Introduction
Cellemigrering er koordinert og meget viktig for mange fysiologiske prosesser slik som vev utvikling, reparasjon og regenerasjon samt patologiske prosesser slik som cancer metastase og arteriosklerose 1. En forståelse av cellemigrasjon er særlig relevant for nye behandlingsformer som brukes til å reparere skadet vev og behandle patologiske tilstander, inkludert celletransplantasjon teknologier og kunstig vev pode 2. Gitt den nåværende interesse i rollen mesenchymale stromaceller (MSC) i formidling vev reparasjon 3, kvantifisere den vandrende kapasitet på disse cellene ved hjelp av en metode som er strengt kvantifiserbare, tilpasningsdyktig, og kostnadseffektiv er av interesse. Viktigere, må en slik analyse er tilstrekkelig følsomt til å detektere forholdsvis små endringer i cellulær trekkende kapasitet etter skade. Dagens metoder for å kvantifisere cellemigrasjon, inkludert skrape analyser, trans-brønners migrasjonsanalyser (Boyden chAmbers), micropillar arrays og celle eksklusjon sonen analyser har en rekke begrensninger i reproduserbarhet, skreddersy, kvantifisering og kostnadseffektivitet 1,4,5. Den optimaliserte scratch analysen beskrevet her demonstrerer robuste resultater, kvantifiserbare og bildebaserte analysemuligheter, kostnadseffektivitet og tilpasning til andre programmer.
Skrape-analyser er blitt brukt i flere kapasiteter for å vurdere cellemigrering og proliferasjon under forskjellige eksperimentelle betingelser 5. Analysen innebærer utsåing de utpekte celler, dyrke dem til å fullføre eller nær konfluens, og skrape den resulterende monolaget med en steril nål eller pipettespiss 6. Analysen er oftest utført ved å sammenligne bredden av bunnen i løpet av flere tidspunkter på tilfeldig valgte steder 7-9. Til tross for sin fremtredende bruk blir skrape analysen forvirret av problemer med reproduserbarhet og kvantifisering. Variasjon igenerering av bunnen ikke bare endrer mikromiljøet av cellene, men kan også hindre cellemigrasjon ved å skade platens overflate og det underliggende ekstracellulære matriks-5. Analyser blir ofte utført i løpet av 7 til 12 timer, men for cellelinjer som viser langsommere migrasjon og lengre analysetider, blir proliferasjon en forvirrende variabel 7,10. Til slutt kan senescent celler generert av skrape prosessen slipper faktorer som forstyrrer den ekstracellulære signal nødvendig å lukke gapet i monolaget en. Optimalisering av skrape assay krever at det opprettes en jevn gap som ikke interfererer med overflateegenskaper, minimerer assay tidslengde, og som forhindrer uønsket celledød under manipulasjon. Stopperen baserte analysen er en optimering av en celle utelukkelse sone assay. Denne analysen benytter en stopper plassert i midten av brønnen som ekskluderer cellevekst, men gjør det mulig for cellene å bli belagt rundt den sentrale utelukkelse sone.For å vurdere migrasjon, blir proppen fjernes, og den resulterende utelukkelse sone tilveiebringer en overflate for migrering til å oppstå. Imidlertid er denne analysen vanskelig å tilpasse eller tilpasse 10, og for noen anvendelser, kan denne teknikken også være kostnads prohibitive.
