Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Стереотаксическая Настой олигомерных бета-амилоида в гиппокампе мыши

Published: June 17, 2015 doi: 10.3791/52805
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2, 1,2,3
1Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University Medical Center, 2The Taub Institute for Research on Alzheimer's Disease and the Aging Brain, Columbia University Medical Center, 3Department of Neurology, Columbia University Medical Center

Abstract

Болезнь Альцгеймера является нейродегенеративных заболевание, поражающее старения населения. Ключ невропатологических признаком болезни является чрезмерно производство бета-амилоида и отложение бета-амилоида бляшек в мозге регионах пострадавших лиц. На протяжении многих лет ученые генерируется многочисленные модели болезни Альцгеймера мыши заболевание, которые пытаются повторить бета-амилоида патологии. К сожалению, мышиные модели только выборочно имитировать функции болезни. Гибель нейронов, выраженный эффект в мозге пациентов с болезнью Альцгеймера, заметно не хватает в этих мышей. Следовательно, мы и другие использовали метод непосредственно вливая растворимые олигомерные видов бета-амилоида - формы бета-амилоида, которые были доказаны, чтобы быть наиболее токсичным для нейронов - стереотаксически в мозг. В этом докладе мы используем мужчин C57BL / 6J к документу это хирургическая методика увеличения бета-амилоида уровней в избранной области мозга.Вливание цель зубчатой ​​извилине гиппокампа, поскольку эта структура мозга, а также в базальных отделах переднего мозга, который соединен с холинергической цепи, представляет собой одну из областей дегенерации в болезни. Результаты повышения амилоида-бета в зубчатой ​​извилине через стереотаксической инфузии выявить увеличение потерь нейронов в зубчатой ​​извилине в течение 1 недели, в то время как есть сопутствующее увеличение гибели клеток и потере нейронов холинергической в ​​вертикальном конечности диагональной полосы Брока в базальных отделах переднего мозга. Эти эффекты наблюдаются до 2 недель. Наши данные показывают, что нынешний настой модель амилоида-бета обеспечивает альтернативную модель мыши для решения конкретной региона гибель нейронов в краткосрочной перспективе. Преимущество этой модели является то, что амилоид-бета может быть повышен в пространственной и временной основе.

Introduction

Амилоида бляшек депозиты, которые состоят из бета-амилоида (Ар 1-42), являются ключевой особенностью патологии болезни Альцгеймера (AD). Многочисленные исследования показали, что высокие уровни токсичных или рекомбинантных олигомерные Ар 1-42 вызывают гибель нейронов, синаптическую дистрофия, потеря и дисфункции; а также обучения и памяти дефицита 1-4. Мозговые регионы, пострадавшие включают гиппокамп, кору, подкорковые структуры и такие, как базальных отделах переднего мозга и миндалины 5,6. На сегодняшний день существует несколько трансгенных моделей мыши, которые пытаются имитировать Ар 1-42 патологии эры. В зависимости от штамма эти животные оказаться полезным при рассмотрении выберите патологические особенности AD. К сожалению, за исключением 2 трансгенных линий, APP23 и 5XFAD, эти мыши не полностью повторить потерю нейронов, ключевой аспект нашей эры. Даже с потерей нервных наблюдается в APP23 и 5XFAD, гибель нейронов obserВЭД был тонкий, возраст зависит и изолированные на несколько отдельных регионах 7,8.

Прямое впрыскивание олигомерного Ар 1-42 в дикого типа мозга мыши обеспечивает превосходное в естественных условиях модели, которая повторяет гибель нейронов аспект amyloidopathy 1,9,10. В отличие от обычно используемых трансгенных мышах олигомерные Ар 1-42 настой модель идеально подходит для остро повышения Ар 1-42 уровней в пространственном и временном порядке. Преимущество использования мышей дикого типа для этой модели устраняет потенциальные компенсационные или побочные эффекты от мутаций, введенных в трансгенных линий мышей. Проведенные исследования показали, что вливание токсические уровни Ар 1-42 в гиппокампе вызывает гибель нейронов в непосредственной близости от места инъекции в течение 1 недели 1. Кроме того, в соответствии с наблюдением, что Ар 1-42 является токсичным для холинергических нейронов базального 11 переднего мозгахолинергические нейроны (BFCN) населения, который выступает в гиппокампе уменьшается на 20-50% в течение 7-14 дней после бета-амилоида инфузии 1,10 у мышей, позволяющий эффективно для экзаменов изолированной нейронной цепи в мозге. Так проекта BFCN ипсилатерально к зубчатой ​​извилине гиппокампа 12, по большей части управления / автомобиля и олигомерных Ар 1-42 решения могут быть введены по обе стороны мозга, позволяющей проводить сравнения между левым и правым полушариями 1.

