Abstract
Enzymatiske microelectrode biosensorer har vært mye brukt til å måle ekstracellulære signal i sanntid. Det meste av deres bruk har vært begrenset til hjerneskiver og neuronal cellekulturer. Nylig har denne teknologi blitt brukt i hele organer. Fremskritt i konstruksjon sensor har muliggjort måling av cellesignalisering i blod-perfusert in vivo nyrer. De foreliggende protokollene liste de nødvendige trinnene for å måle ATP og H 2 O 2 signale i rotte nyre interstitium. To separate sensor utførelser anvendes for ex vivo og in vivo-protokoller. Begge typer sensor er belagt med et tynt enzymatisk biolag på toppen av et lag permselektivitet for å gi hurtig responderende, følsom og selektiv biosensorer. Den permselektivitet laget beskytter signal fra den interfererende i biologisk vev, og den enzymatiske sjikt benytter den sekvensielle katalytisk omsetning av glyserol kinase og glycerol-3-Phossulfat oxidase i nærvær av ATP for å fremstille H 2 O 2. Settet av sensorer som brukes for ex vivo-studier ytterligere analytt detekteres ved oksydasjon av H 2 O 2 på en platina / iridium (Pt-Ir) trådelektrode. Sensorene for in vivo studier er i stedet basert på reduksjonen av H 2 O 2 på en mediator belagt gull-elektrode konstruert for blod-perfusjon vev. Sluttkonsentrasjon endringer blir detektert ved sanntid amperometry etterfulgt av kalibrering med kjente konsentrasjoner av analytten. I tillegg kan spesifisiteten av amperometrisk signalet bekreftes ved tilsetning av enzymer slik som katalase og apyrase som bryter ned H 2 O 2 og ATP tilsvarende. Disse sensorene også avhengige av nøyaktige kalibreringer før og etter hvert forsøk. De følgende to protokoller etablere studiet av sporing i sanntid av ATP og H 2O 2 i nyrevev, og kan bli ytterligere modifisert for å forlenge den beskrevne fremgangsmåte kan brukes i andre biologiske preparater eller hele organer.
Introduction
Enzymatisk microelectrode biosensorer (også referert som sensorer i stede manuskript) har vært et verdifullt verktøy for å studere dynamiske signalprosesser i levende celler og vev. Sensorene gir økt tidsmessig og romlig oppløsning av cellesignalmolekyler i biologisk relevante konsentrasjoner. I stedet for prøvetaking og analyse av ekstracellulære væsker tatt ved intervaller over lange tidsperioder, er disse sensorene reagerer så raskt som de enzymer som reagerer på analytten, for derved å gi sanntidsmålinger 1,2. Rask påvisning av interstitiell konsentrasjoner av autokrine og paracrine faktorer, som puriner eller hydrogen peroxide, og dynamikken i deres løslatelse kan brukes til å etablere en profil for virkningene av narkotika i normale og patologiske tilstander 3. Foreløpig har de fleste applikasjoner ved hjelp av sensorer vært i hjernevevet skiver og cellekulturer 4-10. Protokollene er beskrevet i dette manuskriptet mål åetablere midler til å måle sanntids konsentrasjoner av analytter i hele nyrer.
Følgende fremgangsmåte ble utviklet for å studere interstitiell ATP og H 2 O 2 signalisering i nyrene. I den opprinnelige miljø i nyrene, er ekstracellulær ATP hurtig nedbrytes av endogene ectonucleotidases i dets derivater (ADP, AMP og adenosin). Sensorene som brukes her er meget selektive for ATP sammenlignet med andre puriner eller ATP-nedbrytningsprodukter 11. Dette gir en stor fordel som gjør det mulig nøyaktig overvåking av de konstante og dynamiske konsentrasjoner av ATP frigjøring og dens signalfunksjon. Interstitiell ATP-konsentrasjon blir målt ved hjelp av en kombinasjon av to mikroelektroder, en ATP-sensor og en sensor Null. Null sensor i kombinasjon med katalase programmer er i stand til å oppdage interstitiell H 2 O 2 konsentrasjoner 12. Følgende protokoller bruke to ulike utførelser av sensors som har egenskaper optimale for enten ex vivo eller in vivo applikasjoner.
Begge konstruksjoner er basert på sekvensiell katalytisk omsetning av glyserol kinase og glycerol-3-fosfat-oksidase som inneholdes i en sensor enzymatisk lag, og er drevet ved nærvær av ATP. I det sett av sensorer som brukes i ex vivo studier, H 2 O 2, det endelige enzymatiske reaksjonsprodukt, blir detektert ved oksydasjon på en platina / iridium (Pt-Ir) trådelektrode. Sensorer for in vivo studier er i stedet basert på H 2 O 2 reduksjon på en mekler belagt gull elektrode designet for blod-perfusert vev. Vist i figur 1 er en ordning for begge protokollene som er beskrevet i dette manuskriptet. Den Null sensor er identisk med den tilsvarende ATP sensor bortsett fra at det mangler de bundne enzymer. Derfor, i tillegg til deteksjon av H 2 O 2 med enzymet katalase, den Null sensoren meaSures uspesifikke forstyrrelser. ATP-konsentrasjonen blir beregnet ved å subtrahere den ikke-spesifikke interferenser Null detektert og bakgrunns H 2 O 2 fra ATP-sensorsignalet. Flere sensorer er også kommersielt tilgjengelige til å detektere andre analytter, inkludert adenosin, ionosine, hypoxantin, acetylkolin, cholin, glutamat, glukose, laktat, d-serin for ex vivo-applikasjoner eller adenosin, ionosine, og hypoxantin for in vivo da sammen med den tilsvarende Null sensor.
