Abstract
Enzymatische Mikro Biosensoren wurden weit verbreitet verwendet, um extrazelluläre Signalisierung in Echtzeit zu messen. Die meisten von ihr Einsatz zu Hirnschnitten und neuronalen Zellkulturen beschränkt. In jüngerer Zeit hat diese Technologie auf den ganzen Organen angewendet wurden. Fortschritte in der Sensordesign haben die Messung der Zellsignalisierung in durchbluteten Niere in vivo ermöglicht. Die vorliegenden Protokolle listen die erforderlichen Schritte, um ATP und H 2 O 2-Signalisierung in der Rattenniere Interstitium zu messen. Zwei separate Sensorkonstruktionen werden für die ex vivo und in vivo-Protokolle verwendet. Beide Sensortypen sind mit einer dünnen enzymatische Bioschicht auf einer Permselektivität Schicht überzogen, um schnell reagieren, empfindliche und selektive Biosensoren zu geben. Die Permselektivität Schicht schützt das Signal von den Interferenten in biologischem Gewebe, und die enzymatische Schicht die sequentielle katalytische Umsetzung von Glycerinkinase und Glycerin-3-phos nutztphosphat-Oxidase in Gegenwart von ATP, um H 2 O 2 zu produzieren. Der Satz von Sensoren für die Ex-vivo-Studien verwendet weiteren nachgewiesenen Analyten durch Oxidation von H 2 O 2 auf einer Platin / Iridium (Pt-Ir) Drahtelektrode. Die Sensoren für die in-vivo-Untersuchungen werden stattdessen auf die Reduktion von H 2 O 2 auf einen Mediator beschichteten Goldelektrode für bluteten Gewebe ausgelegt beruht. Endkonzentration Änderungen werden durch Echtzeit-Amperometrie gefolgt von Kalibrierung auf bekannte Konzentrationen des Analyten nachgewiesen. Zusätzlich kann die Spezifität des amperometrischen Signals durch den Zusatz von Enzymen wie Katalase und Apyrase, die unten H 2 O 2 und ATP entsprechend brechen zu bestätigen. Diese Sensoren stützen sich auch stark auf genaue Kalibrierungen vor und nach jedem Experiment. Die folgenden zwei Protokolle bauen das Studium der Echtzeit-Detektion von ATP und H 2O 2 in Nierengewebe, und kann weiter modifiziert werden, um die beschriebenen Verfahren zur Verwendung in anderen biologischen Präparaten oder ganzen Organen zu verlängern.
Introduction
Enzymatische Mikroelektroden-Biosensoren (auch als Sensoren in der vorliegenden Handschrift verwiesen wird) haben ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung dynamischer Signalprozesse in lebenden Zellen und Geweben. Die Sensoren liefern in biologisch relevanten Konzentrationen erhöhten zeitlichen und räumlichen Auflösung von Zellsignalmoleküle. Anstelle der Entnahme und Analyse extrazellulären Flüssigkeiten in Intervallen über einen langen Zeitraum angewendet, reagieren diese Sensoren so schnell ihre Enzyme reagieren mit dem Analyten, wodurch Echtzeitmessungen 1,2. Schnelle Erkennung von interstitiellen Konzentrationen von autokrinen und parakrinen Faktoren wie Purine oder Wasserstoffperoxid und die Dynamik ihrer Freisetzung kann verwendet werden, um ein Profil für die Wirkungen von Arzneimitteln in normalen und pathologischen Bedingungen 3 einzurichten. Derzeit haben die meisten Anwendungen mit Sensoren in der Hirngewebeschnitten und Zellkulturen 4-10 gewesen. Die in dieser Handschrift Ziel, ausführliche Protokollelegen die Mittel zur Echtzeit-Konzentrationen von Analyten in Voll Nieren genau zu messen.
Die folgenden Protokolle wurden entwickelt, um interstitielle ATP und H 2 O 2 Signalisierung in den Nieren zu untersuchen. In der natürlichen Umgebung der Niere wird die extrazelluläre ATP schnell von endogenen ectonucleotidases in seine Derivate (ADP, AMP und Adenosin) abgebaut. Die hier verwendeten Sensoren sind sehr selektiv, um ATP über andere Purine oder ATP-Abbauprodukte 11. Dies bietet einen großen Vorteil, denn sie ermöglicht eine genaue Überwachung der konstanten und dynamischen Konzentrationen von ATP-Freisetzung und ihre Signalfunktion. Interstitielle ATP-Konzentration wird unter Verwendung der Kombination von zwei Mikroelektroden, eine ATP-Sensor und einem Null-Sensor gemessen. Die Null-Sensor in Kombination mit Katalase-Anwendungen in der Lage ist interstitiellen H erkennen 2 O 2 -Konzentrationen 12. Die folgenden Protokolle verwenden zwei verschiedene Designs sensors, die Eigenschaften optimal für die beiden ex vivo oder in vivo-Anwendungen haben.