В этом докладе мы будем предоставлять подробную хирургического и инъекции методологии взрослых дикого типа C57BL / 6J. Этот штамм мыши выбрана потому, что его широкого использования в научных исследованиях. Технически, любая область мозга могут быть направлены для инфузий, однако здесь мы будем использовать зубчатой ​​извилине гиппокампа в качестве цели для иллюстрации технику.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Для всех экспериментов на животных, последовали институциональные и национальные руководящие принципы по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Подготовьте Хирургические инструменты и решения для хирургии

  1. Автоклав из нержавеющей стали хирургических инструментов.
  2. Подготовка 70% этанола путем разбавления 200 доказательство абсолютного этанола стерильной молекулярная класса деионизированной дистиллированной воды.
  3. Прикрепите 29 G иглу шприца Гамильтона. Очистите внутреннюю Гамильтон шприца и иглы путем составления и извлечение наночистой воды неоднократно в течение 1 мин. Повторите эту процедуру с 70% этанола.
    1. Извлекают поршень и иглу от шприца Гамильтона. Воздух сухой части в капюшоне O / N ламинарного потока.
    2. Облучать иглу и шприц с ультрафиолетовым светом в течение 30 мин перед использованием.
  4. Приготовьте солевой раствор путем растворения NaCl в воде молекулярной класса до конечного веса с объемной концентрацией 0,9%. СтерилизационныеZE решение по фильтрации через 0,2 мкм поры фильтра.

2. Подготовьте олигомерных A & beta 1-42

  1. Monomerize и ресуспендируйте рекомбинантный человеческий Ар 1-42 в ДМСО до 5 мМ в точности, как описано в публикации Фа »и другие 13.
  2. Развести 5 мМ Ар 1-42 стерильной (1x) PBS до 100 мкм в день до операции.
  3. Смешайте раствор хорошо растиранием.
  4. Выдержите Ар 1-42 решение в течение 12 ч при 4 °.
    Примечание: Контрольные растворы, такие как разбавление ДМСО в PBS или омлет / назад Ар 1-42 пептида должны быть подготовлены так же, как Ар 1-42.

3. Определить инъекций Координаты

  1. Используйте мышь для взрослых атлас мозга, чтобы определить точное передне-задней (AP), медиальная-боковой (ML), и спинной-вентральной (DV), координаты области мозга интерес 14.
    НетTe: Чтобы проиллюстрировать технику мы выбрали зубчатой ​​извилине гиппокампа в качестве цели с координатами от темени: AP, -2.00 мм; Л., ± 1,3 мм; Д.В., -2,2 мм. Отрицательный знак перед значение AP указывает, что это 2,00 мм кзади от темени. ± знак перед значение ML указывает левую и правую направление от центра. Наконец, отрицательный знак, предшествующий DV указывает на то, вентрально движется от поверхности мозга.

4. стереотаксическая рамка установки

  1. Носите хирургическую маску, чистый халат и стерильные хирургические перчатки.
  2. Протрите стереотаксической инструмент и адаптер мыши с 70% этанола.
  3. Лягте стерильную хирургическую драпировка на прилавке.
  4. Поместите стереотаксической инструмент с адаптером мыши на верхней части стерильной хирургической простыне.
  5. Протрите мыши грелку с 70% этанола. Расположите грелку над стереотаксической рамы кровати. Используйте LABORA общего назначенияТори маркировочной лентой на ленту вниз грелку над адаптера мыши постели.
    1. Прикрепите грелку теплой воды рециркулятора насоса в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. Включите теплой воды рециркулятора насоса и установите температуру до 37 ° С, а затем ждать, пока он не достигнет температуры.
  6. Прикрепите 50 мкл Hamilton шприца с иглой 29 G на стереотаксической рамы путем завинчивания ее на моторизованной вертикальной инъекционного вала в соответствии с инструкциями изготовителя.
  7. Включите борта стерилизатора и подождите, пока он не достигнет заданной температуры производителя.
    Примечание: Эта функция используется для стерилизации инструментов из нержавеющей стали между животными. Это займет аппаратур 20 сек контакта с бисером для стерилизации.
  8. Включите горячей плите и установить его на 42 ° C и поместите чистый пустой клетке на вершине.
  9. В то время как шприц Гамильтона закреплен на стереотаксической рамы использовать моторизованный стереотаксической Injector составить 1-42 решение Ар.
    Примечание: рисовать более 4 мкл раствора в шприц, а затем использовать стереотаксической инжектор, чтобы установить громкость инъекционным. Используйте инжектор в соответствии с инструкциями изготовителя.

5. Подготовка животных

  1. Определите вес мыши с помощью шкалы взвесить.
  2. Обезболить мышь с кетамином / ксилазина коктейль в дозе 100 мг / кг кетамина и 10 мг / кг ксилазина путем инъекции внутрибрюшинно (IP). Монитор глубины наркоза потерей пальца щепоткой рефлекса.
  3. После мышь седативные взять машинку для стрижки волос и бритья ее голову подвергать кожу над черепом.
  4. Место мыши на верхней части грелку на верхней части стереотаксической кровати.
  5. Используйте лопаточку, чтобы открыть рот и поместите резцов внутри зубов охраны. Закрепите насадку для носа на лице мыши. Зажмите ее мягко и не слишком туго.
  6. Позитивция двусторонних ригели уха в слуховой проход, чтобы обеспечить голову. Перемещение каждого перекладину, пока она не достигнет череп, а затем поверните винт, чтобы зафиксировать ее.
    1. Чтобы убедиться, что головка закреплена использовать свой указательный палец, чтобы мягко надавите на голову. Если голова надежно закреплены не будет выдавать или переместить при нажатии.
  7. Нанесите каплю крема для глаз или глазные капли для глаз, чтобы держать их влажными. Убедитесь, что глаза влажные всей операции.
  8. Для дезинфекции хирургического сайта используйте стерильные ватные тампоны, чтобы применить бетадин решение кожи над черепом, с последующим 70% этанола. Выполните переменного бетадин и 70% этанола очистки еще 2 раза.

