DB 분리 경계의 정확한 식별 될 것이라고 생각할 수있다. MS는 중앙선 영역이지만, 데시벨보다 횡이다. 이 현재 작업과 가장 최근 발행 한 동안 우리는 편안하게 왼쪽과 오른쪽 DB를 구별 할 수 있었다. 우리의 정량화 채팅 (+) 신경 세포가 Aβ 1-42 주사 하였을 측면에서 DB에 약 25 % 감소 보여준다. 그러나, 우리는 MS 1에 상당한 채팅의 변화 (+) 신경 세포를 감지하지 않았다. 때문에 측면 LOC의데시벨의 ATION과 변화는 우리가 우리가 같은 동물 내에서 차량과 Aβ 1-42 주사를 사용하는 것이 정당하다고 여겼 관찰했다. 또한, 동일한 동물 내에서 두 가지 실험 조건을 시험 동물의 사용을 최대화뿐 아니라 잠재적 동물 대 동물 변이성을 감소시킨다. 우리의 실험 디자인은 우리가 생각할 좌우 반구를 비교할 수 있지만 중간 격벽이 연구의 주요 초점 경우,이 비교 방법은, 즉 장래의 연구에 가능하지 않을 수있다. 이 경우 각각의 동물 실험 조건의 역할을해야합니다. 따라서, 동물의 사용은 실험자의 판단에있다. 다섯째, 전류 주입 모델은 동작이 다른 리드 아웃에 사용될 수 있는가? 현재 Aβ 1-42 주입 모델을 채용 우리의 목적은 생체 내에서 Aβ 1-42의 신경 병리학 적 효과를 평가 및 시험 관내 결과 1로 비교하는 (도 1b 및도 2b)를 관찰 때문에 예를 들어, DG의 파괴는 의도하지 않은 행동 이상을 야기 할 수도있다. 연구는 해마 의존적 거동 Aβ 1-42의 효과를 검사가 필요한지 따라서 다음 사출 대상 해마 근처 재배치하기보다는 직접적으로 및 해마로 확산 Aβ 1-42를 허용 할 필요가있다. 즉, 동작 테스트에 대한 전류 주입 패러다임의 사용이 가능하고, 상기하지만 더 시험을 필요ING 및 특성, 및 최종 실험 전략은 최종 사용자에 의해 결정될 것이다. 흥미롭게도, 직접적으로 뇌의 Aβ 1-42 외부 납품 관련된 종래 설치류 행동 연구가 있었다. 22,30 함께 찍은, 이러한 제한이 모델을 이용한 생체 내 마우스 연구에서 설계 할 때 고려 될 필요가있다.
현존하는 단일 마우스 모델은 광고의 전체 병리학 적 효과를 포착하지 않기 때문에 정위 Aβ 1-42 주입 기술은 생체 Aβ 1-42 마우스 모델의 대안 실험자를 제공합니다. 잘 훈련 된 개인이 수행 할 때이 모델은 특정 뇌 영역 또는 회로에 Aβ 1-42의 효과에 초점을 맞춘 단기 연구에 가장 적합합니다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 신경 질환의 국립 연구소에 의해 지원과 뇌졸중 알츠하이머 병 연구 투자 노화 (CMT에) NS081333, 알츠하이머 협회 보조금 NIRG-10-171721과 (어에) 정신 건강 보조금 MH096702의 국립 연구소 및 국립 연구소를 부여했다 (YYJ과 JB에) 컬럼비아 대학 파일럿 부여 AG008702에서 센터.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine HCl (100 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg ketamine per 1 kg animal |
| Xylazine (20 mg/ml) | Henry Schein Medical | not available | 10 mg xylazine per 1 kg animal |
| Buprenex (0.3 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0.1 mg buprenex per 1 kg animal |
| Aβ1-42 | David Teplow/UCLA | not available | 100 μM; This amyloid was used in the paper |
| Aβ1-42 | Bachem | H-1368 | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Scrambled Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42 |
| NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) | Gift from William Klein/Northwestern U. | not available | 1:2,000 dilution |
| Anti-Amyloid Oligomeric Antibody (Polyclonal Rabbit) | EMD Millipore | AB9234 | May be used in place of Nu4; needs to be tested by the end user |
| 6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) | Biolegend | sig-39320 | 1:1,000 dilution |
| ChAT Antibody (Polyclonal Goat) | Millipore | AB144P | 1:100 dilution |
| DeadEnd Fluorometric TUNEL system | Promega | G3250 | Follow manufacturer's directions for use |
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Use when coverslipping slides |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | not available | 2% solution |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting |
| Novex 10-20% Tricine gel | Life Technologies | EC6625BOX | For separating Aβ1-42 |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | For running 10-20% Tricine gels |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol |
| Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels |
| GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Allergan | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | For sanitizing and disinfecting |
| Round/Tapered Spatula | VWR | 82027-490 | For opening animal mouth |
| Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6 mm; Length 28 mm) | Fine Science Tools | 18050-28 | Optional; For keeping scalp skin apart during injection |
| Straight Fine Scissors (Cutting edge 25 mm; Length 11.5 cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | For cutting scalp |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Surgical Blade | Fine Science Tools | 10011-00 | For making scalp incision |
| Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5x1.5 mm; Length 11.5 cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | For holding scalp closed during suturing |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | For shaving hair |
| T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | For warming animal during surgery |
| Resusable Warmining Pad (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery |
| Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Use 0.8 mm steel burrs to drill holes in the skull |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51615 | |
| Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730 | Can use this in place of Stoelting Cat. #51615 |
| Quintessential Stereotaxic Injector | Stoelting | 53311 | |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Stoelting | 50287 | For sterilizing stainless steel instruments |
| Sterile Surgical Drape (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
| Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | For brain injection; use different syringes for different solutions |
| 29 G Needle, Small Hub RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | For attaching to the Hamilton syringe for brain injection |
| 1 ml BD Tuberculin Syringes | VWR | BD309659 | For administering anesthesia and saline |
| 30 G Needle (0.5") | VWR | BD305106 | For administering anesthesia and saline |
| Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) | VWR | 65500-202 | For weighing animals to determine anesthesia dose |
| Hot plate (Top Plate Dims. 7.25x7.25 in) | VWR | 47751-148 | For warming animals post-surgery |
| Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | For closing wound |
| Vetbond Tissue Adhesive (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Optional: for aiding in wound closure; Use with suture. |
| Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators | Fisher scientific | 22-029-488 | For cleaning and drying surgical wound |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For collecting brain sections |
| VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | For mounting microscope slides |
| Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm | Fisher Scientific | 194-2520 | For sterilizing saline solution |
| Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | For marking coordinates on the skull |
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