I motsetning til skrape assays og deres derivater, trans-brønns migrasjon assays (eller Boyden kammer assays) vurdere migrering ved å kvantifisere antallet celler som beveger seg fra et kammer, gjennom en mikroporøs filtermembran, inn i et kammer som inneholder kjemotaktiske midler 8,11, 12. Denne teknikk har begrenset nytte for adherente celler som MSCer fordi etter migrasjon gjennom den porøse membranen, celler holder seg til den membransiden utsatt for de kjemotaktiske midler, og kan være vanskelig å nøyaktig kvantifisere. Mens analysen er i stand til å undersøke noen tredimensjonale vandringsmønster, de begrensede celletyper som det er i stand til å nøyaktig tallfeste celle migrasjonsgrensen sin nytte 10. Et annet alternativ til skrape analyser benytter en mikro søyle matrise, som måler celle motilitet gjennom en tre-dimensjonale rommet ved hjelp av evnen til cellene for å deformere og migrere inn i matrisen som et surrogat. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastomerer herdet over en nøyaktig form og behandlet med ozon og fibronektin frembringer et homogent og ikke-nedbrytbare mikromiljøet. Mikro pilaren avstanden kan også varieres etter behov for å måle evnen til cellene til å gå inn i matrisen 4. Formen er skapt gjennom dypreaktiv ioneetsing av silisiumskiver for å skape en negativ versjon av høyt aspektforhold-matrise 13. Mens analysen styrkes ved sin customizability, evne til å modellere tredimensjonal migrasjon, og analyse gjennom direkte visualisering av trekkende celler, vanskeligheter med å skape mikro-pilaren arrays økonomisk vanskelig sin omfattende bruk.
Den optimaliserte scratch analysen beskrevet i denne protokollen gir en effektiv, cost-effektiv fremgangsmåte for å produsere konsistente riper som kan analyseres ved hjelp av fritt tilgjengelig programvare. I stedet for enkle målinger bredde gjort over bunnen før og etter cellevandring, gjør at programvaren brukeren å bestemme de totale skrape områder før og etter migrasjon. Dette avansement begrenser problemet med å prøve å finne ut hvor scratch målinger bredde bør tas, og om bredden på scratch er uniform langs den lengden. I tillegg er imidlertid optimalisering av antall celler, celle konfluens og typen og graden av skade påført cellene behandlet for å optimalisere analysen ytterligere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: For denne studien, lunge mesenchymale stromaceller (LR-MSC) fra distal lungevev ble isolert enten basert på deres uttrykk av celleoverflatemarkører (CD45 neg, CD31 neg, Sca-en høy, EpCAM neg) 14,15, ved hjelp eksplantat out-vekst 16, eller ved hjelp av enzymatisk fordøyelse 17. Adherente LR-MSC ble dyrket i DMEM med høyt glukose og ikke glutamin, 15% FBS, 1x antibiotisk / antimykotisk, og 2 mM glutamin (heretter komplett medium) og inkubert ved 37 ° C, 5% CO2. LR-MSC ble passert 3-4 ganger for å sikre en populasjon av celler som med forholdsvis homogene vekstkarakteristika for migreringen analysen.
1. Klar en Confluent med ett lag
- For å løsne MSCS fra standard 100 mm kulturskåler, vask cellene med 10 ml 37 ° C forvarmet PBS, Aspirer PBS og tilsett 4 ml av trypsin (0,25%). Inkuber 3 til 5 minutter i en 37 ° C inkubator. Aspirer calen inn i et konisk rør, tilsett likt volum av komplett medium og sentrifuger ved 300 g i 5 min for å pelletere ned cellene.
Merk: Lengre inkubasjon i trypsin kan endre celleoverflatereseptorer og potensielt påvirke migrasjon. - Sug media og resuspender cellene i frisk komplett media. Cellene telles, med unntak av døde celler ved bruk av trypan blå eksklusjon, og platen 500000 mesenchymale stromale celler i 4 ml komplett medium på en 60 mm cellekulturskål.
Merk: Avhengig av kilden til cellene, kan testene være nødvendig for å bestemme det optimale antall celler som trengs. - Inkuber celler før platene er 90% konfluent for optimal celleadhesjon og spredning, vanligvis 48-72 timer for MSC.
Merk: 100% samløpet anbefales ikke, siden mange forankringsavhengige celler erfaring kontakt hemming, som kan endre deres vandrende kapasitet. Plater med mindre enn 80% konfluens vil resultere i ubrukelige bilder fordi bildeanalyseprogramvare vil tolke gaps mellom celler som en del av omkretsen av bunnen (se figur 1D). - Etter at cellene har nådd 90% samløpet, skade cellene som passer for søknaden. For å vurdere celleskader etter eksponering for løselig sigarettrøyk ekstrakt (CSE), generere 100% CSE ved å trekke røyken fra en University of Kentucky forskning sigarett (3R4F) gjennom 25 ml komplett media i en Büchner kolben i løpet av 2 min 18.