6. Настой хирургии и

  1. Используйте скальпель, чтобы сделать 2-3 мм разрез в средней линии головы, а затем использовать прямые тонкие ножницы, чтобы продлить разрез линии 1,0-1,5 см, чтобы разоблачить сагиттального шва, брегмы и лямбда черепа, ориентирс которым стереотаксической координаты на основе. Используйте микро зажимы, чтобы сохранить кожу друг от друга.
    Примечание: брегмы и лямбда позиции объясняется в мозг мыши атласа "мозг мыши в стереотаксической Координаты" 14.
  2. Возьмите ватный тампон, смочите его в стерильном физиологическом растворе, и использовать его для очистки череп. Затем, используя чистую сухую ватный тампон, чтобы высушить череп.
  3. Используйте стерильную порядке ручкой, чтобы отметить точку на темени. Использование стереотаксической микроманипулятора в положение шприца Гамильтона, так что кончик иглы не коснется точку на темени.
    1. Запишите Д.В. координат.
    2. Чтобы проверить, если ось AP черепа уровень перемещения шприца Hamilton кзади так, чтобы кончик иглы прикасается точку лямбда.
    3. Запишите положение DV. Убедитесь, что Д. координаты брегмы и лямбда находятся в 0,5 мм.
      Примечание: цель свести к минимуму разницу между DV брегмы и лямбда.
  4. Используй ихicromanipulator вернуть кончик иглы шприца Hamilton обратно в темя точкой.
  5. Запишите исходное положение AP.
  6. Рассчитать конечное положение AP путем вычитания 2,00 мм от исходного AP координат.
  7. Используйте микроманипулятор, чтобы переместить иглу шприца Hamilton в конечном AP координат.
  8. Запишите текущий ML координат.
  9. Рассчитать левый и правый конец ML координат путем сложения или вычитания 1,3 мм от начала ML координат.
  10. Используйте микроманипулятор переместить иглу шприца Hamilton либо координации заканчивая мл.
    1. Сенсорный кончике иглы к поверхности черепа по обе заканчивающиеся координат ОД и записывать координаты DV и убедитесь, что значения находятся в пределах 0,5 мм.
      Примечание: Цель состоит в том, чтобы свести к минимуму разницу в DV между ними, заканчивающийся ML координат.
    2. В то время как в концовке координации вытащить иглу 0,5-1 см по черепу. Возьмите стерильную порядке ручкой, чтобы отметить точку на гое поверхность черепа. Повторите этот шаг для противоположной стороны черепа.
  11. Качели Гамильтона шприц ясный из пути.
  12. Прикрепите 0,8 мм бурильную головку к тренировкам. Возьмите сверло с обеими руками, установите локти на поверхность стола для стабильности, и положение буровой головки немного выше шулер точка на Ваш влево или вправо ML координат. Активируйте дрель, снизить кончик сверла на поверхности черепа ввести отверстие в черепе. Повторите этот шаг для противоположной стороны.
    Примечание: Некоторые кровотечение может возникнуть из вновь введенных дырок. Если есть кровотечение, то используйте чистую сухим ватным тампоном, чтобы приложить кровь.
  13. Перемещение шприц Hamilton назад в положение над любой из вновь введенных отверстия мл. Опустите иглу Гамильтона просто мимо черепа. В этот момент будьте осторожны, чтобы не проколоть мозг. Чтобы убедиться, что игла прошла череп принять ваш указательный палец и аккуратно толкать иглу против черепа, чтобы сюре игла не выйти из отверстия.
  14. Запишите начиная Д.В. координат.
  15. Рассчитать заканчивая Д.В. координат путем вычитания 2,2 мм от исходного DV координат.
  16. Опустите иглу вниз в финале DV координат.
  17. Активация стереотаксической насос-форсунка к насосу 4 мкл Ар 1-42 в зубчатой ​​извилине в размере 0,5 мкл / мин.
  18. При инфузии завершения позволить иглы остаются на месте в течение дополнительного 1 мин, чтобы свести к минимуму обратного потока раствора из места инъекции.
  19. Перемещение иглы на другую сторону мозга и повторите шаги 6.13-6.18.