Evnen av sensoren for nøyaktig bestemmelse av analytter avhengig av riktig pre- og post-kalibreringer 13. Dette sikrer at analysen står for driften i sensorfølsomheten som oppstår under bruk i biologiske vev. Sensoren har en depot av glycerol som anvendes som et reagens i sensor enzymatiske reaksjoner. Hvis sensoren ikke brukes i bade løsninger som inneholder glyserol, vil det vaskes ut over tid. Kortere recording tidene er da nødvendig for å minimere sensorens drift. I tillegg sensor begroing av endogene proteaser og proteinfragmenter i stor grad kan redusere følsomheten til sensorene 14.
Foreliggende manuskriptet etablerer bruken av enzymatiske microelectrode biosensorer for ex vivo og in vivo nyre preparater. Sanntids analytt kvantifisering gir enestående detalj av mobilsignal som kan avsløre nye innsikt i mekanismene for nyresykdommer og farmakologiske midler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende dyre prosedyrer følges NIH Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Forhåndsgodkjenning ble hentet fra Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
MERK: Gjennomgang av sensor produsentens instruksjoner bør gjøres under forsøket design og før deres bruk. Følge disse instruksjonene vil gi optimale resultater ved bruk av sensorer.
1. Sensorkalibrering
- Klargjør ferske stamløsninger før starten av forsøket.
- Lag Buffer A inneholdende 10 mM NaPi buffer, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, og 2 mM glyserol. Juster pH-verdien til 7,4 ved hjelp av NaOH. Oppbevar ved 2-8 ° C.
- Ved å anvende en ATP-konsentrasjon (100 mM) lagret ved -20 ° C, skape en ny 10 mM ATP kalibreringsløsning ved tilsetning av 10 ul stam til 90 ul av buffer A.
- Rehydrere ATP sensor ved å plassere sin spiss (figur 2) inn tHan rehydreringskammeret inneholdende buffer A i minst 10 min ved 2-8 ° C.
MERK: Etter rehydratisering, sensorene må ikke utsettes for luft i mer enn 20 sek eller sensorfølsomheten kan reduseres. Hvis lange eksponeringer til luft er forventet, dypp sensor kort til en løsning av glyserol. Sensorene kan benyttes for flere forsøk, men disse må skje på samme dag som sensor rehydrering. Sensorene kan lagres i rehydreringskammeret med buffer A for opp til 24 timer. - Slå på dual channel potentiostat (figur 3) og starte innspillingen systemprogramvaren.
- Tilbered en kalibreringskammer med 3 ml buffer A. Place referanseelektroden inn i kalibreringskammeret. Ta hver sensor fra rehydreringskammeret, og fest den til manipulator og sett den inn i kalibreringskammeret løsning.
MERK: Bruk en standard silikonbelagt petriskål som et kalibreringskammeret. Utføre alle kalibreringer og studies i et Faraday bur på en høy-ytelse lab luft bordet for å redusere signalstøy i løpet av de amperometry opptak (figur 4). Kalibreringer blir best gjort så nær begynnelsen av datainnsamlingen som mulig. For in vivo anvendelser det optimale tidspunktet for kalibrering er i løpet av dyret etter kirurgi restitusjonsperiode. - Ex vivo kalibrering
- Utføre syklisk voltametri i kalibreringskammeret ved å sykle sensorene fra -500 mV til +500 mV ved en hastighet på 100 mV / sekund i 10 sykluser. Dette forbedrer følsomheten til sensorene. Se figur 5 for sporene observert fra de 10 sykluser.
- Polariserer sensorene til 600 mV etter siste syklus. Sensorstrømmen vil forfalle til en asymptote. En jevn avlesning er oppnådd etter minst 5 min. Spill null lesing.
- In vivo sensor kalibrering
- Ikke utfør den sykliske voltammetry på in vivo sensors. I stedet polarisere sensoren i kalibreringskammeret i 30 sekunder til 500 mV. Deretter setter potentiostat til 0 mV og la sensorstrømmen til å stige til en asymptote. Sensorstrømmen vil ta minst 2 min til asymptote. Spill null lesing.
- Fortløpende legger sett mengder ATP-løsning inn i kammeret for å frembringe en kalibreringslinje som omfatter et ønsket deteksjonsområde. ATP-løsning frembringer en skarp topp i sensorsignalet innledningsvis, etterfulgt av en nedbrytning som ATP diffunderer jevnt i hele kammeret. Record signalverdier når signalnivået har stabilisert seg etter hvert ATP-tilsetning. Figurene 6A og 7 viser spor og foreslåtte ATP konsentrasjoner for både ex vivo og in vivo-studier, respektivt.
MERK: Det er viktig å bekrefte selektivitet av elektrodene ved hjelp av åtseletere av analyttene. Den foreliggende protokoll som brukes apyrase for å teste spesifisiteten av ATP sensor og katalase for H <sub> 2 O 2 signal (Tall 6B). Dersom stoffene som skal administreres, bør målinger av deres reaktivitet med sensorene bestemmes før studien. - Tilsett 3 mL av apyrase fra et lager av 2 mg / ml (89 UN / mg) for å teste spesifisiteten av ATP sensoren (strømmen produsert av ATP påføring bør reduseres til nullnivå (figur 7).
- Tilsett 3 mL av katalase fra et lager av 2 mg / ml (100 UN / mg) for å teste spesifisiteten av null-sensoren (strømmen som produseres av H to O to påføring bør redusere til null-avlesning).
2. Animal Surgery For Sensor Studies
- Kirurgi for ex vivo
- Anesthetize forsøksdyr med isofluran (5% induksjon, 1,5 til 2,5% vedlikehold) / medisinsk karakter O 2 eller en annen godkjent metode. 15 '12 Dyr må kontinuerlig overvåkes for å sikre et tilstrekkelig nivå av anestesi. Ststand respirasjonsfrekvens og tå klype reaksjon blir brukt til å bekrefte passende anestesi.
Merk: avlive dyret i henhold til godkjente IACUC protokoller. Ved ferdigstillelse av alle ikke-overlevelses prosedyrer avlive dypt anestiserte dyr ved torakotomi indusere pneumothorax å sikre human død av dyret 12. - Plasser rotte på et temperaturkontrollert kirurgisk bord i liggende stilling. Samtidig opprettholde en riktig bedøvelse dybde, gjør et et midtlinjesnitt på omtrent 5 cm i linje med den venstre nyre og utsette den distale abdominale aorta.
- Pakk en ligatur rundt cøliaki og overlegen tarmens arterier, og abdominal aorta over disse arteriene men ikke ligere. Pakk to ligaturer rundt abdominal aorta nedenfor nyrearteriene.
- Klem abdominal aorta over ligaturer. Bind den nedre ligatur. Kateterisere abdominal aorta med polyetylen rør (PE50). Fest kateteret med andre aorta ligatur.
- Fjern klemmen og ligere mesenteriske og cøliaki arterier. Perfuse nyrene ved 6 ml / min med Hanks Balanced Salt Solution ved romtemperatur i 2-3 minutter inntil den er fullstendig nyre forvellet.
- Eksisere nyre og kateteret, forbundet del av aorta. Plasser nyrene inn i en 3 ml petriskål fylt med bad løsning.
Merk: Eksperiment protokollen kan bli utført ved romtemperatur. Badoppløsningen inneholder i mM: 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, pH 7,35 justert med NaOH.
- Anesthetize forsøksdyr med isofluran (5% induksjon, 1,5 til 2,5% vedlikehold) / medisinsk karakter O 2 eller en annen godkjent metode. 15 '12 Dyr må kontinuerlig overvåkes for å sikre et tilstrekkelig nivå av anestesi. Ststand respirasjonsfrekvens og tå klype reaksjon blir brukt til å bekrefte passende anestesi.
- Kirurgi for in vivo
- Anesthetize rotte med godkjente IACUC protokoller. For in vivo-analyse bedøve rottene med ketamin (20 mg / kg im) og inactin (50 mg / kg ip). Dyr må overvåkes kontinuerlig for å sikre et tilstrekkelig nivå av anestesi. En stabil respirasjonsfrekvens og tå klype reaksjon blir brukt til å bekrefte passende anestesi.
- Etter riktig anestesi dybde er fåed, plasserer rotte i liggende stilling på et temperaturkontrollert jordet overflate ligger på lufta bordet. Overflaten skal forvarmes og holdt ved 36 ° C.
- Samtidig opprettholde riktig bedøvelse dybde, gjør et et midtlinjesnitt omtrent 5 cm i henhold til nyrene.
- Bruk en sutur for å avbøye og forankre den kutane og subkutane vev, slik at hele nyren er synlig. Plasser nyre i en nyre cup for å minimere eventuelle bevegelse gjenstander.
- Bruke en IV infusjon av 2% BSA: 0,9% NaCl ved en ml / 100 g / time via vena jugularis for å opprettholde blodvolum. Cannulate både urinlederne til urinoppsamling. Plasser bånd rundt den overlegne mesenteriske og cøliaki arterier og den distale aorta for manipulering av renal perfusjon trykk (Tall 10A).
- Ved anvendelse av farmakologiske midler er nødvendig i in vivo eksperimenter, er innsettingen av en mellomliggende kateter anbefalt (figurene 10B
3. Data Acquisition Setup
- Åpne datainnsamlingsprogram og sette dens polaritet for både ex vivo og in vivo eksperimenter for Anodisk Positiv. Sette programmet til å lagre data som ASCII-kode.
- Plasser micromanipulators for rask innføring av sensorer i nyrene.
MERK: Alternativt kan du bruke en dummy probe festet til mikromanipluatoren å bidra til å oppnå den ønskede plassering av sensorer. - Ex vivo datainnsamling
- Perfuse nyren med badoppløsningen (fra 2.1.6) via aorta ble kanylert med en konstant hastighet på 650 mL / min. Ved hjelp av kirurgiske sakser, fjerner nyrekapselen, noe som er nødvendig for sensoren innsetting nøye.
- Fest nyre med gummistrikk festet over nyre og festet til silikonbelagt tallerken med pinner.
- Plassere referanseelektroden nær nyrene i petriskål med sin spiss neddykket ibufferoppløsningen.
- In vivo datainnsamling
- Plasser nyre i en nyre cup. Avhengig av belastningen og alder på dyret bruker en størrelse på koppen som holder nyrene løst. Figur 8 viser to størrelser av nyre kopper. Lignende kopper brukes til ulike fysiologiske tilnærminger fokusert på analyse av nyrefunksjonen som micropuncture etc 16.
Merk: Posisjonen av nyre koppen er kritisk for å fjerne den mekaniske støy som produseres av dyret å puste, men bør ikke forstyrre eller blokkere nyre perfusjon eller urinstrøm. - Tillat 45 minutter med utvinning tid før du utfører datainnsamling.
- Ved hjelp av en nål 26-30G, gjør en punktering hull ved den ønskede posisjonen og dybden til sensoren i nyrene. Blot overflaten hullet for å fjerne utstrålte blod. Legg glycerol-løsning til overflaten av nyrene. Dette vil forhindre nyre overflaten fra å tørke ut i løpet av eksperimentet. Fjern den første sensoren fra rehydreringskammeret og fest den til mikromanipluatoren. Raskt, innen 20 sekunder, setter elektroden i nyopprettet hull i nyrene. Gjenta trinn 03.05 til 03.09 for null sensor.
- Sett referanseelektrode inn i nyrene, omtrent 1 cm fra fra sensorene.
- Plasser nyre i en nyre cup. Avhengig av belastningen og alder på dyret bruker en størrelse på koppen som holder nyrene løst. Figur 8 viser to størrelser av nyre kopper. Lignende kopper brukes til ulike fysiologiske tilnærminger fokusert på analyse av nyrefunksjonen som micropuncture etc 16.
- Slå på potentiostat og aktivere opptaksprogram på datamaskinen. Figur 9 viser den endelige oppsettet av ex vivo nyre datainnsamling. Figur 10 viser den endelige oppsettet av in vivo nyre datainnsamling med en innsatt kateter.
4. Data Analysis
- Importere ASCII datafilen til Origin eller annen lignende programvare.
- Konsentrasjon nåværende forhold
- Bruk lineær tilpasning / ekstrapolere funksjon å bygge en lineær konsentrasjon (x-aksen) til strøm (y -aksen) sammenheng for ATP eller H 2 2 kalibrerings (figur 6 og 7).
lineær tilpasning linje: y = mx + b
- Bruk lineær tilpasning / ekstrapolere funksjon å bygge en lineær konsentrasjon (x-aksen) til strøm (y -aksen) sammenheng for ATP eller H 2 2 kalibrerings (figur 6 og 7).
- Likestille strømmen til konsentrasjonen
- Trekk fra de målte spor av null-sensoren fra de av ATP føleren for å oppnå den faktiske strøm produsert av intracellulære ATP.
- Konverter ATP verdiene i pA innhentet av amperometry til nM bruker kalibreringsligningen beskrevet i 4.2.1. Bestemme konsentrasjonen av den subtraherte datatrasen av ATP sensoren ved å importere hver justerte strøm inn i "x" verdi, og å løse for y (konsentrasjonen av analytt).
- Tilsvarende beregner H 2 O 2-konsentrasjonen fra sin kalibreringsligning hvis nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utformingen av den enzymatiske microelectrode biosensor tillater sporing i sanntid av analytter i hele nyrer. Er den generelle eksperiment design for enten ex vivo eller in vivo studier vist i figur 1 .De sensorer som brukes og de kirurgiske prosedyrer varierer avhengig av om studien er ex vivo eller in vivo.
For å få reproduserbare resultater, nøyaktig pre- og post-kalibreringer er kritiske. Figur 6A viser en representant spor av signalet sett fra ex vivo ATP sensor under kalibreringer. Merk at apyrase raskt eliminert ATP signal. Katalase hadde ingen effekt på den ATP-signalet og viser dens spesifisitet til H 2 O 2 skaper (figur 6B). Kalibreringsprosedyren gir en lineær tilpasning som brukes til å beregne den dynamiske forandringer av ATP (figur 6A, høyre panel). In vivo sensorkalibrering frembringer et tilsvarende spor på den for ex vivo-sensoren. Men denne sensoren oppdager reduktiv istedenfor oksidative strøm og som sådan strøm produsert er negativ. Kalibrering av disse sensorene produserer også en lineær tilpasning i en 0,3 til 80 mikrometer området (Figur 7A høyre panel). Spesifisitet av in vivo sensor til ATP sammenlignet med andre purin-produkter er vist i figur 7B.