Beide Ausführungen beruhen auf dem sequentiellen katalytische Umsetzung von Glycerinkinase und Glycerin-3-phosphat-Oxidase in einer Sensorschicht enthalten enzymatische und wird durch die Anwesenheit von ATP angetrieben. In dem Satz von Sensoren in den ex-vivo-Studien verwendet werden, H 2 O 2, dem letzten enzymatischen Reaktionsproduktes durch Oxidation auf einer Platin / Iridium (Pt-Ir) Drahtelektrode detektiert. Sensoren für In-vivo-Studien sind stattdessen auf H auf einem Mediator beschichteten Goldelektrode durchbluteten Gewebes entwickelt auf der Basis 2 O 2 -Reduktion. In 1 ist ein Schema der beiden in dieser Handschrift beschriebenen Protokollen. Die Null-Sensor ist identisch mit dem entsprechenden ATP-Sensor, außer es die gebundenen Enzyme fehlen. Daher kann, zusätzlich zu der Erfassung des H 2 O 2 mit dem Enzym Katalase, die Null-Sensor mealeistet unspezifische Interferenzen. ATP-Konzentrationen werden durch Subtrahieren der Null erfaßt unspezifische Störungen und Hintergrund H 2 O 2 aus der ATP-Sensorsignal berechnet. Mehrere Sensoren sind ebenfalls im Handel erhältlich, um andere Analyte einschließlich Adenosin, ionosine, Hypoxanthin, Acetylcholin, Cholin, Glutamat, Glucose, Lactat, D-Serin für die ex vivo-Anwendungen oder Adenosin, ionosine und Hypoxanthin für in vivo zu detektieren, wenn in Kombination mit dem entsprechenden Null Sensors.
Die Fähigkeit des Sensors zur Analyten genau zu erfassen, hängt von der korrekten Vor- und Nach- Kalibrierungen 13. Dies stellt sicher, dass die Analyse berücksichtigt die Drift der Sensorempfindlichkeit, die beim Einsatz in biologischen Geweben auftritt. Der Sensor enthält ein Depot von Glycerin, das als Reagens bei der Sensor enzymatischen Reaktionen verwendet wird. Wenn der Sensor nicht in Badlösungen mit Glycerin verwendet wird, wird er im Laufe der Zeit ausgewaschen. Kürzere rufnehmen Zeiten sind dann notwendig, um die Sensordrift zu minimieren. Zusätzlich Sensor Bewuchs durch endogene Proteasen und Proteinfragmente können die Empfindlichkeit der Sensoren 14 stark vermindert.
Die vorliegende Manuskript stellt die Verwendung von Mikroelektroden enzymatische Biosensoren zur ex vivo und in vivo-Nieren Zubereitungen. Echtzeit-Analyt-Quantifizierung bietet beispiellose Detail der zellulären Signaltransduktion, die neue Einblicke in die Mechanismen von Nierenerkrankungen und pharmakologische Mittel zu offenbaren kann.
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Protocol
Folgende Tierverfahren im Rahmen der NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren eingehalten werden. Vorherige Genehmigung wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) erhalten.
HINWEIS: Lesen der Sensorherstellers soll während des Versuchs-Design und vor ihrer Verwendung erfolgen. Im Anschluss an diese Anweisungen werden optimale Ergebnisse zu erzielen, wenn Sie die Sensoren.
1. Sensorkalibrierung
- Frische Stammlösungen vor dem Beginn des Experiments.
- Erstellen Puffer A enthaltend 10 mM NaPi-Puffer, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 und 2 mM Glycerin. Den pH-Wert auf 7,4 unter Verwendung von NaOH. Bei 2-8 ° C.
- Mit Hilfe eines Aktien ATP-Konzentration (100 mM) bei -20 ° C gelagert werden, erstellen Sie einen frischen 10 mM ATP Kalibrierungslösung durch Zugabe von 10 & mgr; l Lager bis 90 & mgr; l Puffer A
- Rehydrieren die ATP-Sensor durch Anordnen seiner Spitze (2) in ter Rehydratisierung Kammer mit Puffer A für mindestens 10 min bei 2-8 ° C.
HINWEIS: Nach Rehydratisierung sollten die Sensoren nicht der Luft für mehr als 20 Sekunden ausgesetzt werden, oder die Empfindlichkeit des Sensors verringert werden. Wenn Langzeitbelichtungen, um Luft zu erwarten sind, tauchen Sie den Sensor kurz in eine Lösung von Glycerin. Die Sensoren können für mehrere Experimente verwendet werden, aber diese müssen auf dem gleichen Tag wie Sensor Rehydratisierung auftreten. Die Sensoren können in der Rehydratisierung Kammer mit Puffer A bis zu 24 Stunden gelagert werden. - Schalten Sie den Dual-Channel-Potentiostaten (Abbildung 3) und starten Sie die Aufnahme-System-Software.
- Eine Eichkammer mit 3 ml Puffer A Legen Sie die Referenz-Elektrode in die Eichkammer. Nehmen Sie jede Sensor aus der Rehydrierung Kammer, dann verbinden Sie es mit dem Manipulator und fügen diesen in die Kalibrierkammer Lösung.
HINWEIS: Verwenden Sie eine Standard-Silikon beschichtete Petrischale als Kalibrierkammer. Führen Sie alle Kalibrierungen und studies in einem Faradayschen Käfig auf einem Hochleistungslabor Lufttisch um das Signalrauschen während der Amperometrie-Aufnahmen (Abbildung 4) zu reduzieren. Kalibrierungen werden am besten so nah an den Beginn der Datensammlung wie möglich durchgeführt. Für die in vivo-Anwendungen der optimale Zeitpunkt für die Kalibrierung ist bei der Tier Erholung nach der Operation Zeitraum. - Ex-vivo-Kalibrierung
- Zuführen Cyclovoltammetrie in der Kalibrierungskammer durch zyklisches die Sensoren von -500 mV bis +500 mV mit einer Geschwindigkeit von 100 mV / sec für 10 Zyklen. Dies die Empfindlichkeit der Sensoren erheblich verbessert. Siehe Figur 5 für die aus den 10 Zyklen beobachtet Spuren.