7. Животное Снятие и Послеоперационный

  1. Отвинтите уха баров и лицом / нос охранник. Отключив мышь от аппарата.
  2. Используйте студенческие стандартная схема щипцы, чтобы вытащить закрыть головы, а затем запечатать рану швом.
  3. Вводите 1 мл стерильного физиологического раствора в мыши через IP для гидратации.
  4. ВJect бупренорфин (0,1 мг / кг) подкожно, чтобы облегчить боль.
  5. Поддерживать мыши в пустую клетку чистой установленной на вершине 42 ° C плитке до тех пор, пока проснется, то вернуть его в клетку жилья с достаточным пищи и воды.
  6. Администрирование бупренорфин помощью подкожной инъекции каждые 12 ч в течение 3 дней для облегчения боли.

8. Шовный удаления

  1. Обезболить мышь с кетамином / ксилазина коктейль в 100 мг / кг кетамина и 10 мг / кг xlyazine по IP. Примечание: Это делается через 7-10 дней после операции.
  2. Используйте студенческие стандартная схема щипцы и прямо тонких ножниц для удаления шва.
  3. Вводите 1 мл стерильного физиологического раствора в мыши через IP для гидратации.
  4. Поддерживать мыши в чистом пустую клетку установленной на вершине 42 ° C плитке до тех пор, пока проснется, а затем вернуть его в клетку жилья с достаточным пищи и воды.

9. жертвоприношение животных и тканей Обработка

  1. Обезболить мыши и рerfuse его 4% параформальдегида 15, извлечь мозг, и обрабатывать его для cryosectioning 16.
    Примечание: сроки жертвоприношения животных зависит от экспериментатора. Тем не менее, для наших исследований мы выбрали 7 и 14 дней после операции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Настоящий способ получения рекомбинантного человеческого олигомерные Ар 1-42 дает растворимые олигомерных частиц, состоящих из мономеров, димеров, тримеров и тетрамеров (фиг.1А). Эти низким молекулярным весом Ар 1-42 видов, но не фибриллы и бляшки, были показаны в многочисленных настройках, наиболее токсичным для нейронов 1,4,9,17-19. Для определения Ар 1-42 индуцирует ли не олигомерные гибель нейронов в мозге мыши Ар 1-42 (4 мкл 100 мкМ раствора) вводили в ГД гиппокампа в одном полушарии 9-месячного дикого типа C57BL / 6J мышей. Вес гиппокампа для C57BL / 6J, по оценкам, около 0,018 г и, следовательно, доставка Ар 1-42 было примерно 100 мкг / г. Контралатеральной ГД же мозга мыши вводили раствором контроль / транспортного средства - которая состояла из равного объема ДМСО, используемого для растворения Ар 1-42 разбавляют в (1x) PBS - для сравнения. Как упоминалось ранее закодированным или обратного A & beta 1-42 пептид может быть использован в качестве контроля для сравнения, так как мы уже не нашли никакого эффекта на нейроны гиппокампа 1. Как введение иглы в мозг создает локальные повреждения тканей (рис 1B) и вызывает возможный крах DG мы решили выполнить после инъекции анализ прилегающих к инъекции тракта, где ткань еще цела. В течение 1 недели Ар 1-42 инъекций Д.Г. выставлены повышенные уровни Ар 1-42 в молекулярном слое и полиморфного слоя клеток в непосредственной близости от места инъекции (фиг.2А). В 7 и 14 дней Ар 1-42 вызвало увеличение положительного TUNEL-окрашивания и уменьшает толщину DG, подтверждающие нейродегенеративных последствий Ар 1-42 (фиг.2В).

Потому что BF холинергические нейроны проецируются на DGгиппокампа определяли дальше, если потеря нейронов в ГД вызывает дегенерацию BF. Для этого исследования ретроградная трассирующими fluorogold (2% суспензия) был одним впрыском вместе с Ар 1-42 в ГД. 7 дней после инъекции fluorogold был обнаружен в буфере (фиг.2с) предполагая ретроградного транспорта метки через холинергических нейронов. Таким образом, с целью количественного в BF мы выбрали fluorogold-позитивных нейронов, так как это означает, что нейронные клеммы подвергались Ар 1-42 в DG. В обоих 1 и 2 недель после ГД Ар 1-42 инфузий, ядро диагональной полосы - подобласть BF, где холинергические нейроны проецируются на DG - ипсилатеральная в -injected сайта Ар 1-42 выставлены увеличение окрашивания TUNEL и уменьшается в холинергических нейронов (рис 2D). Наблюдается потеря нейронов в BF подтверждает прошлые исследования, связывающие разрушительнойэффекты Ар 1-42 до BF-гиппокампа затрагивающего пути 1,10. Очень важно также отметить, что из сопоставления 2 недели момент времени до 1 недели момент времени на стороне ядра диагональной полосы, где решение для управления / транспортного средства вводили в ГД было дальнейшее увеличение окрашивания TUNEL и уменьшается в холинергических нейронов (рис 2D, таблица). Эти результаты отражают значительное снижение толщины GCL и увеличение TUNEL-положительных маркировки (фиг.2В, таблица) в ГД от транспортного средства стороны вводили в сравнении между 2 почтовых моменты времени впрыска, что означает, что физические травмы, вызванной иглы способствует дегенерации в течение долгого времени. Даже с этой нежелательным побочным эффектом иглы, нейродегенеративные эффекты Ар 1-42-прежнему значительно больше, чем у контрольного раствора / транспортного средства (рис 2D). Взятые вместе, ток настой модель effectivelу воспроизводит токсические эффекты Ар 1-42 в головном мозге мыши в течение 7 дней, делая этот привлекательный модель для изучения краткосрочной Ар 1-42 стимуляции.