- Cellene inkuberes i 24 timer i 4 ml 1-4% CSE fortynnet i komplett medium. Etter inkubering vaskes cellene to ganger med 4 ml varm steril PBS, før erstatte med 4 ml friskt komplett medium.
Merk: Skade celler med høye konsentrasjoner av sigarettrøyk ekstrakt (> 5%), kan i vesentlig grad redusere konfluens.
2. Opprette Scratch
- I et sterilt miljø, ta av lokket fra 60 mm plate av skadede MSC, og lå en rett kant (for eksempel en sterilisert plast linjal) across toppen kanten av platen. Uten å fjerne media, bruke en steril 200 mL pipette tips guidet av den sterile rett kant for å gjøre en til fire parallelle riper over hele platen ca 5 mm fra hverandre og 50 mm lange.
Merk: En rett kant minimerer mengden av rotasjons justeringer som trengs til platen når den er på mikroskopet scenen. Det er viktig at riper synes helt loddrett (eller horisontalt) på skjermen. Generering av flere riper på en 60 mm plate ikke endrer mikromiljøet på en måte som påvirker cellemigrering (data ikke vist), men kan tas i betraktning for andre celletyper. Bruk av mindre brønner, anbefales ikke variasjonen av celler som vokser nær kanten av brønnen blir mer uttalt og kan påvirke ensartet dannelse av riper. - Aspirer media og forsiktig vaske platene med 2 ml forvarmet komplett media for å hindre cellene fester seg til midten av bunnen av, og for å fjerne celles som har blitt løsnet av skrape. Erstatt med 4 ml frisk komplett media.
- Ved hjelp av en steril permanent markør, merke hver ripe 1-4 på undersiden av platen på stedet som ikke vil forstyrre bildebehandling riper.
Merk: Det er viktig at bilder fra samme grunnen sammenlignes før og etter overføringen, siden det kan være variasjon i scratch bredde.
3. Ta Innledende Bilder av Scratch
Merk: Hvis scratch analysen er utført på flere plater, er det anbefalt at startbilder av alle riper på en enkelt plate er tatt før riper blir gjort på neste plate.
- Bruke et invertert fasekontrastmikroskop med et kamera for å generere bilder som er nødvendige for analyse.
- Plasser kultur plate på mikroskopet, og bruke lav effekt objektiv (10X) for å finne grunnen # 1. Hvis kondens på lokket av kulturen platen hindrer en klar image av cellene ved å bruke en oppvarmet stadium satt til 37 ° C.
- Holde scratch helt horisontalt, og i midten av synsfeltet, få så mange bilder som er nødvendig for å omfatte 90% av bunnen lengde. Få bilder av forskjellige deler av scratch med ingen overlapping mellom bildene.
Merk: brytning av lys ved kantene av kulturskålen eksponerer bildene, noe som gjør dem umulig å analysere. Derfor bør man ikke ta bilder fra den første og siste 5% av scratch lengde. - Lagre bilder fra hver ripe i en egen mappe.
- Gjenta trinn 3,2-3,4 for riper 2, 3 og 4.
- Returnere platene til inkubatoren umiddelbart etter innledende bildebehandling. La cellene migrerer for 4-7 timer.
Merk: 7 timer er optimalt når man vurderer MSC skadet med CSE. Inkubere cellene i mer enn 7 timer anbefales ikke fordi celleproliferasjon kan fungere som en konfunderende variabel for celle migrasjon (se Valgfritt Note 8.2 nedenfor).
- Last ned ImageJ og installere Wound Healing Tool plugin (se tabell for material / utstyr).
