In Situ Kartlegging av de mekaniske egenskapene til Biofilm av Partikkel-sporing Microrheology

Introduction

De fleste bakterieceller er i stand til å ansette både planktoniske (frittlevende) og overflate festet (fastsittende) måter vekst ^1. I det overflate festet modus for vekst, bakterieceller utskiller og omslutter seg selv i store mengder av ekstracellulære polymere stoffer (EPS) for å danne biofilmer. EPS består hovedsakelig av proteiner, exopolysaccharide, ekstracellulære DNA og er vesentlig for biofilmdannelse ^to. Det fungerer som en fysisk stillas der bakterier kan bruke til å differensiere romlig og beskytter bakteriene mot skadelige miljøforhold og vertsresponser. Ulike komponenter av EPS har forskjellige roller i biofilmdannelse ^{3 og} endringer i uttrykket av EPS komponenter kan dramatisk remodel biofilm strukturer ^4. EPS komponenter kan også fungere som signalmolekyler ^5, og nyere studier har vist visse EPS komponenter i samspill med mikrobielle celler til å veilede sine migrasjon og biofilm diffdifferensieringen ^6-8.

Forskning på EPS har sterkt avansert basert på morfologiske analyser av biofilm produsert av mutanter defekte i en spesifikk komponent i EPS ^9,10. I tillegg er EPS vanligvis karakterisert på makro-skala (bulk karakteristikk) ^11. Morfologisk analyse kan imidlertid mangle kvantitativ detaljer og bulk karakterisering, som returnerer gjennomsnittsverdier, mister den detalj som eksisterer innenfor heterogenitet av biofilm. Det er nå en økende trend å gå videre til sanntid karakterisering av de mekaniske egenskapene EPS på mikro-skala. Denne protokollen demonstrerer hvordan partikkel-sporing microrheology er i stand til å bestemme tid og rom virkningene av matrikskomponenter Pel og PSL exopolysaccharides på viskoelastisiteten og effektiv kryssbinding av Pseudomonas aeruginosa biofilm ^4.

Passiv microrheology er en enkel og rimelig rheology metode som gir den høyeste gjennomstrømningen av romlig microrheological sampling av et materiale hittil ^12,13. I passive microrheology, blir sonde kuler plasseres i prøven og deres Brownske bevegelser, som drives av termiske energier (k _B t) er etterfulgt av videomikroskopi. Flere partikler kan spores samtidig, og den tidsavhengige koordinatene til partiklene følge en konvensjonell tilfeldig gange. Derfor er, i gjennomsnitt, partiklene forblir i samme stilling. Imidlertid standardavviket forskyvningene eller den midlere kvadrerte forskyvning (MSD) av partiklene, ikke er null. Siden viskøse væsker strømmer, partikkel MSD i et viskøst fluid vokser lineært som tiden går. I motsetning til den polymere tverrbinding som finnes i viskoelastiske eller elastiske stoffer hjelpe dem til å motstå strømningen, og partiklene blir begrenset i sin forskyvning, som fører til platåer i MSD kurven (figur 1A). Denne observasjonen følger forholdet MSDαt α, hvor α er den diffusive eksponent som er relatert forholdet mellom elastiske og viskøse bidrag til forbindelsen. For partikler som beveger seg i viskøse væsker a = 1, i viskoelastiske substanser 0 <α <1, og i elastiske stoffer α = 0. MSD kan også brukes til å beregne krype compliance, som er tendensen for materialet til å deformeres permanent i løpet tid og anslår hvor lett et materiale oppslag.