Фигура 1
Рисунок 1. олигомерные Ар 1-42 подготовка и мозга мыши инъекции тракта визуализации. (А) 2 мкМ олигомерные Ар 1-42 разделяли на 10-20% трицин геле и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Мембрану смыл с Ар 1-42 антител 6Е10 (1: 1000). (Б) Ар 1-42 (4 мкл 100 мкМ раствора) или управления / транспортного средства вводили в левый и правый ГД гиппокампа, соответственно, 9 месяцев старых мышей C57BL / 6J. Мышей выжили в течение 7 дней. Мозги были последовательно срезы 20 мкм на секции. Гиппокампа срезы окрашивали DAPI. Хэш знаки изображаютинъекции тракта. Стрелки показывают рухнул DG. Шкалы представляет 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. олигомерные Ар 1-42 индуцирует гибель нейронов в DG и BF. Control / транспортное средство или Ар 1-42 (4 мкл 100 мкМ раствора) вводили в левый и правый ГД гиппокампа, соответственно, 9 месячных мышей C57BL / 6J мышей. Мышей выжили в течение 7 или 14 дней. Мозги были последовательно срезы 20 мкм на секции. (А) через 7 дней после инъекции гиппокампа срезах, окрашенных по Ар 1-42 (NU4 антитела, 1: 2000). Л., молекулярная слой; ВКТ, слой ганглиозных клеток; PCL, полиморфные слой клеток. Шкалы составляет 50 мкм. (В (С) Автомобиль или Ар 1-42 совместно вводили fluorogold (2% раствор). Fluorogold маркировки определяется в BF 7 дней после инъекции. Слайды, содержащие BF были случайным образом выбраны. Fluorogold маркировки была использована для определения области, представляющей интерес. После того, как область интереса была определена смежных срезах мозга были использованы для окрашивания на маркеры интерес. На вставках регионы, в которых изображения в (D) выбираются. Шкалы представляет 200 мкм. (D) 7 или 14 дней после инъекции BF срезах, окрашенных по чат (1: 100, козьи поликлональные) или TUNEL. *** Р <0,001 по сравнению с 1 недели. * Р <0,05 по сравнению с носителем. Количественное было сделано по всей областиинтерес. Граница между медиальной перегородки и диагональной полосы очерчена на основе расположения передней спайки. Шкалы составляет 100 мкм. (П = 5 мышей). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Для достижения успешного Ар 1-42 инъекции экспериментатор или хирург обязан: 1) использовать асептики; 2) правильно определить область мозга, интерес с точными координатами; 3) уметь правильно закрепить мышь в стереотаксической рамы с мозгом сравняли в АР оси и ML; 4) иметь возможность работать микроманипулятора с точностью; 5) обеспечить надлежащее послеоперационный уход. Если эти ключевые шаги будут Мышь должна пережить операцию без видимых инфекции.

В соответствии с в пробирке исследования, и мы, и другие показали, что Ар 1-42 непосредственно вливается в гиппокампе вызывает гибель нейронов 1,4,9,10, изображая одну из ключевых особенностей нашей эры. Дегенерации ясно видно в непосредственной близости от места инъекции, как показано уменьшилось в объеме зубчатой ​​извилине, что дополняется повышением маркеров дегенерации 1. Кроме того, тон холинергических нейронов, что проект в гиппокампе умереть в ретроградной моды, как показано уменьшением холинергической маркировки и увеличения TUNEL-положительное окрашивание в BF 1,10. Следовательно, эта модель в естественных условиях служит прекрасным примером для исследования полу-острые эффекты Ар 1-42 локально. Ключевым преимуществом этой модели является ее впрыска динамичный характер: любой регион мозга могут быть направлены и могут быть использованы различные животные в возрасте. 9 месячных самцов мышей были выбраны в наших экспериментах, потому что мы считаем, увеличение Ар 1-42 уровней в старых мышей более имитирует болезнь, которая возникает у пожилых людей. Кроме того, мы стремимся сохранить эксперименты согласуются с помощью мыши такого же возраста. Однако мыши, в любом возрасте может быть использован для инъекций. В прошлом мы экспериментировали на мышах, которые были 16 месяцев и другие использовали мышей, которые были 2 месяца 9,10. Только мышей мужского пола должны быть использованы в исследованиях, как женщина мышей выставочная ESTROКолебания уровня эстрогена и ген, как известно, нейропротекторное действие 20. Хотя многие научно-исследовательские центра интересов вокруг патологических эффектов Ар 1-42, есть также свидетельства того, что низкие или физиологические Ар 1-42 уровни необходимы для нормальной функции для обучения и памяти 21,22. В этих исследованиях исследователи опустил концентрация Ар 1-42 вводили и проникнуты его в гиппокампе 22,23, эффективно раскрывая еще один пример динамического характера полезности этой парадигмы. Другие соединения, которые были успешно переплетаются стереотаксически относятся препараты, вирусы, миРНК, антитела, пептиды и 1,22-26, чтобы исследовать различные эффекты, начиная от смерти клеток / выживания в поведении животных. Таким образом, существует множество приложений для использования этого настой парадигму.