- Åpne bildefilen i ImageJ, klikk deretter "Process" og "Find Edges" for å markere cellene rundt scratch for Wound Healing Tool til å beregne scratch området (figur 2B). Deretter klikker du på "Image", "Juster", "Color Threshold" og i nedtrekksmenyen merket "Threshold Color" endre verdien til "B & W".
- Innenfor "Color Threshold" -menyen, justere både lysstyrke glidere inntil optimal kontrast mellom scratch og celle fronten er oppnådd. For å tillate det største utvalget når du prøver å skape kontrast i bildet, flytte den nederste glidebryteren helt til høyre (helt svart bilde), og deretter justere den øverste glidebryteren for å generere maksimal kontrast.
- Sakte justere toppen brightness glidebryteren fra venstre til høyre til bildet renslig viser konturen av bunnen (Figur 2C). Når kantene på scratch er identifisert, klikk "Flere Verktøy" i ImageJ verktøylinjen, velger du "MRI_Wound_Healing_Tool" fra rullegardinmenyen, og trykk på "m" -knappen (som vises i ImageJ verktøylinjen) for å markere scratch området og utgang den beregnede området i en resultat pop-out window (figur 2D).
- Kopiere og lime inn alle tallene fra resultatvinduet (figur 2E) i et Excel-regneark. Sørg for å skille data fra individuelle riper.
5. Ta Endelige Bilder av Scratch
- Etter at cellene har migrert (4-7 timer), gjenta trinn 3,2-3,4. Bilde platene i samme rekkefølge som de ble klødd slik at celler på hver plate har hatt lik tid til å migrere.
Merk: Cellene kan avbildes på flere tidspunkter, avhengig av deres sensitivitet til både temperatur og pH-endringer. Alternativt kan levende celle bildebehandling brukes til å følge cellene i sanntid når de migrerer.
6. Analysere Endelige Skrape Images
- Gjenta trinn 4,2-4,5 for endelig skrape bilder.
7. Beregning av Scratch-området for å kvantifisere Migration
- Beregne middelverdien pre-migrering området ved gjennomsnitt startverdiene i området av de respektive riper.
- Beregn den totale mengde av migrering ved å subtrahere den endelige trekkområde for hvert bilde, beregnet i trinn 6, fra den gjennomsnittlige pre-migrasjon området (trinn 7.1). Generere en liste med verdier for hver scratch representerer endringen i migrasjon.
- Pool data fra flere riper i den samme testgruppen (dvs. alle plater og alle riper på celler eksponert for 0% CSE). Bruk en variansanalyse test for å analysere forskjellene mellom forsøksgruppene.
- Hvis cellene er treg til å migrereog krever en lengre inkubasjonstid etter riper (større enn 10-12 timer), utføre en BrdU eller Edu innlemmelse assay 19 for å avgjøre om cellene er under enhver spredning i perioden hvor migrasjon analysen skjer. Velge en migrering assay tid for å unngå signifikant celleproliferasjon.
8. Valgfritt
- For å vurdere om betydelig celle senescens er oppstått som et resultat av skrape prosedyren, utføre en begynnende alderdom-assosiert Beta-galaktosidase-analyse på en testplate ved forhåndsbestemte tidspunkter etter riper 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De skrape analysene som presenteres her ble utført ved hjelp av muselunge bosatt mesenchymale stromaceller (LR-MSC) og isolert som referert i protokollen notater. LR-MSC ble sådd ut ved en tetthet på 500.000 celler i en 60 mm vevskulturskål og dyrket til 90% konfluens i 48 timer. For å generere skade, ble 4% CSE (beskrevet ovenfor) inkubert med cellene i 24 timer etter den initielle perioden seeding men før bunnen analysen. For hver analyse ble scratch generert ved hjelp av en 200 ul pipettespiss. Innledende bildene ble tatt etter at bunnen var blitt generert, og eventuelle løse celler og rusk hadde blitt vasket bort med komplett media. Som vist i figur 1A og B, er hensiktsmessig sammenløpet viktig for å sikre at bildebehandlingsprogrammet kan korrekt identifisere grensene av grunnen. Som vist på figur 1C, celler ikke er tilstrekkelig sammenflytende (enten på grunn av utilstrekkelig pode tettheter, utilstrekkelig incubation ganger, eller overdreven skade), som kan føre til riper med heterogene grenser som ikke er lett preget av bildebehandlingsprogrammer (figur 1D). Figur 2 viser bilde oppkjøpet og analyse. Figur 2A viser originalbildet før analyse. Figur 2B viser resultatet av "Finn kanter" -verktøyet under "Process" meny (trinn 4,2) og figur 2C viser bildet etter justering av "Color terskel" skyvebjelken (trinn 4.3). Figur 2D viser den endelige analyserte bilde etter å ha kjørt MRI_Wound_Healing_Tool plugin (trinn 4.4). Figur 2E viser resultatene pop-out-vinduet, fremhever (rød boks) tallene som genereres. Representative pre- og post-migrasjon bilder er vist i figur 3, med tilsvarende ripegrenser som er definert av bildebehandling. Figur 4 graphically illustrerer endret vandringskapasitet sett i LR-MSC etter skade med 4% CSE. 4A og B, gjennomsnittlig beregnet skrape områder (i piksler) for hver av 4 riper gjort over en plate av LR-MSC på 95% samløpet enten før eller etter migrasjon, med eksponering mot enten 0% CSE eller 4% CSE er sammenlignet. Figur 4C sammen den beregnede gjennomsnittlige endringen i bunnen av området (post-migrering området trekkes fra pre-migrering område) i LR-MSC utsatt for enten 0% eller 4% CSE, viser mindre migrasjon (lavere gjennomsnittlig endring i bunnen av området ) etter eksponering til 4% CSE.
Figur 1: Riktig konfluens er kritisk for dannelsen av den robuste reproduserbar scratch assay. (A) Murint LR-MSC på 95% samløpet, passende for scratching. (B) En vellykket scratch på 95% samløpet. (C) LR-MSC ved 70% samløpet, for lavt for en vellykket scratch. (D) Bilde oppkjøp på 70% samløpet kan produsere falske grenser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative bilder som viser bilde oppkjøpet og analyse (A) Originalbilde.. (B) Bilde etter påføring av "Find Edges" -verktøyet under "Process" -menyen (trinn 4.2). (C) Bilde følgende justering av "Color Threshold" skyvebryteren (trinn 4.3). (D) Bilde etter å ha kjørt MRI_Wound_Healing_Tool plugin (trinn 4.4). (E) RESULTATER pop-up vindu utheving (rød boks) tallene som genereres for hvert område. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representative bilder fra bunnen av analysen sammenligne ripete LR-MSC før og etter migrasjon (A) Representant opprinnelige bildet forhånds migrasjon.. (B) Outline av beregnet scratch området pre-migrasjon. (C) Representant opprinnelige bildet post-migrasjon. (D) Outline av beregnet scratch området etter migrasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
<img alt = "Figur 4" src = "/ filer / ftp_upload / 53414 / 53414fig4.jpg" />
Figur 4: Representative resultater fra bunnen analyse som sammenligner kvantifisering av skrape området før og etter LR MSC-migrasjon, og eksponering for enten 0% eller 4% CSE. (A) grafisk fremstilling av gjennomsnittlig beregnet skrapeområde (in pixels) for hver av 4 riper er gjort på tvers av en plate av LR-MSC ved 95% konfluens enten pre- eller post-migrasjon, med eksponering til 0% CSE, med data som er presentert gjennomsnitt og standardavvik. (B) Grafisk fremstilling av gjennomsnittet beregnet skrapeområde (in pixels) for hver av 4 riper er gjort på tvers av en plate av LR-MSC ved 95% konfluens enten pre- eller post-migrasjon, med eksponering til 4% CSE, med data som er presentert gjennomsnitt og standardavvik. (C) Sammenligning av beregnet gjennomsnittlig endring i scratch-området (post-pre migrasjon) i LR-MSC utsatt for enten 0% eller 4% CSE, viser mindre migrasjon (lavere gjennomsnittlig endring i scratch område) etter eksponering for 4% CSE, med data presentert som gjennomsnitt og standardavvik, * P = 2,99 x 10 -8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen er beskrevet her gir et kvantitativt robust, standardisert metode for å utføre og analysere skrape analyser. Enkle skrape analyser blir rutinemessig brukt i mange ulike studieretninger for å undersøke cellemigrasjon. Men tradisjonelt scratch analysen har manglet et standardisert oppsett og kvantifisering protokollen, noe som har ført til problemer med reproduserbarhet 7,10. Mange av de endringer og optimaliseringer for å forbedre scratch analysen har redusert disse problemene, inkludert enkelte levende celle bildebehandling, standardiserte stopper baserte analyser, og tredimensjonale mikro-pillar analyser 4,8,10. Imidlertid kan disse analysene være vanskelig å tilpasse eller tilpasse 10, og for noen anvendelser, kan disse teknikkene også være kostnads prohibitive.
For å produsere en standardisert ripe analyseprotokollen, er det flere viktige trinn i protokoll som er presentert her som krever spesifikk informasjon om celler INVOLVed, og optimalisering av analysen basert på de aktuelle cellulære egenskaper. Spesielt er det viktig å optimalisere antall celler som trengs og den tid i kultur er nødvendig for å oppnå et ensartet monolag på 90 til 100% konfluens i analysen (trinn 1.3 og trinn 1.4). Med for få celler (mindre enn 90% sammenflytende), vil cellene ikke danner en tilstrekkelig monolag. Ikke bare vil dette påvirke cellulære mikromiljøet, men det vil også påvirke evnen til bildebehandlingsprogrammer å korrekt identifisere kantene på scratch. I motsetning til dette kan for mange celler i monolag (100% konfluente, eller stablede celler) også resultere i kontakt hemming, og dermed endrer trekk egenskapene til cellene. Noen varianter av scratch analyseprotokollen anbefaler cellevekst til 100% samløpet og ikke anser dette potensialet begrensning for visse kontakt-sensitive celler som MSC 8. Det samme gjelder skal brukes til graden av skade som er inflicted på cellene (trinn 1.5). Protokollen er beskrevet her, er utformet for å vurdere endringer i cellemigrasjon etter skade etter eksponering for løselig sigarettrøyk på trekkkapasitets MSC, men denne analysen kan være like nyttig for å vurdere effekten av mange forskjellige typer av skader på cellemigrering. Det er viktig at den rammede skaden er tilstrekkelig til å gi en statistisk forskjell mellom de eksperimentelle og kontrollgrupper. Imidlertid kan for mye skade også resultere i redusert celle konfluens, noe som igjen kan påvirke evnen til bildebehandlingsprogrammet på riktig måte for å identifisere kantene av bunnen av.
Både celle alderdom og cellulær proliferasjon kan være forstyrrende faktorer som feilaktig kan endre resultatene av bunnen analysen. Særlig bør generering av scratch vurderes nøye for å unngå unødig skade omkringliggende cellene som kan føre til alderdom. Skrape med en plast pipettespissen snarere enn en hypodermic nål eller skalpell unngår overskudd skader og samtidig bevare integriteten av kulturen plateoverflaten i migrasjon sonen og den ekstracellulære matriks-(trinn 2.1). I tillegg må den lengde av tid over hvilken celle migrering tillates å foregå vurderes nøye for å unngå signifikant celleproliferasjon som en forvirrende variabel (trinn 3.7). For analyse av LR-MSC migrasjon, er 7 timer optimal ved vurderingen av celler skadet med CSE. Inkubere cellene i mer enn 12 timer er vanligvis ikke anbefalt, men dette ikke gjelder for alle celletyper, spesielt de med svært lave dobling priser. For å vurdere både cellulære alderdom og celleproliferasjon, en blanding av senescens-assosiert beta-galaktosidase og BrdU eller edu inkorporering kan utføres på cellene ved enden av analysen 19. Viktigere, protokollen beskrevet her er tilgjengelig for laboratorier med begrenset teknisk kapasitet, som krever bare en god kvalitet invertert fase kontrast mikroskop og kamera. Dereagenser er billig, og bildebehandlingsprogrammer er åpen kildekode. Imidlertid, for å sikre optimale resultater fra denne undersøkelse, inkludert god reproduserbarhet og evne til å utføre nøyaktig statistisk analyse, forsiktig optimalisering bør vurderes for hver ny celletype eller eksperimentell skade scenario som er forsøkt.
Optimaliseringer som presenteres i denne protokollen adressen noen av de begrensningene som finnes i tidligere arbeid gjort for å standardisere skrape analyser. Mens skrapeanalyseprotokoller tradisjonelt ta bredde målinger skrape fra et øyeblikksbilde av scratch 8,9, protokollen som presenteres her bruker området målinger fra bilder tatt langs hele lengden av scratch å øke statistisk rigor og å ta hensyn til uoverensstemmelser i bredden den første scratch. Basert på gjentatt testing (data ikke vist), scratch bredde kan ikke antas å være helt konsekvent i hele sin lengde. Etter overføringen kantene av the scratch blitt mer heterogen, noe som gjør det stadig vanskeligere å nøyaktig beregne en ripe bredde, og videre nødvendig beregninger området. Denne protokollen bruker MRI_Wound_Healing_Tool, et spesialisert dataprogram, for å redusere subjektivitet og øke konsistens når analysere scratch området. Mens det er ukjent om beregninger enkle bredde kunne gi resultater spesifikke nok til å skille mellom små forskjeller i migrasjon grunn før CSE eller annen skadelig, demonstrerer denne protokollen denne følsomheten. Optimaliseringer som presenteres i denne protokollen revolusjonere felles scratch analyse for å løse disse begrensningene i en økonomisk mulig måte, for å tilby muligheter for tilpasning, og for å gi flere teknikker for å demonstrere følsomhet og validere resultater.
Den optimaliserte kvantitative bunnen analysen beskrevet i denne protokollen er fortsatt begrenset ved å betrakte en cellepopulasjon, snarere enn individuelle celler. Denne teknikken Assumes at cellen befolkningen er relativt homogen, og at dette vil føre til relativt homogene migrasjons egenskaper. Avhengig av programmet, kan det være mer aktuelt å vurdere flytting av individuelle celler i stedet 8. Videre er grunnen analyseprotokollen er beskrevet her er avhengig av en populasjon av celler som ikke sprer seg raskt nok til å forvirre analysen av migrasjon i løpet av en 4-7 timers periode. Cellelinjer som kan formere seg i stor utstrekning i løpet av denne korte tidsperioden ville ikke være egnet for analyse ved hjelp av denne teknikken. Til tross for disse begrensningene, har denne kvantitative scratch analyseprotokollen potensialet for bruk i mange forskjellige applikasjoner. For eksempel kan en celleskade basert assay optimaliseres, og deretter brukt til å vurdere evnen til spesielle behandlinger for å begrense celleskade. Alternativt kan denne analysen brukes med kreftcellelinjer for å vurdere potensielle behandlinger for å begrense vandrende kapasitet, og derfor metastatisk potensial, of disse cellene. Denne optimaliserte scratch analysen er også fortsatt begrenset av mulige forstyrrelser i cellemikromiljøet som er uunngåelig i å generere scratch. Men ved omhyggelig å velge celle samløpet nivå, økt apoptose og generering av ark av celler som har delvis separert på kanten av bunnen unngås.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200 mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200 μl pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healing plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
- Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay. J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).
- Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).
- Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices. Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).
- Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates. Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).
- Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).
- Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism. Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).
- Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts. J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).
- Chung, C. A., Chen, C. Y. The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber. J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).
- Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules. Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).
- Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).
- Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy. Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).
- McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).
- Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung. Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).
- Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One. 9 (12), e115963 (2014).
- Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD. Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).
