Abstract
Biosensori microelettrodi enzimatici sono stati ampiamente utilizzati per misurare il segnale extracellulare in tempo reale. La maggior parte del loro uso è stato limitato a fettine di cervello e colture cellulari neuronali. Recentemente, questa tecnologia è stata applicata a tutto organi. I progressi nella progettazione dei sensori hanno reso possibile la misurazione di segnalazione delle cellule nel sangue-perfuso nei reni vivo. Elencare i presenti protocolli i passi necessari per misurare ATP e H 2 O 2 segnalazione nell'interstizio rene di ratto. Due disegni sensore separato sono utilizzati per la ex vivo e in vivo protocolli. Entrambi i tipi di sensori sono rivestiti con un biolayer enzimatico sottile sopra di uno strato permselettività dare rapida risposta, biosensori sensibili e selettivi. Lo strato permselettività protegge il segnale dagli interferenti in tessuto biologico, e lo strato enzimatica utilizza la reazione catalitica sequenziale di glicerolo chinasi e glicerolo-3-phosphate ossidasi in presenza di ATP per produrre H 2 O 2. La serie di sensori utilizzati per gli studi ex vivo ulteriormente rilevato analita mediante ossidazione di H 2 O 2 in un platino / iridio (Pt-Ir) elettrodo a filo. I sensori per gli studi in vivo sono invece basati sulla riduzione di H 2 O 2 in un mediatore rivestito elettrodo d'oro progettata per il tessuto sangue perfuso. Modifiche concentrazione finale vengono rilevati da amperometria tempo reale seguito da taratura a concentrazioni note di analita. Inoltre, la specificità del segnale amperometrico può essere confermato con l'aggiunta di enzimi quali catalasi e apyrase che rompono H 2 O 2 e ATP corrispondentemente. Questi sensori anche dipendono fortemente calibrazioni accurate prima e dopo ogni esperimento. I due protocolli seguenti stabiliscono lo studio di rilevamento in tempo reale di ATP e H 2O 2 in tessuti renali, e può essere ulteriormente modificato per estendere il metodo descritto per l'uso in altre preparazioni biologiche o organi interi.
Introduction
Biosensori microelettrodi enzimatico (anche riferimento come sensori nel presente manoscritto) sono stati uno strumento prezioso per lo studio dei processi di segnalazione dinamici nelle cellule e nei tessuti viventi. I sensori offrono una maggiore risoluzione temporale e spaziale delle molecole di segnalazione cellulare in concentrazioni biologicamente rilevanti. Invece di campionamento e analizzare fluidi extracellulari effettuate ad intervalli più lunghi periodi di tempo, questi sensori rispondono più velocemente loro enzimi reagiscono all'analita, producendo misurazioni in tempo reale 1,2. Rilevamento rapido delle concentrazioni interstiziali dei fattori autocrini e paracrini, come purine o perossido di idrogeno, e le dinamiche del loro rilascio può essere utilizzato per stabilire un profilo per gli effetti dei farmaci in condizioni normali e patologiche 3. Attualmente, la maggior parte delle applicazioni che utilizzano sensori sono stati in fettine di tessuto cerebrale e colture cellulari 4-10. I protocolli descritti in questo scopo manoscrittostabilire i mezzi per misurare con precisione le concentrazioni in tempo reale di analiti nei reni interi.
I seguenti protocolli sono stati sviluppati per studiare ATP interstiziale e H 2 O 2 segnalazione nei reni. In ambiente nativo del rene, l'ATP extracellulare viene rapidamente catabolizzata da ectonucleotidases endogeni nei suoi derivati (ADP, AMP e adenosina). I sensori utilizzati sono altamente selettivi in ATP su altri purine o ATP prodotti di degradazione 11. Questo offre un grande vantaggio in quanto permette il monitoraggio accurato delle concentrazioni costanti e dinamiche di rilascio di ATP e la sua funzione di segnalazione. Concentrazione di ATP interstiziale viene misurata utilizzando la combinazione di due microelettrodi, un sensore di ATP e un sensore Null. Il sensore Null in combinazione con applicazioni catalasi è in grado di rilevare interstiziale H 2 O 2 12 concentrazioni. I seguenti protocolli utilizzano due diversi disegni di sensors che presentano caratteristiche ottimali sia per ex vivo o in vivo. in applicazioni
Entrambi i modelli sono basati sulla reazione catalitica sequenziale di glicerolo chinasi e glicerolo-3-fosfato ossidasi contenuta in uno strato sensore enzimatica ed è guidata dalla presenza di ATP. Nella serie di sensori utilizzati negli studi ex vivo, H 2 O 2, il prodotto finale di reazione enzimatica, viene rilevato mediante ossidazione su un platino / iridio (Pt-Ir) elettrodo a filo. Sensori per studi in vivo sono invece basati sulla riduzione H 2 O 2 in un mediatore rivestito elettrodo d'oro progettata per il tessuto sangue perfuso. In figura 1 è uno schema di entrambi i protocolli descritti in questo manoscritto. Il sensore Null è identico al suo sensore ATP corrispondente tranne che manca degli enzimi legati. Pertanto, in aggiunta al rilevamento di H 2 O 2 con l'enzima catalasi, il sensore mea NullSures interferenze aspecifiche. Concentrazioni di ATP sono calcolati sottraendo il Null rilevato interferenze aspecifiche e sfondo H 2 O 2 dal segnale sensore ATP. Diversi sensori sono anche disponibili in commercio per individuare altri analiti tra cui l'adenosina, ionosine, ipoxantina, acetilcolina, colina, glutammato, glucosio, lattato, d-serina per applicazioni ex vivo o adenosina, ionosine, e ipoxantina in vivo se abbinato con la corrispondente Null sensore.
La capacità del sensore di rilevare esattamente analiti dipende il corretto pre e post-13 calibrazioni. Questo assicura che l'analisi rappresenta la deriva della sensibilità del sensore che si verifica durante l'uso in tessuti biologici. Il sensore contiene un deposito di glicerolo che viene utilizzato come reagente nelle reazioni enzimatiche sensore. Se il sensore non è usato in soluzioni contenenti glicerolo bagno, laverà nel tempo. Shorter rvolte ecording sono poi necessarie per minimizzare la deriva del sensore. Inoltre sensore incrostazione da proteasi endogene e frammenti di proteine può notevolmente diminuire la sensibilità dei sensori 14.
Il presente manoscritto stabilisce l'uso di biosensori microelettrodo enzimatiche per ex vivo e in vivo preparazioni renali. Real-time analita quantificazione fornisce dettagli senza precedenti di segnalazione cellulare che possono rivelare nuove informazioni sui meccanismi delle malattie renali e agenti farmacologici.
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Protocol
Le seguenti procedure sugli animali aderito alla guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio. L'approvazione preventiva è stato ottenuto dalla cura e l'uso Comitato istituzionale animali (IACUC).
NOTA: Revisione delle istruzioni del produttore del sensore dovrebbe essere fatto durante la progettazione dell'esperimento e prima del loro utilizzo. Seguendo queste istruzioni produrrà risultati ottimali quando si utilizzano i sensori.
1. Calibrazione sensore
- Preparare soluzioni fresche prima dell'inizio dell'esperimento.
- Creare tampone A contenente 10 mM tampone napi, NaCl 100 mM, 1 mM MgCl 2, e glicerolo 2 mM. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Conservare a 2-8 ° C.
- Usando una concentrazione di ATP magazzino (100 mm) conservati a -20 ° C, creare una nuova soluzione di calibrazione 10 mM ATP con l'aggiunta di 10 microlitri magazzino a 90 ml di tampone A.
- Reidratare il sensore ATP posizionando la punta (Figura 2) in tegli camera di reidratazione contenente tampone A per almeno 10 minuti a 2-8 ° C.
NOTA: Dopo la reidratazione, i sensori non deve essere esposto all'aria per più di 20 secondi o la sensibilità del sensore può essere ridotta. Se si prevedono lunghe esposizioni all'aria, immergere il sensore per breve tempo in una soluzione di glicerolo. I sensori possono essere utilizzati per diversi esperimenti, ma questi devono avvenire lo stesso giorno come sensore di reidratazione. I sensori possono essere memorizzati nella camera reidratazione con tampone A fino a 24 ore. - Accendere potenziostato doppio canale (figura 3) e avviare il software di sistema di registrazione.
- Preparare una camera di taratura con 3 ml di tampone A. Inserire l'elettrodo di riferimento nella camera di calibrazione. Prendere ogni sensore dalla camera di reidratazione, quindi collegarlo al manipolatore e inserirla nella soluzione di camera di taratura.
NOTA: Utilizzare un siliconato capsula di Petri standard come una camera di taratura. Effettuare tutte le calibrazioni e studies in una gabbia di Faraday su un laboratorio tavolo aria ottimizzata per ridurre il rumore del segnale durante le registrazioni Amperometry (Figura 4). Le calibrazioni sono meglio farlo il più vicino l'inizio della raccolta dei dati il più possibile. Per le applicazioni in vivo il tempo ottimale per la taratura durante il periodo di animale recupero post-operatorio. - Ex vivo di calibrazione
- Eseguire voltammetria ciclica nella camera di calibrazione pedalando sensori da -500 mV a +500 mV ad una velocità di 100 mV / sec per 10 cicli. Questo migliora notevolmente la sensibilità dei sensori. Vedere la Figura 5 per le tracce osservate dai 10 cicli.
- Polarizzare sensori al 600 mV dopo l'ultimo ciclo. La corrente del sensore decadrà a un asintoto. Una lettura stabile si ottiene dopo un minimo di 5 min. Registrare la lettura dello zero.
- Calibrazione del sensore vivo in
- Non eseguire la voltammetria ciclica sul senso in vivors. Invece, polarizzare il sensore nella camera di calibrazione per 30 sec a +500 mV. Quindi impostare il potenziostato a 0 mV e consentire al corrente del sensore a salire a un asintoto. La corrente del sensore ci vorranno almeno 2 minuti per asintoto. Registrare la lettura dello zero.
- Consecutivamente aggiungere set quantità di soluzione di ATP nella camera di produrre una linea di taratura che comprende un campo di rilevamento desiderata. La soluzione ATP produce un forte picco nel segnale del sensore inizialmente, seguito da un decadimento come ATP diffonde uniformemente in tutta la camera. Valori segnale di registrazione una volta che il livello del segnale è stabilizzata dopo ogni aggiunta di ATP. Figure 6A e 7 mostrano tracce e suggerito concentrazioni di ATP sia ex vivo e in vivo, rispettivamente.
NOTA: E 'importante confermare la selettività degli elettrodi usando spazzini degli analiti. Il presente protocollo utilizzato apyrase per testare la specificità del sensore ATP e catalasi per l'H <sub> 2 O 2 segnale (figure 6B). Se i farmaci sono da somministrare, misure della loro reattività con i sensori devono essere determinati prima dello studio. - Aggiungere 3 ml di apyrase da uno stock di 2 mg / ml (89 UN / mg) per verificare la specificità del sensore ATP (la corrente prodotta dall'applicazione ATP dovrebbe ridurre al livello zero (Figura 7).
- Aggiungere 3 ml di catalasi da uno stock di 2mg / ml (100 UN / mg) per testare la specificità del sensore nullo (la corrente prodotta da H 2 O 2 applicazione dovrebbe ridurre la lettura zero).
2. Chirurgia Animale Per Gli Studi Sensor
- Intervento chirurgico per ex vivo
- Anestetizzare l'animale sperimentale con isoflurano (5% di induzione, 1,5-2,5% manutenzione) / medico di grado O 2 o altro metodo riconosciuto. 15 '12 Gli animali devono essere continuamente monitorate al fine di garantire un adeguato livello di anestesia. Stin grado respiratorio reazione votare e punta pizzico vengono utilizzati per confermare l'anestesia corretta.
Nota: Euthanize l'animale secondo protocolli IACUC approvati. Al termine di tutte le procedure non sopravvivenza eutanasia animali profondamente anestetizzati da toracotomia inducendo pneumotorace per garantire la scomparsa umana dell'animale 12. - Posizionare il ratto su un tavolo operatorio temperatura controllata in posizione supina. Pur mantenendo una profondità adeguata anestetico, fare una incisione mediana di circa 5 cm in linea con il rene sinistro ed esporre l'aorta addominale distale.
- Avvolgere una legatura attorno al celiaca e arterie mesenterica superiore, e l'aorta addominale sopra queste arterie, ma non legare. Avvolgere due legature intorno all'aorta addominale al di sotto delle arterie renali.
- Bloccare l'aorta addominale sopra le legature. Legare la legatura inferiore. Cateterizzare l'aorta addominale con tubo in polietilene (PE50). Fissare il catetere con la seconda legatura dell'aorta.
- Rimuovere il morsetto e legare le mesenterica e celiaci arterie. Profumato il rene a 6 ml / min con soluzione salina bilanciata Hanks a temperatura ambiente per 2-3 minuti fino a quando il rene è completamente imbiancato.
- Asportare il rene ed il catetere, connessa porzione dell'aorta. Posizionare il rene in una piastra di Petri da 3 ml riempita di soluzione del bagno.
Nota: protocollo esperimento può essere eseguita a temperatura ambiente. La soluzione del bagno contiene in mM: 145 NaCl, KCl 4,5, 2 MgCl 2, 1 CaCl 2, 10 HEPES, pH 7,35 regolato con NaOH.
- Anestetizzare l'animale sperimentale con isoflurano (5% di induzione, 1,5-2,5% manutenzione) / medico di grado O 2 o altro metodo riconosciuto. 15 '12 Gli animali devono essere continuamente monitorate al fine di garantire un adeguato livello di anestesia. Stin grado respiratorio reazione votare e punta pizzico vengono utilizzati per confermare l'anestesia corretta.
- Intervento chirurgico per in vivo
- Anestetizzare il topo utilizzando protocolli IACUC approvati. Per l'analisi in vivo anestetizzare i ratti con ketamina (20 mg / kg IM) e inactin (50 mg / kg ip). Gli animali devono essere costantemente monitorati per garantire un adeguato livello di anestesia. Una reazione respiratoria stabile votare e punta pizzico vengono utilizzati per confermare l'anestesia corretta.
- Dopo adeguata profondità dell'anestesia è ottenereed, posizionare il ratto in posizione supina su una superficie a terra temperatura controllata situata sul tavolo dell'aria. La superficie deve essere preriscaldato e mantenuta a 36 ° C.
- Pur mantenendo un'adeguata profondità dell'anestesia, fare una incisione mediana circa 5 cm in linea con il rene.
- Utilizzare una sutura per deviare e ancorare il tessuto cutaneo e sottocutaneo in modo che l'intero organo è visibile. Posizionare il rene in una tazza rene per ridurre al minimo eventuali artefatti da movimento.
- Utilizzare infusione IV del 2% BSA: 0,9% NaCl a 1 ml / 100 g / h attraverso la vena giugulare di mantenere il volume del sangue. Cannulare entrambi gli ureteri per la raccolta delle urine. Posizionare le fasce intorno mesenterici e celiaci arterie superiori e l'aorta distale per la manipolazione della pressione di perfusione renale (Figure 10A).
- Se è richiesta l'applicazione di agenti farmacologici durante gli esperimenti in vivo, l'inserimento di un catetere interstiziale è raccomandato (Figure 10B
Setup 3. Acquisizione Dati
- Aprire il programma di acquisizione dati e impostare la polarità sia ex vivo e in vivo per anodica positiva. Impostare il programma per salvare i dati come codice ASCII.
- Posizionare i micromanipolatori per rapido inserimento dei sensori nelle reni.
NOTA: In alternativa, utilizzare una sonda fittizia attaccato al micromanipolatore per contribuire a realizzare il posizionamento desiderato di sensori. - Ex vivo acquisizione dati
- Profumato rene con soluzione del bagno (da 2.1.6) tramite l'aorta cannulata a una velocità costante di 650 microlitri / min. Utilizzando le forbici chirurgiche, rimuovere con attenzione la capsula renale, che è necessaria per l'inserimento del sensore.
- Fissare il rene con elastici legati sopra il rene e collegati al piatto siliconata con perni.
- Posizionare l'elettrodo di riferimento vicino al rene nella capsula di Petri con la punta sommersala soluzione tampone.
- In acquisizione dei dati in vivo
- Posizionare il rene in una tazza rene. A seconda del ceppo e l'età dell'animale utilizzare una dimensione di coppa che contiene il rene liberamente. Figura 8 mostra due dimensioni di tazze renali. Tazze simili sono utilizzati per approcci fisiologici differenti focalizzati sull'analisi della funzione renale come micropuntura ecc 16.
Nota: La posizione della coppa rene è fondamentale per eliminare il rumore meccanico prodotto dalla respirazione animale, ma non dovrebbe interferire con o bloccare perfusione renale o flusso di urina. - Lasciare 45 minuti di tempo di recupero prima di eseguire la raccolta dei dati.
- Utilizzando un ago 26-30G, forare foratura nella posizione desiderata e la profondità del sensore nel rene. Asciugare il foro superficie per rimuovere il sangue trasudato. Aggiungere la soluzione di glicerolo alla superficie del rene. Questo consentirà di evitare la superficie rene si secchi durante l'esperimento. Togliere il primo sensore dalla camera di reidratazione e collegarlo al micromanipolatore. Rapidamente, entro 20 secondi, inserire l'elettrodo nel foro appena creata nel rene. Ripetere i passaggi 3,5-3,9 per il sensore nullo.
- Inserire l'elettrodo di riferimento nel rene, circa 1 cm dal dai sensori.
- Posizionare il rene in una tazza rene. A seconda del ceppo e l'età dell'animale utilizzare una dimensione di coppa che contiene il rene liberamente. Figura 8 mostra due dimensioni di tazze renali. Tazze simili sono utilizzati per approcci fisiologici differenti focalizzati sull'analisi della funzione renale come micropuntura ecc 16.
- Accendere potenziostato e attivare il programma di registrazione sul computer. La Figura 9 mostra la configurazione finale del rene ex vivo di acquisizione dati. La figura 10 mostra la configurazione finale del rene in vivo acquisizione dati con un catetere inserito.
Analisi 4. I dati
- Importare il file di dati ASCII in origine o qualsiasi altro software simile.
- Relazione corrente Concentrazione
- Utilizzare la funzione di adattamento / estrapolare lineare per costruire una concentrazione lineare (asse x) di corrente (asse y) relazione per l'ATP o H 2 2 punti di taratura (figure 6 e 7).
Linea fit lineare: y = mx + b
- Utilizzare la funzione di adattamento / estrapolare lineare per costruire una concentrazione lineare (asse x) di corrente (asse y) relazione per l'ATP o H 2 2 punti di taratura (figure 6 e 7).
- Equiparare la corrente alla concentrazione
- Sottrarre le tracce misurati del sensore nullo da quelli del sensore ATP per ottenere la corrente attuale prodotta da ATP intracellulare.
- Convertire i valori ATP pA ottenuti dalla amperometria a Nm utilizzando l'equazione di taratura descritto in 4.2.1. Determinare la concentrazione della traccia dati sottratto del sensore ATP importando ogni corrente regolata nel valore "x" e risolvendo per y (la concentrazione di analita).
- Analogamente, calcolare la concentrazione di H 2 O 2 dalla sua equazione di taratura se necessario.
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Representative Results
Il disegno del microelettrodo biosensore enzimatico consente il rilevamento in tempo reale di analiti nei reni interi. Il disegno esperimento generale sia ex vivo o in vivo è illustrato in Figura 1 .I sensori utilizzati e le procedure chirurgiche variano a seconda se lo studio è ex vivo o in vivo.
Per ottenere risultati riproducibili, pre accurate calibrazioni e post sono critici. Figura 6A mostra una traccia rappresentativa del segnale visto dal sensore ex vivo ATP durante calibrazioni. Si noti che apyrase rapidamente eliminato il segnale di ATP. Catalasi ha avuto alcun effetto sul segnale ATP e dimostra la sua specificità al H 2 O 2 crea (Figura 6B). La procedura di taratura produce un adattamento lineare che viene utilizzato per calcolare le variazioni dinamiche di ATP (Figura 6A, pannello di destra). In vicalibrazione del sensore vo produce una traccia simile a quella del sensore ex vivo. Tuttavia, questo sensore rileva riduttiva anziché correnti ossidativi e come tale la corrente prodotta è negativo. La calibrazione di questi sensori produce anche una misura lineare in un range da 0,3 a 80 mM (Figura 7A pannello di destra). Specificità del sensore in vivo ad ATP rispetto ad altri prodotti purine è mostrato nella Figura 7B.
L'approccio qui descritto ci permette di misurare entrambi i livelli basali di sostanze endogene e cambiamenti acuti in risposta a infusione del farmaco 12. In figura 11 sono Ang variazioni di concentrazione endogena interstiziale di H 2 O 2 in ratti sale-resistenti e sensibili al sale II-indotta. Per questi esperimenti, reni appena isolate da Sprague Dawley (SD) o Dahl (SS) ratti sale-sensibili sono stati perfusi con 1 mM Ang II sotto flusso laminare costante (650 ml / min). Come shown in Figura 11, Ang II induce il rilascio acuto di H 2 O 2 in reni da SD e ratti SS. Tuttavia, l'ampiezza massima di ogni risposta è stata significativamente elevati nei ratti SS, soprattutto quando gli animali sono stati alimentati con una dieta ricca di sale 12. In figura 12 è un'applicazione rappresentante dei biosensori in vivo. L'infusione di catalasi (5 mg / ml) blocca completamente il segnale H 2 O 2 rilevato dal biosensore. Questi esperimenti mostrano l'uso di specifici biosensori enzimatici combinati con la tecnica amperometrico per la rilevazione dei livelli basali di sostanze endogene e misurazioni in tempo reale del loro rilascio in risposta ad intervento farmacologico. Ulteriori applicazioni di questo approccio per studiare il ruolo della segnalazione purinergico e perossido di idrogeno miglioreranno la nostra conoscenza e la comprensione delle patologie renali come l'ipertensione sale-sensibile, bue renalelo stress idative e malattia renale cronica.
Figura 1. Schema dei protocolli. Calibrazione con analita di interesse e testare la sua specificità viene effettuata immediatamente prima dell'inizio degli esperimenti. Il protocollo in vivo dovrebbe essere seguita per esperimenti fisiologici complessi e ex vivo per applicazioni farmacologiche. Taratura esperimento post dovrebbe essere fatto e preso in considerazione durante l'analisi dei dati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Enzimatica microelettrodo sensore. I dueDimensioni sensore utilizzato per applicazioni ex vivo sono mostrati, a 50 micron e 125 micron di diametro. Ciascun filo sensore estende in un tubo capillare per la connessione a un connettore terminale oro (non mostrato). Inserto mostra una punta del sensore rivestito con enzimi per la rilevazione di ATP. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Dual Channel Potenziostato. I canali potenziostato etichettati CH1 e CH2. 1) CH1 il collegamento del sensore ATP e 2) CH2 le Null collegamento sensore 3) connessioni che sono elettricamente accoppiati per l'elettrodo di riferimento. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 4. Impostazione sensore. L'acquisizione dei dati avviene in una gabbia di Faraday per ridurre il rumore elettrico e su un tavolo da laboratorio ad alte prestazioni per una superficie di lavoro senza vibrazioni. 1) Una tabella chirurgica temperatura controllata viene utilizzato per mantenere la temperatura corporea degli animali durante gli esperimenti fisiologici 2) micromanipolatori sono attaccati agli adattatori di montaggio magnetici per il posizionamento flessibile dei sensori durante l'esperimento 3) Una sorgente di luce è necessaria per procedure chirurgiche e inserimento sensore 4 ) a doppio canale potenziostato 5) Supporto per i sensori. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 5. Voltammetria ciclica. Per ex vivo studi, sensore voltammetria ciclica è condotto per 10 cicli tra -0.5 e 0.5 V prima del protocollo di calibrazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Calibrazione Amperometry ex vivo. (A) Calibrazione utilizza l'aggiunta di concentrazioni di ATP noti alla soluzione del bagno. Corrispondente amperometriche registrati a livello di asintoto (traccia nera). Le correnti ottenute creano una equazione di taratura. Un esempio è mostrato sul pannello di destra. La traccia rossa è il current del sensore Null che risponde alla sola aggiunta di H 2 O 2. (B) Il sensore Null è calibrato con l'aggiunta di H 2 O 2 conosciuto concentrazioni (frecce rosse), per la soluzione del bagno e gli asintoti amperometriche sono registrati (sottili frecce nere). L'aggiunta di catalasi alla soluzione del bagno (spessore freccia nera) si traduce in rapido decadimento corrente. Il pannello di destra mostra il Null equazione di taratura del sensore. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Calibrazione Amperometry per;. In Vivo taratura del in vivo elettrodi viene eseguita in modo simile a quella di cui gli studi ex vivo eccetto reazioni di riduzione causare una corrente inversa (polarità). (A) L'aggiunta di concentrazioni di ATP noti produce una corrente amperometrico sul sensore ATP (traccia nera), ma non ha alcun effetto sul sensore Null (traccia rossa). Aggiunta apyrase spegne la corrente del sensore ATP. (B) La specificità del sensore ATP viene confermata mediante l'aggiunta di 10 mM di diversi agenti purinergici (UTP, UDP e adenosina). Ulteriori applicazioni di ATP forniscono una corrente amperometrico rilevabile stabile. (C) Microfotografia dei sensori in vivo sulla base di un elettrodo d'oro mediatore rivestito. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo figuri.
Figura 8. Coppe rene. Negli studi in vivo, i reni si svolgono ancora utilizzando le tazze di rene in acciaio inox indicate. Due dimensioni di tazze sono utilizzati per accogliere variazione dimensionale rene. Queste tazze di ridurre gli artefatti di movimento che vengono generati dalla respirazione degli animali. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 9. Ex Vivo isolati e perfusi rene. Il rene isolato viene inserito in un piatto 1) Petri rivestito con una spessa sibottom licone per pin inserimento 2) l'arteria renale è cannulata e collegato ad una pompa a siringa per perfusione costante durante l'esperimento 3) il sensore ATP, 4) e il sensore Null sono inseriti nel rene 5) l'elettrodo di riferimento è posizionata vicino al rene sommersa nella soluzione del bagno. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 10. In Vivo Sangue Rene perfusi. (A) Il rene sinistro è esposto e messo in una tazza rene, il rene destro rimane intatta all'interno dell'animale. Entrambi i sensori sono inseriti nel rene. BSA: NaCl è infuso attraverso la vena giugulare cateterizzato per contrastare la perdita di liquidi causata by sono inseriti grande mid-linea di incisione (B) Esempio di esperimento in vivo con un catetere interstiziale impiantato per applicazioni farmacologiche dirette 1) il rene è tenuto da una tazza rene 2) Sensore ATP 3) Sensore Null e 4) elettrodo di riferimento nella superficie ventrale del rene 5) catetere impiantato nel rene e collegato a una pompa peristaltica per l'infusione farmacologica laminari. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 11. Ex Vivo Analisi di H 2 sub> O 2 nel rene. Ang II perfusione provoca H 2 O 2 rilascio nella corteccia rene di ratto. (A) i cambiamenti in tempo reale della media H 2 O 2 concentrazione (barre grigie mostrano errore standard) su un totale di N = 8 applicazioni (4 reni da 4 ratti diversi). Barre sulla parte superiore rappresentano applicazione Ang II. (B) L'H 2 O 2 massimo valori di ampiezza concentrazione durante Ang II perfusione per Sprague Dawley (SD) e Dahl sensibili al sale (SS) ratti nutriti con una bassa e alta diete sale, rispettivamente. * - P <0,05 rispetto ratti SD. Il dato è tratto dal riferimento 12 con il permesso. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 12. In Vivo Analisi di H 2 O 2. Esempio della valutazione in vivo della concentrazione interstiziale H 2 O 2 nel midollo di un ratto SS alimentati con una dieta povera di sale (come mostrato in Figura 10B). L'applicazione interstiziale di catalasi tramite un catetere impiantato per l'intervallo 5 min prodotto un blocco totale del segnale H 2 O 2 nel midollo renale. Riduzione di catalasi, dal dilavamento da parte del flusso ematico renale, ha determinato un parziale recupero del segnale, che è stato bloccato ancora una volta da un'applicazione aggiuntiva catalasi (10 min). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Gli attuali protocolli sono stati sviluppati per fornire una maggiore risoluzione temporale e spaziale di ATP e H 2 O 2 di segnalazione per ex vivo isolati, perfusione e in vivo reni sangue-perfusione. Le differenze tra i protocolli ei sensori utilizzati qui garantiscono l'acquisizione dei dati ottimale sia per gli agenti farmacologici o studi fisiologici. I protocolli sono costituiti da 1) calibrazione del sensore, 2) intervento chirurgico, 3) l'installazione di acquisizione dati, e 4) analisi dei dati. Permettono le misurazioni in tempo reale di analiti per numerose condizioni sperimentali. Questo porterà a una maggiore approfondimenti malattie renali e lo sviluppo di più efficaci trattamenti farmacologici. Qui abbiamo usato sensori per analizzare ATP e H 2 O 2. Tuttavia, sensori per altre sostanze sono anche disponibili e possono essere utilizzati. I protocolli descritti qui sono stati applicati per studiare ATP e H 2 O 2 in reni di ratto, ma lo stesso metod può essere facilmente regolato per l'applicazione nei topi. Così, questo approccio ha un grande potenziale vista l'abbondanza di modelli di roditori genetici.
Il disegno di base di biosensori microelettrodi enzimatici è stato sviluppato nel 1960 da Clark e Lione 2. In seguito allo sviluppo iniziale di biosensori, i progressi sono stati fatti sia nel design 17-19 e 20 applicazioni. Llaudet et al. 21,22 sviluppato la struttura fondamentale del ATP sensori utilizzati nella presente protocolli durante l'utilizzo di metodi di Cosneir et al. 23 per il rivestimento enzima. Questi sensori hanno rilevato segnalazione ATP in una serie di processi fisiologici, tra cui ATP rilascio dagli astrociti cerebrali 8, regolazione di respirare 4,24, e nel muscolo scheletrico regolazione arteriole 25. Recentemente il protocollo ex vivo è stato usato per misurare la segnalazione ATP nei reni 12. L'obiettivo di questo manoscritto is per fornire indicazioni efficaci e approfondimenti per l'individuazione di sostanze endogene come ATP nei reni.
Biosensori enzimatici microelettrodi hanno molti vantaggi rispetto mezzi esistenti per misurare analiti in vivo. Tuttavia, precauzioni particolari dovrebbero essere utilizzati per questo approccio per qualsiasi altro nuovo metodo. Convalida con un approccio consolidato fornisce fiducia nei dati ottenuti. Ad esempio, sono state effettuate le misurazioni di microdialisi come descritto in precedenza 26,27. Nessuna differenza significativa è stata osservata tra le concentrazioni di picco determinati dai sensori e quelli ottenuti dai campioni di dialisi 12. La limitazione di microdialisi è che misura solo i livelli allo stato stazionario di analita. Come tale, la valutazione delle variazioni dinamiche nella cella di segnalazione può essere raggiunto solo con l'uso dei biosensori enzimatici microelettrodo. Le specifiche manifattura dei tempi di risposta dei sensori differiscono fra sensoretipi. ex vivo sensori hanno un tempo di risposta di 5-10 sec e in vivo di sensori 30-35 sec per la salita del segnale da 10 al 90%. Le tracce di taratura (figure 6 e 7) dimostrano la risoluzione temporale dell'analita aggiunta / rimozione. Per entrambi gli approcci sensori e di microdialisi, l'uso di enzimi specifici per bloccare il segnale prodotto dal analiti è necessario per garantire la specificità.
I protocolli descritti hanno molte sfide. Come con qualsiasi inserimento sensori nel tessuto, si verifica il danno tissutale. Ciò potrebbe attivare vie di segnalazione che possono influenzare le misure 28. Per ridurre al minimo il danno cellulare, sarebbero necessari i sensori più sottili. Tuttavia, è difficile penetrare la capsula renale con i sensori in modo aghi sono usati per fare un piccolo foro di entrata. I sensori sottili sono più propensi a piegarsi e interrompere il loro rivestimento su inserimento. I sensori di diametro maggiore sono più resistenti alla flessione e il resultant danni al loro rivestimento. La figura 3 mostra un sensore sottile e di spessore. Oltre alla resistenza spessa del sensore di piegatura, che contengono uno strato più spesso di coating, fornendo una maggiore protezione per lo strato enzimatica. La preoccupazione di danno tissutale causato utilizzando sensori spessi era notevolmente meno in reni di quanto sarebbe nel tessuto cerebrale. La profondità di inserimento è approssimata e il posizionamento finale dovrebbe essere verificata dopo le misurazioni sul rene sono stati completati. Stima tra corteccia e midollo livelli utilizzando il sensore di lunghezza della punta come guida di inserimento e 'sufficiente, come la punta del sensore è di 0,5 mm e la corteccia del rene ha uno spessore di 2-3 mm. Incrostazioni del sensore si verifica anche ad una velocità maggiore di sangue, limitando così l'uso del sensore in tempo nei protocolli vivo per un esperimento. I tempi di registrazione di 1 a 1 ½ ora portato ad una piccola deriva sensore. I criteri principali per la valutazione delle prestazioni del sensore ridotto è l'scarsa sensibilitàall'analita durante il processo di calibrazione. Aumento rumore elettrico e instabilità della corrente di base possono anche indicare che la punta del sensore è danneggiato. Per misure accurate di ATP, entrambi i sensori (ATP e Null) devono avere caratteristiche di rumore e stabilità analoghi per l'ulteriore sottrazione del segnale. Altrimenti, uno dei sensori devono essere sostituiti. Per rumore basso e il rilevamento di piccole concentrazioni di analita, l'uso dei nuovi sensori per ogni animale è suggerito.
Diversi passaggi sono fondamentali per i risultati sperimentali di successo. I sensori sono molto fragili e devono essere maneggiati con cura per evitare di danneggiare la punta del sensore. Inoltre, dopo la reidratazione, i sensori non devono essere esposte all'aria per più di 20 sec. Registrazioni bassa rumorosità sono necessari per l'individuazione di segnali biologici nei tessuti. A tal fine, è necessaria una tabella Air Lab alte prestazioni e corretto collegamento a terra. L'aggiunta di quantità esatte di analita during frequenze di calibrazione è necessario per la determinazione della concentrazione accurata negli esperimenti. Raggiungere una buona compensazione del rene in ex vivo ambulatori renali si tradurrà in registrazioni di successo. L'uso di enzimi apyrase e catalasi in calibrazioni e in esperimenti consente la valutazione della sensibilità del sensore aspecifica e conferma le misurazioni.
Questi protocolli forniscono notevolmente migliorata dettaglio di segnalazione extracellulare nei reni. La maggiore sensibilità e risoluzione temporale offerta dai sensori possono permetterci di risolvere cambiamenti di ATP segnalazione negli stati di malattia e seguenti manipolazione farmacologica che erano precedentemente non rilevabili. Il protocollo in vivo è adatto per studi fisiologici complessi mentre ex vivo è ottimale per lo studio di applicazioni farmacologiche su reni. Il disegno del sensore in vivo qui utilizzato consente resistenza senza precedenti contro le interferenze in bltessuto ood-perfusi. Nel loro insieme, questi sensori offrono una grande quantità di applicazioni che in precedenza non erano possibili con i protocolli e le tecniche esistenti.
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Disclosures
Sensori per la registrazione video di questo manoscritto sono stati forniti da Sarissa biomedica Limited (Coventry, UK).
Acknowledgments
Apprezziamo Sarissa biomedica per il loro lavoro nello sviluppo dei sensori utilizzati nel presente manoscritto. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Heart, Lung, and Blood Institute concede HL108880 (A. Staruschenko), HL 116264 (A. Cowley) e HL 122.662 (A. Staruschenko e A. Cowley), un progetto finanziato dal Medical College of commissione per gli affari di ricerca Wisconsin # 9306830 (O. Palygin) e avanzando un sano Wisconsin Programma di Ricerca e Formazione # 9.520.217, e il giovane Investigator Grant del National Kidney Foundation (O. Palygin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensor Kit | Sarissa Biomedical | SBK-ATP-05-125 | The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes. Also included with the kit is the user's choice of sensors. |
| Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-ATP-05-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold ATP Biosensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-ATP-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe null sensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-NUL-20-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold null sensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-NUL-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe ATP Manual | Sarissa Biomedical | http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf | |
| Faraday cage | TMC | ||
| Dual channel potentiostat | Digi-Ivy | DY2021 | Type II Faraday cage |
| Data acquisition program | Digi-Ivy | DY2000 | |
| Perfusion pump | Razel Scientific Instruments | Model R99E | |
| Fiber optic illuminator | Schott | ACE 1 | |
| micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-8 | |
| air table | TMC | 63-500 | |
| isoflurane ventilator | LEI Medical | M2000 | |
| 3 ml petri dish | Fisher Scientific | S3358OA | |
| needle | Santa Cruz | 26-30 G | |
| pins | Standard dissection pins | ||
| catheter | Polyethylene tubing (PE50) | ||
| catheter tissue glue | Vetbond | 1469SB | |
| suture | Look | SP117 | |
| rubber bands | any 2-4 mm wide rubber bands | ||
| silicone | Momentive | RTV-615 Clear 1# | |
| clamp | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| standard dissection kit | Kit should include scalpel and dissection sissors | ||
| Kidney Cup | Of own design | ||
| standard chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | 100 mM ATP solution |
| hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A7646 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| isoflurane | Clipper | 10250 | |
| inactin | Sigma-Aldrich | T133 | |
| ketamine | Clipper | 2010012 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 |
References
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