Описанная методика инфузии, в то время как различные потенциалы экспонирования для v вИво изучает с помощью этой техники, а также поставляется с внутренними ограничениями. Во-первых, эта модель только пытается воспроизвести эффекты Ар 1-42 в изолированной области мозга. Во-вторых, место инъекции будет поврежден вследствие введения иглы в мозге. Это способствует дополнительной гибели клеток и глиозом. Таким образом, анализ должен быть выполнен от инъекции тракта. С соответствующим контролем транспортного средства на противоположной стороне той же мозг это не должно быть проблемой, как закачиваемой автомобиля и Ар 1-42 решения распространению в окружающие ткани. В-третьих, потому, что BF холинергические нейроны проецируются на гиппокамп, физическое повреждение гиппокампа как видно по развала DG иглой (рис 1B) может непреднамеренно убить несколько BFCNs. К счастью, рассматривая схему нейронов в краткосрочной перспективе - в течение 1 недели в однократной инфузии - не представляет проблемы, так как наши данные показывают, что увеличилсяхолинергическая смерть в базальных отделах переднего мозга является результатом Ар 1-42, а не от травмы иглой; управления инъекции обеспечить соответствующий анализ. Данные показывают, что вырождение DG также необходимо для потери BF холинергических нейронов, поскольку эти нейроны теряют свои синаптические целей (рис 2б). К сожалению, для животных, выживших до 2 недель транспортного средства вводят сторона показывает значительное повышение BFCN смерти более 1 неделю после инъекции животных транспортных средств, которые, как представляется, быть отчасти из-за дегенерации и истончению зубчатой ​​извилине в результате физической травмы в игла. Тем не менее, даже на этом этапе данные свидетельствуют есть значительно более смерть в BF ипсилатерального к -injected сайта Ар 1-42. В-четвертых, идентификации тонких анатомических границ может быть трудно достичь. Например, граница между медиальной перегородки и диагональной полосы была определена на основе расположения переднейспайки, метод, который был ранее описан 27. Кроме того, из-за ипсилатерального BF холинергической нейронной проекции - в основном от медиальной перегородки и вертикальной конечности диагональной полосы (МС / DB) - к зубчатой ​​извилине гиппокампа 12,28,29 мы решили придать одно полушарие с A & beta; 1-42 и использовать противоположную полушарие как контроль для сравнения. Вполне возможно, что забота о данной парадигмы будет надлежащая идентификация границы, разделяющей левую и правую MS / DB. В то время как мобильная станция находится в области средней линии, то блоки данных больше боковых. Для этого текущей работе и нашей последней публикации 1 мы смогли комфортно различать левую и правую DB. Наша количественная показывает Чат нейроны (+) уменьшить примерно на 25% в БД в Ар 1-42 -injected стороны. Тем не менее, мы не обнаружили каких-либо существенных изменений в чате (+) нейроны в MS 1. Из-за боковой LOCвания в БД и изменения наблюдаются мы чувствовали, были оправданы использовать транспортное средство и Ар 1-42 инъекций в пределах одного животного. Кроме того, тестирование 2 различные экспериментальные условия в той же животное не только максимально использовать животного, но также снижает потенциальную изменчивость животных к животному. В то время как наша экспериментальная конструкция позволяет сравнивать левое и правое полушария это возможно эта техника сравнение не может быть возможным в будущих исследованиях, то есть, если медиальной перегородка Основное внимание в исследовании. В таком случае каждое животное будет служить в качестве экспериментальных условиях. Следовательно, использование животных по усмотрению экспериментаторов. В-пятых, можно текущей модели инъекции использоваться для других для чтения выходами, таких как поведение? Наша цель в использовании текущий Ар 1-42 модель впрыска было оценить нейропатологические эффекты Ар 1-42 в естественных условиях и сравнить его с выводами в пробирке 1 (фиг.1В и 2В), когда мы нацелены на инъекционную иглу в или рядом с DG на 7 дней разрушение DG может привести к непредвиденным поведенческих нарушений. Следовательно, если требуется изучение изучения влияния Ар 1-42 на поведение гиппокампа-зависимой, то целевой инъекции, возможно, придется быть повторно вблизи гиппокампа, а не непосредственно в нем и позволить A & beta 1-42 диффундировать в гиппокампе. Тем не менее, использование существующей парадигмы инъекции для тестирования поведения возможно, но требует больше тестING и характеристика, и окончательное экспериментальная стратегия будет определяться конечным пользователем. Интересно, что было в предыдущих исследованиях поведения грызунов, которые вовлекают внешнюю доставку Ар 1-42 непосредственно в мозг. 22,30 Взятые вместе, должны быть учтены при проектировании в естественных исследованиях на мышах, использующих эту модель эти ограничения.