Størrelse, tetthet og overflatekjemi av partikkelen er kritiske for riktig anvendelse av microrheological eksperiment, og er valgt med hensyn til systemet undersøkt (i dette tilfelle av polymerene i biofilmen matrisen, se figur 1B). For det første måler partikkel reologien av stoffet med strukturer som er meget mindre enn selve partikkelen. Dersom stoffet strukturer er av tilsvarende skala til partikkelen, bevegelse av particle blir perturbert av formen og orienteringen av de individuelle strukturene. Men hvis strukturer som omgir partikkelen er mye mindre, er denne effekten liten og gjennomsnitt ut, presentere et homogent miljø til partikkelen (figur 1B). For det andre, bør tettheten av partikkelen være lik mediet (1,05 g ml ^{-1 for} vannbaserte medier), slik at sedimentering unngås og treghetskrefter er ubetydelige. De fleste partikler med isopor innhegninger oppfyller kriteriene ovenfor. Ideelt sett betyr partikkel ikke reagerer med polymerene i biofilmen matrise som reologiske tolkningen av partikkel MSD er bare gyldig hvis bevegelse er tilfeldig, drevet av termisk energi og kollisjon med stoffstrukturer. Dette kan observeres ved å sjekke hvorvidt sonden partikkelen har en tendens til å binde eller sprette av overflaten av en pre-voksen biofilm. Men til tross for mangelen på tiltrekning til biofilmen, må partiklene være i stand til å bli inkorporert i matrisen.I tillegg kan de fysio heterogenitet av biofilm resultere i forskjellige partikler som er mer egnet som prober i forskjellige deler av biofilmen. Derfor bør partikler av forskjellige størrelser og overflatekjemi bli brukt til biofilmen.

Som sådan, er partikkel MSD i stand til å gi nyttig informasjon om hvordan forskjellige komponenter bidrar til reologien og spredning av biofilmen. Videre, bruk av forskjellige sonder gjør det mulig å utlede informasjon om den romlige fysio heterogenitet av biofilm. Denne fremgangsmåten kan brukes for å teste effekten antimikrobiell behandling på de mekaniske egenskaper av biofilm, eller anvendes for blandede arter biofilmer å undersøke hvordan de mekaniske egenskaper for biofilm blir endret fra innføringen av en annen art. Partikkel muskel- og skjelettlidelser kan også være nyttig for å karakter biofilm spredning. Slike studier vil være nyttig i vår forståelse av biofilm, potensielt forbedre biofilm behandlingernd prosjektering av biofilm for nyttige aktiviteter.

Protocol

1. Biofilm Dyrking

1. Utarbeidelse av bakteriestammer
   1. 1 dag før biofilm dyrking, forberede planktoniske bakteriekulturer ved inokulering 2 ml passende vekstmedium fra fryst bakteriekultur. Bruk Luria Broth-medium (10 g L ^-1 NaCl, 10 g L ^-1 gjærekstrakt, og 10 g l ^-1 trypton) for mucoid P. aeruginosa og dets Δ Pel og Δ PSL defekte mutanter. Inkuber over natten ved 37 ° C og 200 opm ryster betingelser. Fortynne natten kulturer til en OD ₆₀₀ på 0,40 ved hjelp av et spektrofotometer.
   2. Montere strømningscelle oppsett, som har blitt beskrevet tidligere ^14, fortrinnsvis på en mobil stasjon eller vogn som kan bringes inn i mikroskopet plass for avbildning av strømningscellen uten demontering.
   3. Forbered sterilt vekstmedium i to L eller 5 L flasker for hver flyt celle. Bruk minimalt medium M9 (48 mM Na ₂ HPO _4, 22 mmKH _{2PO 4,} 19 mM _NH4CI, 9 mM NaCl, 2 mM _MgSO4, og 0,1 mM CaCl ₂₎ supplert med 0,04% glukose (vekt / volum) og 0,2% (vekt / volum) kasaminosyrer) for P. aeruginosa flyt celle biofilm.
   4. Delmengde fluorescerende sfærer i Mikrosentrifugerør og spinne ned i sterile H _{2 O} for 5 min i sentrifuger ved 9,391.2 g. Fjern supernatant og resuspender i 1 ml vekstmedium for å fjerne natriumazid (desinfeksjonsmiddel) før tilsetning til vekstmediet i 2 L eller 5 L medium flasker.
      MERK: Ulike størrelser av mikrokuler kommer i forskjellige konsentrasjoner og bør fortynnes i henhold til instruksjonene. For eksempel, disperse 120 ul av 1,0 um diameter mikrokuler, 15 ul 0,5 um diameter mikrokuler og 0,96 mL av 0,2 um diameter mikrokuler inn i 2 liter vekstmedium for å gi 2,18 x 10 ⁶ ml mikrokuler ^-1 for hver partikkelstørrelse.
   5. Fest medium flaske til upstpakke med flyt celle og la vekstmedium å strømme gjennom hele oppsettet. Stoppe flyten og injisere utvannet natten kulturer inn i flyten cellekammerene. Tillater bakterier å feste til dekkgrunnen i 1 time før kontinuerlig flyt av vekstmedium ved en strømningshastighet på ca. 5,5 x 10 ^-3 m sek ^-1, eller 8 rpm med en peristaltisk pumpe.
      MERK: Biofilm blir vanligvis dyrket ved romtemperatur (25 ° C) i 3-7 dager.
   6. Alternativt, for statisk oppsett kultur, fortynnet 100 ganger natt kulturer i mikrosentrifugerør ved tilsetning av 10 ul av natten kultur til 1 ml vekstmedium med partikler. Øke partikkelkonsentrasjonen i vekstmediet for statisk kultur med omtrent 500 ganger høyere enn den som anvendes for strømnings biofilmer (f.eks vaske og resuspendere 600 ul av 1,0 um diameter kuler i 10 ml vekstmedium) som strømningscelle biofilm blir stadig etterfylles med partikler, men statiske kulturer ikke.
      1. Tilsett 2001; l av fortynnet natten kultur med partikler til kamrene 8 brønn lysbilder. Inkuber ved 37 ° C under statiske betingelser. Biofilm er vanligvis vokst for en dag. Erstatt brukt vekstmedium daglig med frisk vekst medium med partikler hvis biofilm er dyrket i mer enn en dag.

2. Mikros

1. På dag 3 og 5, slå av strømmen fra peristaltisk pumpe og bringe flyt celle oppsett inn i mikros rommet. Klemme slangen nær inngangen og utgangen av den flyten cellekammerene å hindre drift (en systematisk feil forårsaket av endringer i miljøet) fra flyt. Plasser strømningscellen på objektbordet av en oppreist mikroskop.
   MERK: Bruk en invertert mikroskop for avbildning av mikrobrønner.
2. Bruke fluorescerende mikroskopi med 40X objektiv olje til videoopptak av mikrosfære bevegelse innleiret i biofilmen på forskjellige steder (mikrokolonier og flate udifferensierte lag) og på forskjellige dager (dag 3 og 5) fortidsmessige og romlige undersøkelser. Ta kortere videoer med høyere bildefrekvens til å etterforske hendelser som forekommer innenfor korte tidsskalaer (f.eks 1,5-3 min videoer på bildefrekvens på 25-50 bilder per sekund for raske dynamikk), og lengre videoer med lavere bildefrekvens for å undersøke arrangementer over lengre tid skalaer (f.eks 15-30 min videoer på bildefrekvens på 2,5-5 bilder / sek for tregere dynamikk).
   MERK: En video inneholder typisk 5-10 partikler, og er typisk for 1,0-2,5 GB i filstørrelse. Større mikrokolonier kan holde flere partikler. Ta 5-10 videoer for hver kategori (f.eks 5-10 videoer av forskjellige mikrokolonier og forskjellige steder i flate udifferensierte lag). Biofilm har en heterogen arkitektur som kan bestå av mikrokolonier, kanaler, hulrom og flate udifferensierte lag.
3. Lagre videoer i passende format som kan leses av Fiji / ImageJ (f.eks CZI, tif).
4. Sjekk videoer for drift ved å bla gjennom ferdige video og observere at partiklene ikke beveger seg i samme retning samtidig. Drift kan være forårsaket av z-trinns bevegelse, strømmer i strømningscellen, ubalanse av anti-vibrasjonsbord, lufttrykk eller temperaturendringer. Riktig mindre drivende ved hjelp av etterbehandlingsteknikker vanligvis følger med mikroskop programvare. Kast noen videoer hvor drift ikke kan korrigeres. Spill følgende parametere, som er nødvendig i løpet Particle Tracking Analysis: Oppløsning (px / um), Antall Rammer, varighet.
5. Fjern flyt celle fra mikroskop scenen og starter peristaltisk pumpe til å fortsette å dyrke biofilm.

3. Particle Tracking Analysis

1. Skaff partikkel baner ved hjelp av plug-in TrackMate i åpen kildekode (ImageJ). Last ned Fiji på http://fiji.sc/Fiji. Åpne video med Fiji og under Plugins menyen, velg Sporing og TrackMate.
2. Sjekk eller juster innstillingene i the vindu tyder innledende kalibreringsinnstillinger for å matche video parametere som registreres i trinn 2.4.
3. Oppdage partikler i TrackMate hjelp ImageJ.
   1. Velg "logg detektor ', innspill partikkeldiameter og terskelverdi (f.eks 1000). Bla gjennom videoen mens klikke på "Preview" for å sjekke at de lilla sirklene følge partiklene hele videoen. Juster diameter og terskelverdiene som er nødvendig: øke terskelverdien hvis lilla sirkler vises i den tomme plassen. Reduserer terskelverdien hvis ikke nok partikler blir detektert. Klikk på Neste-knappen for å fullføre påvisning partiklene.
   2. Klikk på Neste når presentert med muligheten til å legge til eller fjerne partikler påvist i 'Initial thresholding', 'Velg en visning "og" Velg en filter' vinduer for å fortsette uten justering dersom innledende partikkeldeteksjon var tilfredsstillende.
   3. Velg "Simple LAP tracker" i optipå bar av 'Velg en tracker metode vinduet som partikler sjelden flytte ut av fokus i biofilm og er lett spores. Bruk foreslått eller lav linking og gap-avslutt max avstandsverdiene, og klikk på Neste.
   4. Sjekk at partikkel sporing er tilfredsstillende ved å bla gjennom videoen for å se at partikler følge sporene trukket av TrackMate, og at det ikke er noen uønskede eller mangler spor. Hopp ulike filtreringstrinn. Gå til siste vinduet "Velg en handling". Velg 'Eksporter sporene til xml fil "fra rullegardinmenyen, og klikk" Kjør ". Velg en mappe for å lagre spor.
      MERK: Det finnes ulike programmer tilgjengelig i den offentlige sfæren for analyse av partikkelbaner og bruk av microrheology. msdanalyzer og TrackArt er eksempler på partikkel sporing analyseprogrammer som kjører i Matlab miljø.
4. Forbered Matlab å importere partikkel baner i XML-filer ved å velge i menyen påMatlab File> Angi bane ... og legge skriptene mappen tilgjengelig med Fiji pakken.
5. Å analysere partikkelbaner med msdanalyzer, laste ned koblingen til zip-filen eller tar.gz fil at http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories .
   1. Pakk utmsdanalyzer mappen ^{15 og} slippe den i en mappe som tilhører Matlab banen (f.eks C: Documents and Settings <brukernavn> Mine dokumenter Matlab). Starter Matlab og initiere analysatoren ved å skrive:
      ma = msdanalyzer (2, "um", "sec")
      hvor um og sec er de fysisk tid og enheter i videoen.
      1. Importere partikkelbaner ved å skrive:
         [spor, md] = importTrackMateTracks ('FileName.xml', 'clipZ'; 'Scalet')
         ma = ma.addAll (spor);
         der 'clipZ' fjerner z dimensjon for en 2D video, og 'Scalet'.
      2. Plotte baner bort på grafen ved hjelp av:
         ma.plotTracks;
         ma.labelPlotTracks;
      3. Beregne muskel- og skjelettlidelser av partiklene ved hjelp av:
         ma = ma.computeMSD;
         ma.msd
      4. Plotte muskel- og skjelettlidelser av hver partikkel:
         figur
         ma.plotMSD
      5. Kombiner partikkelbaner fra andre videoer av samme categery (f.eks partikler innebygd i vill-type mikrokoloniene på dag 3) ved å gjenta 3.5.1.1 til 3.5.1.4).
      6. Plott ensemble bety eller i gjennomsnitt over alle kurver:
         ma.plotMeanMSD
         Endre y- og x-aksen fra lineær til logaritmisk skala. Ved lange etterslep ganger, MSD kurvene bli bråkete på grunn av utilstrekkelige statistikk på lengre tidsskalaer. MSD kurvene kan også stige bratt på grunn av dynamiske feil. Disse områder av kurven kan fjernes ved hjelp av børsten verktøyetå velge enden av kurven og velge "Børsting"> "Fjern Unbrushed" i Verktøy-menyen.
   2. Last ned Ezyfit på http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/ og legge Ezyfit til en mappe som tilhører Matlab banen (f.eks C: Documents and Settings <brukernavn> Mine dokumenter Matlab). Installer Ezyfit menyen ved å skrive inn Matlab arbeidsområdet efmenu installere. Starte MATLAB med Ezyfit menyen i figuren vinduet. Monter MSD kurvene til makten loven ved å velge i menyen Ezyfit "Show Fit"> "Strøm"> "a * x ^ n 'var n er estimert diffusive eksponent α.
      MERK: msdanalyzer krever Curve Montering Toolbox i Matlab for montering av MSD ​​kurver. Ezyfit er et alternativ og gratis programvare som kan utføre kurvetilpasning.
   3. Fjerne aktuelle partikkelbaner og muskel- og skjelettlidelser å beregne nye partikkel muskel- og skjelettplager på andre steder eller tid:
      klar Etter beregning av ulike gjennomsnitts MSD kurver av partikler i mediet (kontroll), og mikrokolonier og udifferensierte områder av ulike stammer, kopiere og lime inn kurver i én graf for sammenligning. Eksempel stivhet og kryssbinding økning med lavere MSD verdier. Flate kurver har lavere α og prøven er mer elastisk enn brattere kurver med høyere α.
   4. Velg kurven og gå til "Verktøy" for å se på data statistikk, slik som median og range. MSD av vulsten er proporsjonal med krype compliance, J (t) av det materiale i hvilket vulsten er innleiret i henhold til relasjonen
      
      hvor J = krype compliance, d = partikkeldiameter, k _{B =} Boltzmans konstant, T = temperatur og t = tid.

Representative Results

De lokale viskoelastiske egenskaper for biofilm i forskjellige regioner av biofilm, som omfattet hulrommene (mellom over biofilmen), flater (udifferensiert flate lag av celler) og mikrokolonier (se etiketter i figur 2A) ble undersøkt. Den tidsmessige endringer i viskoelastiske egenskaper av biofilm under modning fra dager 3 til 5 ble også bestemt. MSD av partiklene i hulrommene ble anvendt som en kontroll, og kan sammenlignes med MSD av partikler i rent medium. I motsetning til dette, partikler fanget i biofilm vibreres ved faste posisjoner, og MSD varierte verdiene fra de som er typiske for viskoelastiske materialer sterkt elastiske geler (figur 3).

Mucoid P. aeruginosa villtype og dets Δ Pel mutantstammer (figur 2a og 2b) utviklet mikrokolonier spredt på en tynn vanlig etter dag 3 i sine biofilm. Sletten på dag 3 var for tynn forundersøkelse av reologiske egenskaper. I begge biofilmer dannet av mucoid P. aeruginosa villtype og Δ pel stammer, MSD av partikler i dags- 3 mikrokoloniene var uavhengig av tid for tidsforsinkelser på 0,1 sek til 10 sek (α = 0), noe som indikerer at mikrokoloniene ble elastiske (figur 4, tabell 1) . Median krype compliances beregnet ut fra de tilsvarende partikkel muskel- og skjelettlidelser var 4,3 x 10 ^-2 Pa ^-1 og 3,6 x 10 ^-2 Pa ^-1 hhv. Etter dag 5 krype overholdelse av mikrokoloniene i mucoid P. aeruginosa villtypestamme øket til 2,5 x 10 Pa ^{-1 -1,} noe som indikerer en reduksjon i effektiv tverrbinding inne i matriksen. Dagen 5 mikrokoloniene var fortsatt elastisk med α = 0. Δ pel endret seg ikke i reologi fra dager 3 til 5. slettene i mucoid P. aeruginosa vill-type og S pel stammer var simiLAR i elastisitet (α = 0) og effektiv kryssbinding til dag 3 mikrokolonier, noe som kan være representative for deres modenhet (udifferensiert struktur).

Biofilmer dannet av Δ psl mutant stamme (figur 2C) var mindre differensiert og forsinket i utvikling. Dette resulterte i biofilmer med tykke slettene som utviklet mikrokolonier etter dag 3. MSD verdier viste at biofilm var mye mindre effektivt tverrbundet enn P. aeruginosa vill-type og S pel stammer (figur 4, tabell 1). Slettene var viskoelastisk, med α = 0,12 og 0,26 på dager 3 og 5 kroner. Median krype overholdelse av dag 3 og 5 slettene var 1,0 Pa ^-1. Når mikrokoloniene hadde utviklet seg i dag 5, hadde krype samsvar redusert til 2,8 x 10 Pa ^{-1 -1,} noe som indikerer at en terskelkryssbinding er nødvendig for microcolony differensiering. However, krype compliance var fortsatt større enn krype overholdelse av yngre dag 3 mucoid P. aeruginosa villtype og Δpel mikrokolonier. Dagen 5 mikrokoloniene var viskoelastisk med α = 0,34. Dermed blir P. aeruginosa biofilm er elastisk og sterkt tverrbundet i fravær av Pel. I fravær av psl, ble biofilmen viskoelastiske og mindre tverrbundet. I de modne biofilm strukturer som de mikrokoloniene, uttrykk for både Pel og PSL exopolysaccharides resulterte i distinkte reologiske forskjeller over tid. Reduksjonen av kryssbinding kan være på grunn av reduksjon av PSL til Pel exopolysaccharides i biofilm-matrisen under modning.

Fig. 1: Partikkel tracking microrheology i en biofilm (A) Gray sirkler viser partikkel MSD i en viskøs substans, som vokser lineært med tiden ogα = 1. svarte trekanter viser partikkel MSD av et elastisk stoff, som er uavhengig av tid og a = 0. (B) Diagram av probe partikkel vibrerer i EPS av biofilm. Partikkelen er modellert som en bakteriecelle, og ligner i diameter. De matrikspolymerer som omslutter partikkelen er mye mindre enn partikkel.

Figur 2: P erspecti v e og sectional vi e w av d en y 5 biofilm (grønn) b y con f ocal mikroskop, p y etter conti n tinuerlig < strong> f eeding med 1,0 μ m (purpur), 0,5 μ m (rød) og 0,2 μ m (orange) pa r partikler med negativt ladet karboksylerte overflate. biofilmer dannet av (A) mucoid P. aeruginosa, og mutanter (B) Δ pel og (C) Δ psl stammer. Partiklene blir inkorporert i alle regioner av biofilm. Eksempler på mikrokolonier, vidder og hulrom er merket i (A). Modifisert fra Chew et al., MBio 2014 ^fire. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

fig3.jpg "/>
Figur 3:. Partikkel baner Sammenligning av et spor av en partikkel utførende Brownske bevegelser i vekstmedium (flerfarget) sammenlignet med spor av partikler vibrerende i biofilm mikrokolonier (mørk blå). De segmenterte farger indikerer brudd i sporing på grunn av partikkel flytter ut av fokus i z-planet.

Figur 4:. Muskel- og skjelettplager av 1,0 mikrometer partikler i biofilmer Mucoid P. aeruginosa er elastisk og mikrokolonier er redusert i effektiv kryssbinding fra dag 3 til 5; Δ pel er elastisk og endrer ikke på reologi fra dager 3 til 5; Δ PSL er viskoelastisk og består i hovedsak av slettene som ikke endres vesentlig i reologi fra dager 3 til 5.

Press	Dag	Region </ td>	Median Creep Compliance (Pa -1)
vill type	3 dagers	Microcolony	4,3 x 10 -2
vill type	5 dagers	Microcolony	2,5 x 10 -1
vill type	5 dagers	Plain	4,1 x 10 -2
Δpel	3 dagers	Microcolony	3,6 x 10 -2
Δpel	5 dagers	Microcolony	3,6 x 10 -2
Δpel	5 dagers	Plain	3,2 x 10 -2
Δpsl	3 dagers	Plain	1,0 x 10 0
Δpsl	5 dagers	Plain	1,0 x 10 0
Δpsl	5 dagers	Microcolony	2,8 x 10 -1

Tabell 1: Median sigebrudd og estimerte diffusive eksponenter for villtype og mutant stammer ifølge biofilm alder og region.

Discussion

Microrheology er et nyttig verktøy for lokale reologiske målinger i heterogene systemer, for eksempel mikrobiell biofilm. Det er en ikke-destruktiv teknikk, slik at sanntidsovervåking av reologiske endringer innen samme biologiske prøven over flere tidspunkter. I denne protokollen, ble partikkel-sporing microrheology påført Pel og PSL exopolysaccharide mutanter for å undersøke hvordan de påvirker elastisitet og effektiv kryssbinding av biofilm matrise. PSL favoriserer utvikling av elastiske biofilmer med høy effektiv kryssbinding, mens Pel favoriserer viskoelastisk og løsere biofilm. Når begge exopolysaccharides er produsert, blir biofilm-mikrokoloniene mindre effektivt kryssbundet som biofilm modnes, i samsvar med en reduksjon i PSL løpet Pel.

Biofilm dannes av ulike bakteriearter har forskjellige EPS komposisjoner. EPS av mucoid P. aeruginosa-stammene som ble brukt i denne studien hovedsakelig consi m av exopolysaccharides ^16. Andre arter kan bruke store ekstracellulære adhesjonsproteiner ¹⁷ og ^DNA-18 som sine viktigste komponentene i EPS. Tilnærmingen er beskrevet her kan brukes til å bestemme bidraget fra andre reologiske EPS komponenter og deres effekt på veksten. I tillegg kan biofilmer dyrket i forskjellige oppsett har drastisk forskjellige fysiske egenskaper som påvirker deres reologi. For eksempel, slimet P. aeruginosa supplert med glukose danner mer biofilm med høyt differensierte strukturer i henhold til flyt i forhold til statiske forhold. Studier har også vist at biofilm utsatt for skjær stress som flyt gjør biofilmer mer sammenhengende og elastisk ^19,20. Viktige skritt og faktorer å vurdere for vellykket biofilm partikkel-sporing microrheology studien er som følger:

Systemet dimensjoner for etterforskning eller omfanget av interesse med hensyn til tid og rom

innhold "> Når man vurderer romlige skalaer, må en vurdere størrelsen av strukturene som gir opphav til de viskoelastiske egenskapene til systemet (i vårt tilfelle, kan polymerene i biofilmen matrise) skal. Polymerene som omgir sonden partikkelen være mye mindre i struktur enn partikkel og presentere en isotrop miljø til partikkelen. Høy oppløsning avbildning er nødvendig for å fange opp små partikkelbevegelse eller vibrasjoner, men vil redusere mengden av området avbildes for ekvivalent filstørrelse. Når man ser på tidsskalaer, elastiske biofilmer som oppviser langsomme dynamikk krever videoopptak over lengre tidsskalaer (f.eks hr) og ved hjelp av lav bildefrekvens (f.eks min). Kortere videoer kan tas for viskoelastiske biofilmer med raske dynamikk (min), men krever høyere bildefrekvens (sek eller millisek). Ved hjelp av egnet oppløsning, bildefrekvens, video varighet for hvert forsøk vil holde filstørrelser lav for medgjørlig analyse.

Biofilm viskoelastisiteten, hanterogeneity og dimensjoner

Partikkelbevegelse kan være umulig å oppdage i svært elastiske biofilmer (MSD <10 ^-4). I slike tilfeller er aktive microrheological teknikker som gjelder kraft for å forskyve partikkelen er å foretrekke. Reologisk prøvetaking av ulike regioner av biofilm bør gjøres for å sikre den mekaniske heterogenitet av biofilm er tatt. Heterogen morfologi, er imidlertid ikke nødvendigvis en god indikator på mekanisk heterogenitet, som til tross for homogene skinn biofilm kan være sammensatt i reologi: Δpsl biofilmer er mer homogene i morfologi og forsinket i differensiering, men har en kompleks og heterogen reologisk profil. I motsetning til dette, Δpel biofilmer har et heterogent utseende med godt differensiert mikrokolonier, men en konstant reologi gjennom biofilm. For biofilmer med store microcolony dimensjoner (for eksempel> 50 um i diameter og høyde), kan det være meningsfylt study reologiske forskjeller i henhold til høyde (toppen og bunnen av mikrokolonier), eller avstanden fra microcolony kanten.

Valg av probe partikler

Som beskrevet ovenfor, bør størrelsen av partiklene være større enn strukturene av materialer som gir opphav til sine viskoelastiske egenskaper. I tillegg kan partikler med forskjellig overflatekjemi resultere i binding til forskjellige områder og EPS-komponenter i biofilmen. Således kan virkningene av partikler med forskjellig overflatekjemi bør undersøkes slik at biofilm heterogeniteten kan betraktes. Alle probe partikler bør ha en høy zetapotensial å minimalisere agglomerering. Partikler som binder sammen kan ikke brukes som nøyaktige prober og bør utelukkes fra analyse.

Minimering av drift

Drift kan være forårsaket av temperatur- eller trykkforandringer, luft objektbord bevegelse (vanligvis i z-retningen), anti-vlikevekt i tabell ubalanse og intern flyt i systemet. Driver vanligvis resultere i superdiffusion av partikkelen og α> 1. En α> 1 indikerer at andre enn termisk energi, aktive prosesser er involvert i bevegelse partikkel og passiv microrheology er ikke aktuelt.

Riktig biofilm kultur vedlikehold

Flyt celler må være riktig montert for å hindre lekkasjer og biofilm må holdes fri for urenheter. Biofilmer kan også dyrkes i andre oppsett alternativ til strømningscellen, slik som lysbilder og mikrobrønner for statiske dyrkingsbetingelser. Et invertert mikroskop som skal brukes for avbildning av mikrobrønner.

Oppsummert er partikkel sporing microrheology en nyttig teknikk som kan brukes ved hjelp av mikroskop standard til et biologisk laboratorium. I tillegg programmer som er involvert i beregning og analyse av partikkel muskel- og skjelettlidelser er lett tilgjengelig i den offentlige sfæren.For eksempel msdanalyzer og TrackArt ^{21 (http://www2.sbs.ntu.edu.sg/staff/rskraut/index.php/trackart)} er programmer som kjører i Matlab miljø. Imidlertid, fordi teknikken baserer seg bare på termisk energi for å bevege partiklene, er det ute av stand til å løse mellom prøver av høyere elastisitet. Aktive teknikker, slik som magnetiske tweezing, påføre en kraft på partikkelen til å virke på og bevege seg i prøven, og ville være i stand til å bestemme viskoelastisiteten til høyelastiske prøver.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorspheres	Invitrogen	F-8821	1.0 μm red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification
Zeiss Axio Imager M1	Carl Zeiss		Epifluorescent Microscope
Masterflex L/S Digital Drive 07523-80	Cole-Parmer	EW-07523-80	Peristaltic pump
Flow Cell Chambers	Technical University of Denmark
Bubble Trap	Technical University of Denmark
Silicone Tubing	Dow Corning		3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter
Clear polypropylene plastic connectors	Cole Parmer	06365-83	1/16 in. (1.588 mm)
Binder Clips			To clamp tubing
Coverslips	Thermo Scientific™ Nunc™	50 x 24 mm
Syringe 3 ml	Terumo
27  G Needle	Terumo
2  L Storage/Media Bottles	VWR®
Trolley			To hold biofilm setup