Tilnærmingen er beskrevet her gir oss mulighet til å måle både basale nivåer av endogene stoffer og akutte forandringer i respons til narkotika infusjon 12. Vist i figur 11 er Ang II-indusert endring av interstitiell endogen konsentrasjon av H 2 O 2 i saltresistent og saltsensitiv rotter. For disse eksperimentene ble nylig isolerte nyrer fra Sprague Dawley (SD) eller Dahl salt-sensitive (SS) rotter perfusert med 1 pM Ang II under konstant laminær strømning (650 mL / min). Som shown i figur 11, induserer Ang II akutt frigjøring av H 2 O 2 i nyrer fra både SD og SS rotter. Men den maksimale amplitude av hvert svar var signifikant forhøyet i SS rotter, spesielt da dyrene ble foret med en diett med høyt saltinnhold 12. Vist i figur 12 er en representativ anvendelse av biosensorer in vivo. Infusjon av katalase (5 ug / ml) fullstendig blokkerer H 2 O 2 signal som detekteres av biosensoren. Disse forsøk illustrerer anvendelsen av spesifikke enzymatiske biosensorer kombinert med amperometrisk teknikk for påvisning av basale nivåer av endogene stoffer og sanntidsmålinger av deres frigjøring i respons til farmakologisk intervensjon. Ytterligere anvendelser av denne tilnærmingen for å studere rollen purinergiske signalisering og hydrogen peroxide vil forbedre vår kunnskap og forståelse av nyre patologier som salt-sensitive hypertensjon, nedsatt okseidative stress og kronisk nyresykdom.
Figur 1. Skjematisk av protokollene. Kalibrering med analytten av interesse og teste dets spesifisitet blir gjort umiddelbart før starten av forsøkene. Den in vivo protokollen bør følges for komplekse fysiologiske eksperimenter og ex vivo farmakologiske anvendelser. Post eksperiment kalibreringen bør gjøres og tas hensyn til under dataanalysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Enzymatisk microelectrode Sensor. De tosensorstørrelser brukes for ex vivo-programmer vises, 50 mikrometer og 125 mikrometer diameter. Hver sensor ledning strekker seg inn i et kapillarrør for å koble til en gull ende kontakt (ikke vist). Inset viser en sensor tips belagt med enzymer for ATP deteksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Dual Channel potensiostat. Potensiostaten kanalene merket CH1 og CH2. 1) CH1 ATP følertilkoplingen og 2) CH2 null følertilkoplingen 3) tilkoblinger som er elektrisk koplet til referanseelektrode. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
ass = "jove_content" fo: keep-together.within-side = "always"> 
Figur 4. Sensor Setup. Den datainnsamling er utført i et Faraday bur for å redusere elektrisk støy og på en høy-ytelse lab bordet for en vibrasjonsfri arbeidsflate. 1) En temperaturstyrt operasjonsbord benyttes til å opprettholde dyrets kroppstemperaturen under fysiologiske eksperimenter 2) de micromanipulators er festet til magnetmonteringsadaptere for fleksibel plassering av sensorene i eksperiment 3) en lyskilde som er nødvendig for kirurgiske prosedyrer og sensor innsetting 4 ) tokanals potentiostat 5) holder for sensorene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
p_upload / 53059 / 53059fig5.jpg "/>
Figur 5. Cyclic Voltammetri. For ex vivo studier, er sensor syklisk voltammetry gjennomført for 10 sykluser mellom -0,5 og 0,5 V før kalibreringsprotokoll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Amperometry Kalibrering for ex vivo. (A) Kalibrering benytter tilsetning av ATP kjente konsentrasjoner til badoppløsningen. Tilsvar Amperometriske verdier registrert på asymptoten nivå (svart kurve). Strømmene innhentet lage en kalibrerings ligningen. Et eksempel er vist på høyre panel. Den røde spor er current av Null sensor som reagerer på bare tilsetningen av H 2 O 2. (B) Den Null føleren kalibreres under tilsetning av kjente H 2 O 2 konsentrasjoner (røde piler) til badoppløsningen og asymptoter Amperometriske verdier er angitt (tynne sorte piler). Tilsetning av katalase til badoppløsningen (tykk sort pil) resulterer i rask strøm forråtnelse. Høyre panel viser Null sensor kalibrering ligningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Amperometry Kalibrering for;. In vivo Kalibrering av in vivo elektrodene er utført på en lignende måte som den beskrevet i ex vivo-studier med unntak av reduksjonsreaksjoner forårsaker en returstrøm (polaritet). (A) Tilsetning av kjente ATP-konsentrasjon gir en amperometrisk strøm på ATP sensoren (svart kurve), men har ingen effekt på Null sensoren (rød kurve). Tilsetning av apyrase slukker strøm av ATP sensoren. (B) Den spesifisiteten av ATP sensoren er bekreftet ved tilsetning av 10 uM av forskjellige purinergiske midler (UTP, UDP og adenosin). Ytterligere anvendelser av ATP gi en stabil detekterbart amperometrisk strøm. (C) mikro av in vivo sensorer basert på en mekler belagt gull elektroden. Klikk her for å se en større versjon av denne Figure.
Figur 8. Nyre Cuper. I in vivo studier, er nyrene holdt fortsatt bruker rustfritt stål nyre kopper vist. To størrelser av kopper brukes til å huse nyre størrelsesvariasjon. Disse kopper redusere bevegelse gjenstander som er generert av dyrets åndedrett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9. Ex vivo Isolert perfusert og nyre. Det isolerte nyrer er plassert i en 1) petriskål belagt med et tykt silicone bunn for tappen innsetting 2) nyrearterien ble kanylert og knyttet til en sprøytepumpe for konstant perfusjon i løpet av eksperimentet 3) ATP-sensor, 4) og Null-sensor er satt inn i nyrene 5) referanseelektroden er plassert nær nyre neddykket i badekaret løsningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10. In vivo Blood perfusert Kidney. (A) Den venstre nyre er eksponert og plassert i et beger nyre, forblir den høyre nyre intakt inne i dyret. Begge sensorer er satt inn i nyrene. BSA: NaCl er tilført via kateteriseres jugularvenen å motvirke væsketap forårsaket by store midtlinjeoppskjæring (B) Eksempel på in vivo forsøket med implantert interstitiell kateter for direkte farmakologiske programmer 1) nyrene blir holdt av en nyre cup 2) ATP sensor 3) Null sensor og 4) referanseelektrode er satt inn inn i ventral overflaten av nyre 5) kateter implantert i nyre og festet til en slangepumpe for laminære farmakologiske infusjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 11. Ex vivo-analyse av H-2 sub> O 2 i nyrene. Ang II perfusjon fører H 2 O 2 utgivelse i rottenyrebark. (A) sanntid forandringer av den midlere H 2 O 2 konsentrasjon (grå søyler viser standardavvik) fra i alt n = 8 applikasjoner (4 nyrer fra 4 forskjellige rotter). Barer på toppen representerer Ang II-programmet. (B) Den maksimale H 2 O 2 konsentrasjon amplitudeverdier i løpet av Ang II perfusjon for Sprague Dawley (SD) og Dahl salt-sensitive (SS) rotter foret med en høy og lav salt dietter, respektivt. * - P <0,05 versus SD-rotter. Figuren er tilpasset fra referanse 12 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
/files/ftp_upload/53059/53059fig12.jpg "/>
Figur 12. In vivo-analyse av H 2 O 2. Eksempel på en in vivo-vurdering av interstitiell H 2 O 2-konsentrasjon i medulla av en SS rotte tilført en diett med lavt saltinnhold (som vist i figur 10B). Interstitiell applikasjon av katalase via et implantert kateter for 5 min intervallet produserte en fullstendig blokkering av H 2 O 2 signal i nyre medulla. Reduksjon av katalase, fra utvasking av nedsatt blodstrøm, resulterte i en delvis gjenoppretting av signalet, som ble blokkert igjen ved en ekstra katalase søknad (10 min). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De foreliggende fremgangsmåtene ble utviklet for å gi forbedret tidsmessig og romlig oppløsning av ATP og H 2 O 2 signalisering for ex vivo isolerte, perfunderte og in vivo blod-perfusjon nyrer. Forskjellene mellom de protokollene og sensorer som brukes her gi optimal datainnsamling for enten farmakologiske midler eller fysiologiske studier. Protokollene består av 1) sensorkalibrering, 2) kirurgisk prosedyre, 3) datainnsamling oppsett, og 4) data-analyse. De muliggjør sanntidsmålinger av analytter for mange eksperimentelle forhold. Dette vil føre til større innsikt i nyresykdommer og utvikling av mer effektive farmakologisk behandling. Her har vi brukt sensorene til å analysere ATP og H 2 O 2. Imidlertid sensorer for andre stoffer er også tilgjengelige og kan anvendes. Protokollene som beskrives her ble anvendt for å studere ATP og H 2 O 2 i rotte nyrer, men den samme method kan enkelt justeres for søknaden hos mus. Således har denne metode et stort potensial med tanke på mange genetiske gnagermodeller.
Den grunnleggende utformingen av enzymatiske microelectrode biosensorer ble utviklet på 1960-tallet av Clark og Lyons 2. Etter den første utviklingen av biosensorer, har fremskritt er gjort i både design 17-19 og programmer 20. Llaudet et al. 21,22 utviklet prinsipiell utførelse av ATP sensorer som brukes i de foreliggende protokoller ved bruk av metoder fra Cosneir et al. 23 for enzymet belegg. Disse sensorene har oppdaget ATP signalering i en rekke fysiologiske prosesser, inkludert ATP utgivelse fra hjerne astrocytter 8, regulering av puste 4,24, og skjelettmuskel arteriole forskrift 25. Nylig ex vivo protokollen er blitt brukt til å måle ATP signalisering i 12 nyrene. Målet med dette manuskriptet jegs for å gi effektiv retninger og innsikt for påvisning av endogene stoffer slik som ATP i nyrene.
Enzymatiske microelectrode biosensorer har mange fordeler fremfor eksisterende hjelp av måling av analytter in vivo. Imidlertid må spesielle forhåndsregler benyttes for dette prinsipp som ved enhver annen ny metode. Validering med en etablert tilnærmingen gir tillit til de oppnådde data. For eksempel ble mikrodialyse-målinger gjort som beskrevet tidligere 26,27. Ingen signifikant forskjell ble observert mellom de høyeste konsentrasjonene bestemt av sensorene og de som er oppnådd fra dialyseprøver 12. Begrensningen av mikrodialyse er at den bare måler steady-state nivåer av analytten. Som sådan, kan vurderingen av dynamiske forandringer i cellesignalisering bare kan oppnås ved bruk av de enzymatiske microelectrode biosensorer. Manufakturhuset spesifikasjoner på sensor responstid varierer mellom sensortyper. ex vivo sensorer har en responstid på 5-10 sek og in vivo-sensorene 30-35 sek for signalet stiger fra 10 til 90%. Sporene kalibrerings (figurene 6 og 7) viser tidsoppløsningen av analytt addisjon / fjerning. For både sensor- og mikrodialysefremgangsmåter er bruken av spesifikke enzymer for å blokkere signalet som produseres av analyttene som kreves for å sikre spesifisitet.
De beskrevne protokoller har flere utfordringer. Som med alle sensor innsetting i vev, betyr vevsskade oppstår. Dette kan aktivere signalveier som kan påvirke målingene 28. For å minimalisere celleskader, vil tynnere sensorene være nødvendig. Det er imidlertid vanskelig å trenge gjennom nyren med sensorene slik at nålene blir brukt til å lage et lite inngangshullet. Tynne sensorer er mer sannsynlig å bøye og forstyrre deres belegg på innsetting. Større diameter sensorene er mer motstandsdyktig mot bøyning og resultant skade på belegget. Figur 3 viser et tynt og tykt sensor. I tillegg til motstand mot bøyning av tykke sensorens, de inneholder et tykkere lag av belegg, noe som gir økt beskyttelse for den enzymatiske lag. Bekymring for vevsskade forårsaket av bruk av tykke sensorer var betydelig mindre i nyrene enn det ville være i hjernevev. Innsettingsdybden blir tilnærmet og endelig plassering bør verifiseres etter målinger på nyrene er fullført. Estimering mellom cortex og medulla lag som bruker sensortuppen lengde som en innføringshylse og er tilstrekkelig som sensortuppen er 0,5 mm og nyre cortex er 2-3 mm tykk. Begroing av sensoren oppstår også ved en større hastighet i blod, og dermed begrense føleren bruk i lang in vivo-protokoller til ett eksperiment. Opptakstider 1 til 1 ½ time resulterte i bare en liten sensor drift. De viktigste kriteriene ved vurderingen av den reduserte ytelsen sensor er den lav følsomhettil analytten under kalibreringsprosessen. Økt elektrisk støy og ustabilitet av grunnlinjen strømmen kan også indikere at følerspissen er skadet. For nøyaktige målinger av ATP, bør begge sensorer (ATP og NULL) har tilsvarende støy- og stabilitetsegenskaper for videre subtraksjon av signalet. Ellers bør en av sensorene bli erstattet. For lav støy og påvisning av små konsentrasjoner av analytt, er bruken av nye sensorer for hvert dyr foreslått.
Flere trinn er avgjørende for vellykkede eksperimentelle resultater. Sensorene er svært skjøre og må håndteres forsiktig for å unngå å skade sensortuppen. Også, etter rehydratisering, sensorene må ikke utsettes for luft i mer enn 20 sek. Lav støy innspillinger er nødvendig for en vellykket påvisning av biologiske signaler i vev. For dette formålet, er en høy ytelse lab luft bord og riktig elektrisk jording nødvendig. Tilsetning av nøyaktige mengder av analytt during trinnene kalibrerings er nødvendig for nøyaktig konsentrasjon besluttsomhet i eksperimenter. Oppnå god clearing av nyrene i ex vivo nyre operasjoner vil resultere i vellykkede innspillinger. Bruken av enzymer apyrase og katalase i kalibreringer og i forsøk gjør det mulig for vurdering av sensoren ikke-spesifikk følsomhet og bekrefter målingene.
Disse protokollene gir kraftig forbedret detalj av ekstracellulære signal i nyrene. Den forbedrede følsomhet og tidsmessig oppløsning gis av sensorene kan tillate oss å løse endringer i ATP signalanlegg i sykdomstilstander og følgende farmakologisk manipulasjon som tidligere var umulig å oppdage. Den in vivo protokollen er godt egnet for kompliserte fysiologiske studier mens ex vivo er optimal for studiet av farmakologiske applikasjoner på nyrene. Utformingen av in vivo-sensoren som brukes her muliggjør enestående motstand mot forstyrrelser i blood-perfusert vev. Samlet utgjør disse sensorer gir en stor mengde anvendelser som tidligere ikke var mulig med de eksisterende protokoller og teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sensorer for video-opptak av dette manuskriptet ble levert av sarissa Biomedical Limited (Coventry, UK).
Acknowledgments
Vi setter pris på sarissa Biomedical for sitt arbeid i å utvikle sensorer som brukes i den foreliggende manuskript. Denne forskningen ble støttet av National Heart, Lung, and Blood Institute gir HL108880 (A. Staruschenko), HL 116264 (A. Cowley) og HL 122662 (A. Staruschenko og A. Cowley), et prosjekt finansiert av Medical College of Wisconsin Forskning Affairs Committee # 9306830 (O. Palygin) og Advancing en sunnere Wisconsin forskning og utdanning Program # 9520217, og Young Investigator Grant av National Kidney Foundation (O. Palygin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensor Kit | Sarissa Biomedical | SBK-ATP-05-125 | The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes. Also included with the kit is the user's choice of sensors. |
| Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-ATP-05-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold ATP Biosensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-ATP-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe null sensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-NUL-20-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold null sensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-NUL-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe ATP Manual | Sarissa Biomedical | http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf | |
| Faraday cage | TMC | ||
| Dual channel potentiostat | Digi-Ivy | DY2021 | Type II Faraday cage |
| Data acquisition program | Digi-Ivy | DY2000 | |
| Perfusion pump | Razel Scientific Instruments | Model R99E | |
| Fiber optic illuminator | Schott | ACE 1 | |
| micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-8 | |
| air table | TMC | 63-500 | |
| isoflurane ventilator | LEI Medical | M2000 | |
| 3 ml petri dish | Fisher Scientific | S3358OA | |
| needle | Santa Cruz | 26-30 G | |
| pins | Standard dissection pins | ||
| catheter | Polyethylene tubing (PE50) | ||
| catheter tissue glue | Vetbond | 1469SB | |
| suture | Look | SP117 | |
| rubber bands | any 2-4 mm wide rubber bands | ||
| silicone | Momentive | RTV-615 Clear 1# | |
| clamp | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| standard dissection kit | Kit should include scalpel and dissection sissors | ||
| Kidney Cup | Of own design | ||
| standard chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | 100 mM ATP solution |
| hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A7646 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| isoflurane | Clipper | 10250 | |
| inactin | Sigma-Aldrich | T133 | |
| ketamine | Clipper | 2010012 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 |
References
- Palygin, O., Staruschenko, A. Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).
- Clark, L. C., Lyons, C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Ann N Y Acad Sci. 102, 29-45 (1962).
- Haruyama, T. Micro- and nanobiotechnology for biosensing cellular responses. Adv Drug Deliv Rev. 55, 393-401 (2003).
- Huckstepp, R. T., et al. Connexin hemichannel-mediated CO2-dependent release of ATP in the medulla oblongata contributes to central respiratory chemosensitivity. J Physiol. 588, 3901-3920 (2010).
- Lopatar, J., Dale, N., Frenguelli, B. G. Minor contribution of ATP P2 receptors to electrically-evoked electrographic seizure activity in hippocampal slices: Evidence from purine biosensors and P2 receptor agonists and antagonists. Neuropharmacology. 61, 25-34 (2011).
- Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Marshall, S. P., Pena, D. M., Rice, M. E. Glutamate-dependent inhibition of dopamine release in striatum is mediated by a new diffusible messenger, H2O2. J Neurosci. 23, 2744-2750 (2003).
- Frenguelli, B. G., Wigmore, G., Llaudet, E., Dale, N. Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus. J. Neurochem. 101, 1400-1413 (2007).
- Lalo, U., et al. Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex. PLoS Biol. 12, e1001747 (2014).
- Heinrich, A., Ando, R. D., Turi, G., Rozsa, B., Sperlagh, B. K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study. Br.J Pharmacol. 167, 1003-1020 (2012).
- Dale, N. Purinergic signaling in hypothalamic tanycytes: potential roles in chemosensing. Semin Cell Dev Biol. 22, 237-244 (2011).
- Gourine, A. V., Llaudet, E., Dale, N., Spyer, K. M. Release of ATP in the ventral medulla during hypoxia in rats: role in hypoxic ventilatory response. J Neurosci. 25, 1211-1218 (2005).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H2O2 release in freshly isolated kidneys. Am J Physiol Renal Physiol. , (2013).
- Thome-Duret, V., Gangnerau, M. N., Zhang, Y., Wilson, G. S., Reach, G. Modification of the sensitivity of glucose sensor implanted into subcutaneous tissue. Diabetes Metab. 22, 174-178 (1996).
- Wilson, G. S., Gifford, R. Biosensors for real-time in vivo measurements. Biosens. Bioelectron. 20, 2388-2403 (2005).
- Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-Channel Analysis of TRPC Channels in the Podocytes of Freshly Isolated Glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
- Stockand, J. D., Vallon, V., Ortiz, P. In vivo and ex vivo analysis of tubule function. Compr Physiol. 2, 2495-2525 (2012).
- Turner, A. P. Biosensors: Fundamentals and applications - Historic book now open access. Biosens. Bioelectron. 65C, A1 (2014).
- Kauffmann, J. M., Guilbault, G. G. Enzyme electrode biosensors: theory and applications. Methods Biochem Anal. 36, 63-113 (1992).
- Barlett, P. N., Cooper, J. M. A review of the immobilization of enzymes in electropolymerized films. J Electroanal Chem. 362, 1-12 (1993).
- Kano, K., Morikage, K., Uno, B., Esaka, Y., Goto, M. Enzyme microelectrodes for choline and acetylcholine and their applications. Anal Chim Acta. 299, 69-74 (1994).
- Llaudet, E., Hatz, S., Droniou, M., Dale, N. Microelectrode biosensor for real-time measurement of ATP in biological tissue. Anal Chem. 77, 3267-3273 (2005).
- Llaudet, E., Botting, N. P., Crayston, J. A., Dale, N. A three-enzyme microelectrode sensor for detecting purine release from central nervous system. Biosens Bioelectron. 18, 43-52 (2003).
- Cosnier, S., Lepellec, A., Guidetti, B., Isabelle, R. -L. Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly(pyrrole-ammonium) and poly(pyrrole-lactobionamide) films as host matrices. J Electroanal Chem. 449, 165-171 (1998).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329, 571-575 (2010).
- Kluess, H. A., Stone, A. J., Evanson, K. W. ATP overflow in skeletal muscle 1A arterioles. J. Physiol. 588, 3089-3100 (2010).
- Nishiyama, A., Jackson, K. E., Majid, D. S., Rahman, M., Navar, L. G. Renal interstitial fluid ATP responses to arterial pressure and tubuloglomerular feedback activation during calcium channel blockade. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H772-H777 (2006).
- Jin, C., et al. Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production. Hypertension. 53, 1048-1053 (2009).
- Khan, A. S., Michael, A. C. Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain. Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).