Поскольку ни одна модель мыши в существовании не захватывает полные патологические эффекты эры стереотаксической Ар 1-42 Техника инфузии обеспечивает экспериментаторов альтернативы в естественных условиях Ар модели 1-42 мыши. Когда осуществляется хорошо обученный человека эта модель лучше всего подходит для краткосрочных исследований, посвященных воздействию Ар 1-42 по конкретной области мозга или схемы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта предоставить NS081333 (для CMT), Альцгеймера грант Ассоциация NIRG-10-171721 и Национальный институт психического здоровья грантов MH096702 (для UH) и Национальный институт по проблемам старения, финансируемых исследований болезни Альцгеймера Центр Колумбийского университета пилот гранта AG008702 (в YYJ и JB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine HCl (100 mg/ml) Henry Schein Medical 1049007 100 mg ketamine per 1 kg animal
Xylazine (20 mg/ml) Henry Schein Medical not available 10 mg xylazine per 1 kg animal
Buprenex (0.3 mg/ml) Henry Schein Medical 1217793 0.1 mg buprenex per 1 kg animal
Aβ1-42 David Teplow/UCLA not available 100 μM; This amyloid was used in the paper
Aβ1-42 Bachem H-1368 Can be used in place of amyloid from the Teplow lab
Aβ1-42 American Peptide 62-0-80B Can be used in place of amyloid from the Teplow lab
Scrambled Aβ1-42 American Peptide 62-0-46B Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42
NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) Gift from William Klein/Northwestern U. not available 1:2,000 dilution
Anti-Amyloid Oligomeric Antibody  (Polyclonal Rabbit) EMD Millipore AB9234 May be used in place of Nu4; needs to  be tested by the end user
6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) Biolegend sig-39320 1:1,000 dilution
ChAT Antibody (Polyclonal Goat) Millipore AB144P 1:100 dilution
DeadEnd Fluorometric TUNEL system Promega G3250 Follow manufacturer's directions for use
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen P36935 Use when coverslipping slides
Fluorogold Fluorochrome, LLC not available 2% solution
Absolute Ethanol (200 proof) Fisher Scientific BP2818-4 For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting
Novex 10-20% Tricine gel Life Technologies EC6625BOX For separating Aβ1-42
Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) Life Technologies LC1675 For running 10-20% Tricine gels
Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) Life Technologies LC3675 For transferring 10-20% Tricine gels
SuperSignal Western Blot Enhancer Thermo Scientific 46640 For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol
Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm GE Healthcare Life Sciences 10402088 For transferring 10-20% Tricine gels
Xcell SureLock Mini-Cell Life Technologies EI0001 Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels
GenTeal Lubricant Eye Gel Novartis not available For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores
 
Name Company Catalog Number Comments
Refresh Optive Lubricant Eye Drops Allergan not available For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal
Betadine Stoelting 50998 For sanitizing and disinfecting
Round/Tapered Spatula  VWR 82027-490 For opening animal mouth
Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6 mm; Length 28 mm) Fine Science Tools 18050-28 Optional; For keeping scalp skin apart during injection
Straight Fine Scissors (Cutting edge 25 mm; Length 11.5 cm) Fine Science Tools 14060-11 For cutting scalp
#3 Scalpel Handle Fine Science Tools 10003-12
#11 Surgical Blade Fine Science Tools 10011-00 For making scalp incision
Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5x1.5 mm; Length 11.5 cm) Fine Science Tools 91100-12 For holding scalp closed during suturing
Trimmer Combo Kit Kent Scientific CL9990-1201 For shaving hair
T/Pump Warm Water Recirculator  Kent Scientific  TP-700 For warming animal during surgery
Resusable Warmining Pad (5" x 10") Kent Scientific  TPZ-0510FEA For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery
Cordless Micro Drill Stoelting 58610 Use 0.8 mm steel burrs to drill holes in the skull
Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor Stoelting 51615
Just for Mouse Stereotaxic Instrument Stoelting 51730 Can use this in place of Stoelting Cat. #51615
Quintessential Stereotaxic Injector Stoelting 53311
Dry Glass Bead Sterilizer Stoelting 50287 For sterilizing stainless steel instruments
Sterile Surgical Drape (18" x 26") Stoelting 50981
Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL Hamilton Company 7637-01 For brain injection; use different syringes for different solutions
29 G Needle, Small Hub RN NDL Hamilton Company 7803-06 For attaching to the Hamilton syringe for brain injection
1 ml BD Tuberculin Syringes VWR BD309659 For administering anesthesia and saline
30 G Needle (0.5") VWR BD305106 For administering anesthesia and saline
Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) VWR 65500-202 For weighing animals to determine anesthesia dose
Hot plate (Top Plate Dims. 7.25x7.25 in) VWR 47751-148 For warming animals post-surgery
Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm Covidien S1173 For closing wound
Vetbond Tissue Adhesive (3M) Santa Cruz Biotechnology sc-361931 Optional: for aiding in wound closure; Use with suture.
Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators Fisher scientific 22-029-488 For cleaning and drying surgical wound
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific  12-550-15 For collecting brain sections
VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm VWR 48393241 For mounting microscope slides
Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm Fisher Scientific 194-2520 For sterilizing saline solution
Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical Medline VIS1422SRL91 For marking coordinates on the skull