- Polarisieren der Sensoren an +600 mV nach dem letzten Zyklus. Der Sensorstrom wird zu einer Asymptote zerfallen. Eine stetige Lektüre wird nach einem Minimum von 5 Minuten erreicht. Notieren Sie den Nullwert.
- In-vivo-Sensor-Kalibrierung
- Nicht die zyklische Voltammetrie auf die in vivo Senso auszuführenrs. Stattdessen polarisieren den Sensor in der Eichkammer 30 sec bis +500 mV. Setzen Sie dann die Potentiostaten auf 0 mV und lassen Sie den Sensorstrom zu einer Asymptote steigen. Der Sensorstrom ist mindestens 2 min auf Asymptote zu nehmen. Notieren Sie den Nullwert.
- Nacheinander hinzuzufügen Satz Mengen an ATP-Lösung in die Kammer, um eine Kalibrierungslinie umfasst eine gewünschte Erfassungsbereich zu erzeugen. Die ATP-Lösung erzeugt eine scharfe Spitze in dem Sensorsignal zunächst, gefolgt von einem Verfall wie der ATP diffundiert gleichmäßig in der Kammer. Nehmen Signalwerte, sobald der Signalpegel nach jedem ATP zusätzlich stabilisiert. 6A und 7 zeigen Spuren und schlug vor, ATP-Konzentrationen sowohl für ex vivo und in vivo Studien auf.
HINWEIS: Es ist wichtig, um die Selektivität der Elektroden mit Hilfe Fängern der Analyten zu bestätigen. Die vorliegende Protokoll Apyrase, um die Spezifität des ATP-Sensor und Katalase für die H <testensub> 2 O 2 Signal (6B). Wenn Medikamente verabreicht werden sollen, sollten Messungen ihrer Reaktivität mit den Sensoren vor der Untersuchung bestimmt werden. - In 3 ul Apyrase aus einem Vorrat von 2 mg / ml (89 UN / mg), um die Spezifität des ATP-Sensor (der Strom, der durch ATP-Anwendung hergestellt werden, sollten zu dem Null-Niveau (Abbildung 7) reduzieren zu testen.
- In 3 ul von Katalase aus einem Vorrat von 2 mg / ml (100 UN / mg), um die Spezifität der Null-Sensor (der Strom, der durch H 2 O 2 produziert Anwendung sollte auf den Nullwert zu reduzieren) zu testen.
2. Tierchirurgie für Sensor Studies
- Chirurgie für ex vivo
- Betäuben das Versuchstier mit Isofluran (5% Induktion, 1,5 bis 2,5% Wartung) / Klasse O 2 medizinische oder einer anderen zugelassenen Methode. 15 '12 Tiere müssen ständig überwacht werden, um ein angemessenes Niveau der Anästhesie zu gewährleisten. StLage Atemfrequenz und toe Prise Reaktion verwendet werden, um angemessene Betäubung bestätigen.
Hinweis: Euthanize das Tier nach anerkannten IACUC Protokolle. Bei Vollendung aller nicht überleben Verfahren euthanize tief narkotisierten Tieren durch Thorakotomie Induzieren Pneumothorax den humanen Tod des Tieres 12 zu gewährleisten. - Legen Sie die Ratte auf einem temperaturgesteuerten Operationstisch in Rückenlage. Und gleichzeitig eine angemessene Narkosetiefe, einen Mittellinienschnitt von ca. 5 cm im Einklang mit der linken Niere und setzen die distalen abdominalen Aorta.
- Wickeln Sie ein Ligatur um die Zöliakie und mesenterica superior Arterien und der Bauchaorta oberhalb dieser Arterien, aber nicht unterbinden. Wickeln zwei Ligaturen um die Bauchaorta unterhalb der Nierenarterien.
- Klemmen Sie die Bauchaorta oberhalb der Ligaturen. Binden Sie das untere Blattschraube. Katheterisierung der abdominalen Aorta mit Polyethylenschlauch (PE50). Sichern Sie den Katheter mit dem zweiten Aorta Ligatur.
- Entfernen Sie die Klemme und ligieren die mesenterialen und Zöliakie Arterien. Perfusion der Niere bei 6 ml / min mit Hanks Balanced Salt Solution bei RT für 2-3 min, bis die Niere vollständig blanchiert.
- Auszuschneiden der Niere und des Katheters verbundene Abschnitt der Aorta. Legen Sie die Niere in einen 3 ml Petrischale mit Bad-Lösung gefüllt.
Hinweis: Experiment-Protokoll kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Die Badlösung enthält in mM: 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl 2, 1 CaCl 2, 10 HEPES, pH 7,35 mit NaOH eingestellt.
- Betäuben das Versuchstier mit Isofluran (5% Induktion, 1,5 bis 2,5% Wartung) / Klasse O 2 medizinische oder einer anderen zugelassenen Methode. 15 '12 Tiere müssen ständig überwacht werden, um ein angemessenes Niveau der Anästhesie zu gewährleisten. StLage Atemfrequenz und toe Prise Reaktion verwendet werden, um angemessene Betäubung bestätigen.
- Chirurgie für In-vivo-
- Betäuben die Ratte mit zugelassenen IACUC Protokolle. Zur in vivo-Analyse betäuben die Ratten mit Ketamin (20 mg / kg im) und Inactin (50 mg / kg ip). Die Tiere müssen ständig überwacht werden, um eine angemessene Gabe von Betäubungsmitteln zu gewährleisten. Eine stabile Atemfrequenz und toe Prise Reaktion verwendet werden, um angemessene Betäubung bestätigen.
- Nach entsprechender Anästhesietiefe zu erhaltened, legen Sie die Ratte in Rückenlage auf einer temperierten geerdeten Oberfläche auf dem Lufttisch entfernt. Sollte die Oberfläche vorgewärmt und bei 36 ° C gehalten werden.
- Unter Beibehaltung richtige Narkosetiefe, stellen einen Mittellinienschnitt etwa 5 cm im Einklang mit der Niere.
- Verwenden eines Fadens abgelenkt und verankern die kutanen und subkutanen Gewebe, so dass die gesamte Niere sichtbar ist. Legen Sie die Niere in einer Niere cup, alle Bewegungsartefakte zu minimieren.
- Verwenden eine IV Infusion von 2% BSA 0,9% NaCl mit 1 ml / 100 g / h über die Jugularvene um das Blutvolumen aufrecht zu erhalten. Kanülieren beide Harnleiter zur Urinsammlung. Platz Krawatten um den mesenterica superior und Zöliakie Arterien und die distale Aorta für die Manipulation von renalen Perfusionsdruck (10A).
- Wenn die Anwendung pharmakologischer Mittel ist während der in-vivo-Experimente benötigt wird Einführen eines interstitiellen Katheter empfohlen (10B
3. Datenerfassung einrichten
- Öffnen Sie das Datenerfassungsprogramm und stellen Sie die Polarität sowohl für ex vivo und in vivo-Experimente an anodische Positive. Stellen Sie das Programm, um Daten als ASCII-Code zu speichern.
- Positionieren Sie die Mikromanipulatoren zum schnellen Einsetzen der Sensoren in die Nieren.
HINWEIS: Alternativ können Sie einen Dummy-Sonde mit dem Mikromanipulator angebracht, um zur Verwirklichung der gewünschten Anordnung von Sensoren. - Ex vivo Datenerfassungs-
- Perfusion der Niere mit Badlösung (ab 2.1.6) über den kanülierten Aorta bei einer konstanten Rate von 650 ul / min. Verwendung chirurgische Scheren, entfernen Sie vorsichtig die Nierenkapsel, die für Sensor Insertion erforderlich ist.
- Sichern die Niere mit Gummibändern über die Niere umreift und mit Silikon beschichteten Schale mit Stiften befestigt.
- Platzieren der Referenzelektrode in der Nähe der Niere in die Petrischale mit ihrer Spitze in Submersdie Pufferlösung.
- In-vivo-Datenerfassung
- Legen Sie die Niere in einer Niere Tasse. Je nach Belastung und Alter des Tieres mit einem Größe der Tasse, die die Niere locker hält. Abbildung 8 zeigt zwei Größen von Nierenschalen. Ähnliche Becher sind für verschiedene physiologische Ansätze auf der Analyse der Nierenfunktion fokussiert wie micropuncture etc 16 eingesetzt.
Anmerkung: Die Position der Nieren Schale ist entscheidend, um die mechanischen Geräusche durch das Tier erzeugte Atem zu entfernen, aber nicht stören oder blockieren Nierenperfusion oder Urinflusses. - Lassen Sie 45 Minuten Erholungszeit, bevor die Datenerfassung.
- Mit Hilfe eines 26-30G Nadel, machen Sie eine Einstichloch an der gewünschten Stelle und Tiefe des Sensors in der Niere. Tupfen Sie die Oberfläche Loch exsudiert Blut zu entfernen. Hinzufügen Glycerinlösung auf die Oberfläche der Niere. Dies wird die Nierenfläche vor dem Austrocknen während des Experiments zu verhindern. Entfernen Sie den ersten Sensor von der Rehydrierung Kammer und befestigen Sie es an den Mikromanipulator. Schnell, innerhalb von 20 Sekunden, legen Sie die Elektrode in die frisch erstellten Loch in der Niere. Die Schritte 3,5-3,9 für das Null-Sensor.
- Legen Sie die Referenzelektrode in die Niere, ca. 1 cm von der Sensoren.
- Legen Sie die Niere in einer Niere Tasse. Je nach Belastung und Alter des Tieres mit einem Größe der Tasse, die die Niere locker hält. Abbildung 8 zeigt zwei Größen von Nierenschalen. Ähnliche Becher sind für verschiedene physiologische Ansätze auf der Analyse der Nierenfunktion fokussiert wie micropuncture etc 16 eingesetzt.
- Einschalten des Potentiostaten und Aktivieren der Aufzeichnungsprogramm auf dem Computer, Fig. 9 zeigt die endgültige Konfiguration des ex vivo Nierendatenerfassung, Fig. 10 zeigt die endgültige Konfiguration des in vivo Nierendatenerfassung mit einem eingeführten Katheter.
4. Datenanalyse
- Importieren Sie die ASCII-Datendatei in Origin oder ähnliche Software.
- Konzentration aktuelle Verhältnis
- Verwenden Sie die lineare Anpassung / extrapolieren-Funktion, um eine lineare Konzentration (x-Achse), um Strom zu bauen (y-Achse) Beziehung für die ATP oder H 2 O 2 Kalibrierungspunkten (6 und 7).
linearen Ausgleichsgeraden: y = mx + b
- Verwenden Sie die lineare Anpassung / extrapolieren-Funktion, um eine lineare Konzentration (x-Achse), um Strom zu bauen (y-Achse) Beziehung für die ATP oder H 2 O 2 Kalibrierungspunkten (6 und 7).
- Gleichzusetzen, um die aktuelle Konzentration
- Subtrahieren der gemessenen Spuren des Nullsensor von denen der ATP-Sensor, um die tatsächliche durch intrazelluläres ATP erzeugten Strom zu erhalten.
- Konvertieren Sie die ATP-Werte in pA durch Amperometrie an nM unter Verwendung des Kalibrierungsgleichung in 4.2.1 beschrieben. Bestimmen Sie die Konzentration des subtrahiert Datenspur des ATP-Sensor durch den Import jedes eingestellten Strom in den "x" -Wert und Auflösen nach y (die Konzentration des Analyten).
- Genauso werden H 2 O 2 -Konzentration von seinem Kalibrierungsgleichung, wenn nötig.
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Representative Results
Das Design der enzymatischen Mikroelektroden-Biosensor ermöglicht die Echtzeit-Detektion von Analyten in ganzen Nieren. Die allgemeinen Versuchsplanung für die beiden ex vivo oder in vivo-Studien in 1 .Die verwendeten Sensoren veranschaulicht und die chirurgischen Verfahren davon ab, ob die Studie je ist ex vivo oder in vivo.
Um reproduzierbare Ergebnisse, präzise vor und nach der Kalibrierung zu erhalten, sind kritisch. 6A zeigt eine repräsentative Spur des Signals von der ex vivo ATP Sensor während Kalibrierungen gesehen. Beachten Sie, dass Apyrase schnell beseitigt die ATP-Signal. Katalase hatte keinen Effekt auf das ATP-Signals und zeigt seine Spezifität für das H 2 O 2 schafft (6B). Die Kalibrierung ergibt eine lineare Passform, die verwendet werden, um den dynamischen Veränderungen des ATP (6A, rechts) zu berechnen. In vivo Sensorkalibrierung erzeugt ein ähnliches Spuren derjenigen der ex vivo-Sensor. Erkennt jedoch dieser Sensor statt oxidative Ströme reduktive und als solche erzeugten Stroms negativ ist. Kalibrierung dieser Sensoren produziert auch eine lineare Anpassung in einer 0,3 bis 80 um Bereich (7A rechts). Spezifität in vivo-Sensor zu ATP über andere Purin Produkte ist in 7B gezeigt.
Der hier beschriebene Ansatz ermöglicht es uns, sowohl die basale Konzentrationen endogener Substanzen und akute Veränderungen als Reaktion auf Arzneimittelinfusions 12 zu messen. Dargestellt in Figur 11 sind Ang II-induzierte Veränderungen der interstitiellen endogene Konzentration von H 2 O 2 in salzbeständige und salzsensitiven Ratten. Für diese Experimente wurden frisch isolierte Niere von Sprague Dawley (SD) oder salzsensitiven Dahl (SS) Ratten, die mit 1 & mgr; M Ang II unter konstanten laminaren Strömung (650 & mgr; l / min) perfundiert. Wie shown in 11 Ang II induziert die akute Freisetzung von H 2 O 2 in Nieren von SD und SS Ratten. Jedoch war die maximale Amplitude jedes Antwort signifikant SS Ratten erhöht, insbesondere wenn die Tiere mit einer hohen Salzdiät 12 zugeführt. Dargestellt in Figur 12 ist eine repräsentative Anwendung der Biosensoren in vivo. Die Infusion von Katalase (5 ug / ml) blockiert vollständig die H 2 O 2 durch den Biosensor detektierten Signals. Diese Experimente veranschaulichen die Verwendung von spezifischen enzymatischen Biosensoren kombiniert mit der amperometrische Technik zur Detektion der Grundspiegel von körpereigenen Stoffen und Echtzeit-Messungen ihrer Freisetzung als Reaktion auf pharmakologische Intervention. Weitere Anwendungen dieser Ansatz die Rolle des purinergen Signalisierung und Wasserstoffperoxid zu studieren, wird unser Wissen und Verständnis für Nierenerkrankungen wie Salz empfindlicher Hypertonie zu verbessern, Nieren oxidative Stress und chronische Nierenerkrankungen.
Abbildung 1. Schematische der Protokolle. Kalibrierung mit Analyten von Interesse und Prüfung seine Spezifität wird unmittelbar vor Beginn der Experimente durchgeführt. Die in vivo-Protokoll sollte für komplexe physiologische Experimente und ex vivo pharmakologische Anwendungen folgen. Beitrag Experiment Kalibrierung sollte getan werden, und während der Datenanalyse berücksichtigt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Enzymatische Mikroelektroden-Sensor. Die beidenSensorgrößen für ex vivo Anwendungen verwendet werden, gezeigt wird, 50 & mgr; m und 125 & mgr; m Durchmesser. Jede Sensordraht erstreckt sich in ein Kapillarrohr auf ein Gold Endverbinder zu verbinden (nicht gezeigt). Einschub zeigt eine Sensorspitze mit Enzymen für die ATP-Detektion beschichtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 3. Dual Channel Potentiostat. Der Potentiostat Kanäle markiert CH1 und CH2. 1) CH1 der ATP-Sensoranschluss und 2) CH2 die Null Sensoranschluss 3) Verbindungen, die elektrisch mit der Referenzelektrode verbunden sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Figur 4. Sensor-Setup. Die Datenerfassung wird in einem Faradayschen Käfig, um elektrische Störungen zu reduzieren und auf einem leistungsfähigen Labortisch für eine vibrationsfreie Arbeitsfläche durchgeführt. 1) Ein temperaturgesteuerter Operationstisch verwendet wird, um Tierkörpertemperatur während physiologische Experimente 2 zu erhalten) die Mikromanipulatoren werden bei Versuch 3) ist eine Lichtquelle für chirurgische Eingriffe und Einsetzen des Sensors 4 werden für Magnethalterungen für flexible Positionierung der Sensoren angebracht ) Dual-Channel-Potentiostaten 5) Halter für die Sensoren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 5. Cyclovoltammetrie. Für die Ex-vivo-Studien, Sensor Cyclovoltammetrie ist für 10 Zyklen zwischen -0,5 und 0,5 V vor der Kalibrier-Protokoll durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 6. Amperometrie Kalibrierung für die ex vivo. (A) Kalibrierung verwendet die Zugabe einer bekannten ATP-Konzentrationen der Badlösung. Entsprechende Sie den Asymptote Niveau (schwarze Kurve) aufgezeichnet amperometrischen Werte. Die erhaltenen Ströme erzeugen eine Kalibrierungsgleichung. Ein Beispiel ist auf der rechten Seite angezeigt. Die rote Kurve ist das current des Null-Sensor, der nur die Zugabe von H 2 O 2 reagiert. (B) Die Null-Sensor wird mit der Zugabe von bekannten H 2 O 2 Konzentrationen (rote Pfeile) in das Bad-Lösung und der Asymptoten amperometrischen Werte erfasst werden (dünne schwarze Pfeile) kalibriert. Die Zugabe von Katalase zu der Badlösung (dicker schwarzer Pfeil) führt zu schnellen Stromabfalls. Das rechte Bild zeigt die Null-Sensorkalibrierung Gleichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 7. Amperometry Kalibrierung für.; In Vivo Kalibrierung der in vivo-Elektroden ist in einer ähnlichen Weise zu dem detailliert in den ex-vivo-Studien durchgeführt mit der Ausnahme, Reduktionsreaktionen verursachen einen Rückstrom (Polarität). (A) Der Zusatz von bekannten ATP-Konzentrationen erzeugt ein amperometrischer Strom auf der ATP-Sensor (schwarze Kurve), hat aber keinen Einfluss auf die Null-Sensor (rote Kurve). Zusatz von Apyrase löscht den Strom des ATP-Sensor. (B) Die Spezifität der ATP-Sensor wird durch die Zugabe von 10 & mgr; M von unterschiedlichen purinergen Mittel (UTP, UDP und Adenosin) bestätigt. Weitere Anwendungen der ATP eine stabile nachweisbaren amperometrischer Strom. (C) Mikrophotographie der in vivo-Sensoren auf der Basis eines Mediators beschichteten Goldelektrode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses figu ansehenre.
Abbildung 8. Nieren-Cups. In den in-vivo-Untersuchungen, die Nieren sind gehalten immer noch mit den gezeigten Stahlnierenbecher aus Edelstahl. Zwei Größen von Tassen werden verwendet, um Nierengrößenvariation unterzubringen. Diese Becher Reduzierung der Bewegungsartefakte, die durch das Tier die Atmung erzeugt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 9. Ex vivo isolierten und perfundierten Nieren. Die isolierte Niere wird in einen 1) Petrischale mit einer Dicke von Si beschichtet istlicone Unterseite für Stifteinfügungs 2) die Nierenarterie während Experiments 3) die ATP Sensor kanüliert und mit einer Spritzenpumpe bei konstanter Perfusion angebracht ist, 4) und Null-Sensor in der Niere 5) die Referenzelektrode in der Nähe der Nieren versenkt eingesteckt in das Bad-Lösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 10. In Vivo blutetes Niere. (A) Die linke Niere freigelegt und in einer Niere Becher gegeben, bleibt die rechte Niere intakt innerhalb des Tieres. Beide Sensoren werden in die Niere vorgeschoben. BSA: NaCl wird über den Katheter Halsschlagader infundiert, um entgegen der Flüssigkeitsverlust verursacht by der großen Mittellinienschnitt (B) Beispiel für die in vivo-Versuch mit einem implantierten interstitielle Katheter zur direkten pharmakologischen Anwendungen 1) die Niere von einer Nierenbecher 2) ATP Sensor 3) Null-Sensor und 4) Referenzelektrode gehalten werden eingefügt in der ventralen Oberfläche der Niere 5) Katheter in die Niere implantiert und mit einer Schlauchpumpe für laminare pharmakologische Infusionen angeschlossen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 11. Ex-vivo-Analyse von H 2 sub> O 2 in der Niere. Ang II Perfusion verursacht H 2 O 2 Release im Rattennierenrinde. (A) in Echtzeit Veränderungen der mittleren H 2 O 2 -Konzentration (graue Balken zeigen Standardfehler) von insgesamt N = 8-Anwendungen (4 Nieren aus 4 verschiedenen Ratten). Balken am oberen darstellen Ang II-Anwendung. (B) Die maximale H 2 O 2 -Konzentration Amplitudenwerte während Ang II Perfusion für Sprague Dawley (SD) und Dahl Salz-sensitive (SS) Ratten, eine niedrige und hohe Salzdiäten sind. * - P <0,05 im Vergleich zu SD-Ratten. Die Figur ist aus Referenz 12 mit Genehmigung angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 12: In-vivo Analyse von H 2 O 2. Beispiel für die in vivo-Beurteilung der interstitiellen H 2 O 2 -Konzentration in der Medulla eines SS Ratte eine salzarme Diät gefüttert (wie in 10B gezeigt). Die interstitielle Anwendung Katalase über einen implantierten Katheter 5 min Intervalls erzeugt eine vollständige Blockade des H 2 O 2 -Signal im Nierenmark. Reduktion von Katalase aus Auswaschen von Nierendurchblutung, führte zu einer teilweisen Erholung des Signals, die durch eine zusätzliche Anwendung Katalase (10 min) wieder gesperrt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die vorliegenden Protokolle wurden entwickelt, um eine verbesserte zeitliche und räumliche Auflösung der ATP bereitzustellen und H 2 O 2 Signalisierung für ex vivo isolierten, perfundierten und in vivo durchbluteten Niere. Die Differenzen zwischen den Protokollen und den hier verwendeten Sensoren liefern eine optimale Datenerfassung entweder für pharmakologische Mittel oder physiologische Studien. Protokolle bestehen aus 1) Sensorkalibrierung, 2) chirurgische Verfahren, 3) Datenerfassungseinrichtung, und 4) Datenanalyse. Sie ermöglichen die Echtzeit-Messungen von Analyten für verschiedene Versuchsbedingungen. Dies wird zu mehr Einblicke in Nierenerkrankungen und die Entwicklung wirksamer pharmakologische Behandlungen führen. Hier verwendeten wir die Sensoren an ATP und H 2 O 2 zu analysieren. Es sind jedoch auch Sensoren für andere Substanzen ebenfalls verfügbar und können verwendet werden. Die hier beschriebenen Protokolle wurden verwendet, um ATP und H 2 O 2 in Rattennieren zu untersuchen, aber die gleiche method kann leicht für die Anwendung bei Mäusen angepasst werden. Somit hat dieser Ansatz ein großes Potenzial angesichts der Fülle der genetischen Nagetiermodellen.
Der Grundaufbau des enzymatischen Mikroelektroden-Biosensoren wurde in den 1960er Jahren von Clark und Lyons 2 entwickelt. Nach der anfänglichen Entwicklung von Biosensoren, haben Fortschritte in Design 17-19 und Anwendungen 20 vorgenommen. Llaudet et al. 21,22 entwickelte das Prinzip Design der ATP-Sensoren in den vorliegenden Protokollen, während mit Methoden aus Cosneir et al. 23 für das Enzym Beschichtung verwendet. Diese Sensoren haben ATP-Signalisierung in einer Reihe von physiologischen Prozessen einschließlich ATP-Freisetzung aus Gehirnastrozyten 8. Regulierung der Atmung 4,24 und Skelettmuskel arteriole Verordnung 25 festgestellt. Kürzlich wurde das ex vivo-Protokoll wurde verwendet, um ATP-Signalisierung in der Niere 12 zu messen. Das Ziel dieses Manuskript is den Wirkrichtungen und Erkenntnisse zum Nachweis von endogenen Substanzen, wie ATP in den Nieren ist.
Enzymatische Biosensoren Mikroelektroden haben viele Vorteile gegenüber bestehenden Mittel zur Messung von Analyten in vivo. Allerdings sollten spezielle Vorkehrungen für diese Vorgehensweise wie für jede andere neue Verfahren verwendet werden. Validation mit einem etablierten Ansatz bietet das Vertrauen in die erhaltenen Daten. So wurden beispielsweise die Mikrodialyse Messungen durchgeführt, wie zuvor beschrieben, 26,27. Kein signifikanter Unterschied zwischen den Spitzenkonzentrationen von den Sensoren und den aus den Dialyse Proben 12 erhalten wurde beobachtet. Die Begrenzung der Mikrodialyse ist, dass es misst nur stationäre Ebenen der Analyten. Als solche kann die Beurteilung der dynamischen Veränderungen der Zellsignalisierung nur mit der Verwendung von enzymatischen Biosensoren Mikroelektrode erreicht werden. Die Manufaktur Spezifikationen der Sensorantwortzeiten unterscheiden zwischen SensorTypen. Ex-vivo-Sensoren haben eine Reaktionszeit von 5-10 sec und in vivo Sensoren von 30-35 s für den Signalanstieg von 10 bis 90%. Die Kalibrierungsspuren (6 und 7) zeigen die Zeitauflösung von Analyten Hinzufügen / Entfernen. Sowohl für den Sensor und die Mikrodialyse Ansätzen wird die Verwendung von spezifischen Enzymen, die von Analyten erzeugte Signal Block benötigt, um Spezifität zu garantieren.
Die beschriebenen Protokolle haben einige Herausforderungen. Wie bei jedem Sensor Einsetzen in Gewebe, hat Gewebeschäden auftreten. Dies könnte Signalwegen, die die Messungen 28 beeinflussen können, zu aktivieren. Um die Zellschäden zu minimieren, würden dünnere Sensoren benötigt werden. Es ist jedoch schwierig, die Nierenkapsel mit den Sensoren eindringen, so Nadeln verwendet werden, um eine kleine Eintrittsloch vorzunehmen. Thin-Sensoren sind eher zu biegen und zu stören ihre Beschichtung auf Einfügen. Größeren Durchmesser Sensoren sind widerstandsfähiger Biege und die resultant Schäden an ihren Beschichtung. 3 zeigt eine dünne und dicke Sensor. Neben den Widerstand des Dick Sensors zum Verbiegen, enthalten sie eine dickere Schicht der Beschichtung stärkeren Schutzes für die enzymatische Schicht. Die Sorge von Gewebeschäden durch Verwendung dicker Sensoren verursacht war deutlich weniger in den Nieren, als es im Hirngewebe sein. Die Einfuhrtiefe beträgt angenähert und endgültige Platzierung sollte überprüft, nachdem Messungen an der Niere abgeschlossen sind. Schätzung zwischen Rinde und Mark Schichten mit Hilfe der Sensorspitze Länge als Einführungsführung und ist ausreichend, da die Sensorspitze beträgt 0,5 mm und der Nierenrinde ist 2-3 mm dick. Verschmutzung des Sensors erfolgt auch mit einer größeren Geschwindigkeit im Blut, wodurch der Sensor die Verwendung in langen in vivo-Protokolle einschränkend einem Experiment. Aufzeichnungszeiten von 1 bis 1 ½ Stunden führte nur zu einer kleinen Sensordrift. Die wichtigsten Kriterien bei der Beurteilung der reduzierten Sensorleistung ist die geringe Empfindlichkeitan den Analyten im Kalibrierungsprozess. Erhöhte elektrische Rauschen und Instabilität der Basisstrom kann auch anzeigen, dass die Sondenspitze beschädigt wird. Für genaue Messungen der ATP, sollten beide Sensoren (ATP und Null) ähnlich Lärm und Stabilitätseigenschaften für weitere Subtraktion des Signals haben. Andernfalls einer der Sensoren ersetzt werden sollte. Für niedriges Geräusch und den Nachweis von geringen Konzentrationen an Analyten ist die Verwendung neuer Sensoren für jedes Tier vorgeschlagen.
Mehrere Schritte sind entscheidend für die erfolgreiche experimentelle Ergebnisse. Die Sensoren sind sehr empfindlich und müssen sorgfältig behandelt werden, um eine Beschädigung der Sensorspitze. Auch kann nach der Rehydratisierung sollten die Sensoren nicht der Luft für mehr als 20 Sekunden ausgesetzt werden. Für die erfolgreiche Detektion von biologischen Signalen im Gewebe geringe Geräuschaufnahmen erforderlich. Zu diesem Zweck ist ein High-Performance-Labor Lufttisch und ordnungsgemäße Erdung erforderlich. Der Zusatz von exakten Mengen des Analyten during die Kalibrierungsschritte ist für eine genaue Konzentrationsbestimmung in Experimenten notwendig. Erreichung eines guten Clearing von der Niere in ex vivo Nierenoperationen wird in erfolgreiche Aufnahmen führen. Die Verwendung von Enzymen Apyrase und Katalase in Kalibrierungen und in Experimenten erlaubt die Beurteilung der Sensor unspezifische Empfindlichkeit und bestätigt die Messungen.
Diese Protokolle bieten stark verbesserte Detail der extrazellulären Signalisierung in den Nieren. Die verbesserte Empfindlichkeit und Zeitauflösung durch die Sensoren, gewährt wird, ermöglichen es uns, Veränderungen in der ATP-Signalisierung bei Krankheitszuständen und folgenden pharmakologischen Manipulation, die zuvor nicht nachweisbar waren zu lösen. Die in vivo-Protokoll ist für eine komplexe physiologische Studien gut geeignet, während ex vivo optimal für die Untersuchung der pharmakologischen Anwendungen auf Nieren. Das Design der In-vivo-Sensor verwendet hier ermöglicht beispiellosen Widerstand gegen Einmischung in blood durchbluteten Gewebe. Zusammengenommen werden, bieten diese Sensoren eine große Menge von Anwendungen, die zuvor mit bestehenden Protokollen und Techniken nicht möglich waren.
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Disclosures
Sensoren für die Videoaufzeichnung dieser Handschrift wurden von Sarissa Biomedical Limited (Coventry, UK) zur Verfügung gestellt.
Acknowledgments
Wir schätzen Sarissa Biomedical für ihre Arbeit bei der Entwicklung der in der vorliegenden Manuskript verwendeten Sensoren. Diese Forschung wurde von der National Heart, Lung unterstützt, and Blood Institute gewährt HL108880 (A. Staruschenko), HL 116264 (A. Cowley) und HL 122662 (A. Staruschenko und A. Cowley), ein Projekt des Medical College of finanziert Wisconsin Komitee Forschung Angelegenheiten # 9306830 (O. Palygin) und Vorschieben eines gesünderen Wisconsin Forschungs- und Ausbildungsprogramm # 9520217, und das Young Investigator Grants des National Kidney Foundation (O. Palygin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensor Kit | Sarissa Biomedical | SBK-ATP-05-125 | The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes. Also included with the kit is the user's choice of sensors. |
| Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-ATP-05-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold ATP Biosensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-ATP-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe null sensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-NUL-20-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold null sensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-NUL-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe ATP Manual | Sarissa Biomedical | http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf | |
| Faraday cage | TMC | ||
| Dual channel potentiostat | Digi-Ivy | DY2021 | Type II Faraday cage |
| Data acquisition program | Digi-Ivy | DY2000 | |
| Perfusion pump | Razel Scientific Instruments | Model R99E | |
| Fiber optic illuminator | Schott | ACE 1 | |
| micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-8 | |
| air table | TMC | 63-500 | |
| isoflurane ventilator | LEI Medical | M2000 | |
| 3 ml petri dish | Fisher Scientific | S3358OA | |
| needle | Santa Cruz | 26-30 G | |
| pins | Standard dissection pins | ||
| catheter | Polyethylene tubing (PE50) | ||
| catheter tissue glue | Vetbond | 1469SB | |
| suture | Look | SP117 | |
| rubber bands | any 2-4 mm wide rubber bands | ||
| silicone | Momentive | RTV-615 Clear 1# | |
| clamp | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| standard dissection kit | Kit should include scalpel and dissection sissors | ||
| Kidney Cup | Of own design | ||
| standard chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | 100 mM ATP solution |
| hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A7646 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| isoflurane | Clipper | 10250 | |
| inactin | Sigma-Aldrich | T133 | |
| ketamine | Clipper | 2010012 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 |
References
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