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baleriola, J., et al. Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions. Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).
  2. Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nature reviews. Molecular cell biology. 8 (2), 101-112 (2007).
  3. Knowles, J. K., et al. The p75 neurotrophin receptor promotes amyloid-beta(1-42)-induced neuritic dystrophy in vitro and in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (34), 10627-10637 (2009).
  4. Troy, C. M., et al. beta-Amyloid-induced neuronal apoptosis requires c-Jun N-terminal kinase activation. Journal of neurochemistry. 77 (1), 157-164 (2001).
  5. Crews, L., Rockenstein, E., Masliah, E. APP transgenic modeling of Alzheimer's disease: mechanisms of neurodegeneration and aberrant neurogenesis. Brain structure & function. 214 (2-3), 111-126 (2010).
  6. Gotz, J., Ittner, L. M. Animal models of Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Nature reviews. Neuroscience. 9 (7), 532-544 (2008).
  7. Calhoun, M. E., et al. Neuron loss in APP transgenic mice. Nature. 395 (6704), 755-756 (1998).
  8. Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
  9. Jean, Y. Y., et al. Caspase-2 is essential for c-Jun transcriptional activation and Bim induction in neuron death. The Biochemical journal. 455 (1), 15-25 (2013).
  10. Sotthibundhu, A., et al. Beta-amyloid(1-42) induces neuronal death through the p75 neurotrophin receptor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (15), 3941-3946 (2008).
  11. Kar, S., Quirion, R. Amyloid beta peptides and central cholinergic neurons: functional interrelationship and relevance to Alzheimer's disease pathology. Progress in brain research. 145, 261-274 (2004).
  12. Leranth, C., Frotscher, M. Organization of the septal region in the rat brain: cholinergic-GABAergic interconnections and the termination of hippocampo-septal fibers. The Journal of comparative neurology. 289 (2), 304-314 (1989).
  13. Fa, M., et al. Preparation of oligomeric beta-amyloid 1-42 and induction of synaptic plasticity impairment on hippocampal slices. Journal of visualized experiments : JoVE. (41), (2010).
  14. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Second edn, Academic Press. (2001).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. (65), (2012).
  16. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of visualized experiments : JoVE. (4), (2007).
  17. Jin, M., et al. Soluble amyloid beta-protein dimers isolated from Alzheimer cortex directly induce Tau hyperphosphorylation and neuritic degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (14), 5819-5824 (2011).
  18. Lambert, M. P., et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (11), 6448-6453 (1998).
  19. Masters, C. L., Selkoe, D. J. Biochemistry of amyloid beta-protein and amyloid deposits in Alzheimer disease. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 2 (6), a006262 (2012).
  20. Chakrabarti, M., et al. Estrogen receptor agonists for attenuation of neuroinflammation and neurodegeneration. Brain research bulletin. 109C, 22-31 (2014).
  21. Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
  22. Puzzo, D., et al. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (53), 14537-14545 (2008).
  23. Puzzo, D., et al. Endogenous amyloid-beta is necessary for hippocampal synaptic plasticity and memory. Annals of. 69 (5), 819-830 (2011).
  24. Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
  25. Fulmer, C. G., et al. Astrocyte-derived BDNF supports myelin protein synthesis after cuprizone-induced demyelination. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34 (24), 8186-8196 (2014).
  26. Thakker-Varia, S., et al. The neuropeptide VGF is reduced in human bipolar postmortem brain and contributes to some of the behavioral and molecular effects of lithium. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (28), 9368-9380 (2010).
  27. Greferath, U., et al. Enlarged cholinergic forebrain neurons and improved spatial learning in p75 knockout mice. The European journal of neuroscience. 12 (3), 885-893 (2000).
  28. Brashear, H. R., Zaborszky, L., Heimer, L. Distribution of GABAergic and cholinergic neurons in the rat diagonal band. Neuroscience. 17 (2), 439-451 (1986).
  29. Clarke, D. J. Cholinergic innervation of the rat dentate gyrus: an immunocytochemical and electron microscopical study. Brain research. 360 (1-2), 349-354 (1985).
  30. Garcia-Osta, A., Alberini, C. M. Amyloid beta mediates memory formation. Learning & memory. 16 (4), 267-272 (2009).

Tags

Неврология выпуск 100 бета-амилоида мозг мыши настой хирургия неврология
Стереотаксическая Настой олигомерных бета-амилоида в гиппокампе мыши
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jean, Y. Y., Baleriola, J., Fà, … More

Jean, Y. Y., Baleriola, J., Fà, M., Hengst, U., Troy, C. M. Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (100), e52805, doi:10.3791/52805 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter