Introduction
Celmigratie is sterk gecoördineerde en essentieel voor vele fysiologische processen zoals weefselontwikkeling, herstel en regeneratie, alsook pathologische processen zoals kanker metastase en arteriosclerose 1. Inzicht in celmigratie is bijzonder relevant voor nieuwe therapieën gebruikt om beschadigde weefsels te herstellen en te behandelen pathologische aandoeningen, waaronder celtransplantatie technologieën en kunstmatige weefsel enten 2. Gezien de huidige interesse in de rol van mesenchymale stromale cellen (MSC's) bij het mediëren van weefselherstel 3, kwantificeren het trekkende vermogen van deze cellen met behulp van een test die is rigoureus kwantificeerbaar, flexibele en kosteneffectieve van belang. Belangrijk is dat dergelijke test voldoende gevoelig relatief subtiele veranderingen in de cellulaire trekkende capaciteit sporen na schade. De huidige methoden voor het kwantificeren van cel migratie, waaronder scratch assays, trans-en migratie assays (Boyden chAmbers), micropillar arrays, en mobiele uitsluiting zone assays beschikken over een reeks van beperkingen in de reproduceerbaarheid, aanpasbaarheid, kwantificering en kosten-effectiviteit 1,4,5. De geoptimaliseerde scratch test hier beschreven toont robuuste resultaten, meetbare en image-based analysemogelijkheden, kosteneffectiviteit en aanpassingsvermogen aan andere toepassingen.
Scratch assays werden gebruikt in verschillende capaciteiten voor celmigratie en proliferatie onder verschillende experimentele condities 5 evalueren. De bepaling houdt in het enten van de aangewezen cellen groeien ze of nabij confluentie voltooien en krassen op de resulterende monolaag met een steriele naald of een pipet tip 6. Analyse wordt meestal uitgevoerd door vergelijking van de breedte van de kras over meerdere tijdstippen op willekeurig gekozen plaatsen 7-9. Ondanks zijn prominente gebruik wordt de scratch test verstoord door problemen met reproduceerbaarheid en kwantificering. Variabiliteit ingenereren van de kras niet alleen verandert de micro-omgeving van de cellen, maar ook celmigratie belemmeren door beschadiging van het plaatoppervlak en de onderliggende extracellulaire matrix 5. Assays worden vaak uitgevoerd in 7-12 uur, maar voor cellijnen weergeven langzamere migratie en langere testtijden, proliferatie wordt een verstorende variabele 7,10. Ten slotte kan verouderde cellen gegenereerd door het krassen procesfactoren die interfereren met de extracellulaire signalering nodig is om het verschil in de monolaag 1 vrijgeven. Het optimaliseren van de scratch test vereist creëren van een consistente kloof die niet interfereert met de oppervlakte-eigenschappen, het minimaliseren assay tijdsduur en het voorkomen van ongewenste celdood tijdens de manipulatie. De stop gebaseerde test is een optimalisatie van een cel verboden zone assay. Deze test maakt gebruik van een stop in het midden van de put die celgroei uitsluit, maar laat de cellen worden geplateerd om de centrale verboden zone.Om migratie te beoordelen, wordt de stop verwijderd, en de daaruit voortvloeiende uitsluiting zone biedt een oppervlak voor de migratie te voorkomen. Echter, deze test moeilijk te passen of aan te passen 10 en voor sommige toepassingen, kan deze techniek ook hoge kosten.
In tegenstelling tot nul assays en derivaten daarvan, trans-well migratie assays (of Boyden kamer assays) beoordelen migratie door het kwantificeren van het aantal cellen die van de ene kamer door een microporeus filter membraan, in een kamer die chemotactische 8,11, 12. Deze techniek heeft nut beperkt hechtende cellen zoals MSCs omdat na migratie door het poreuze membraan, de cellen hechten aan de membraanzijde blootgesteld aan de chemotactische middelen en kan moeilijk nauwkeurig te kwantificeren. Terwijl de test is in staat om een driedimensionale migratiepatronen onderzoeken de beperkte cel typen waarvoor zij kan celmigratie grens zijn nut nauwkeurig kwantificeren 10. Een ander alternatief nul assays maakt gebruik van een micro-pijlers array, die cellulaire motiliteit gemeten door een driedimensionale ruimte met behulp van het vermogen van cellen te vervormen en migreren in de array als een surrogaat. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastomeren genezen over een precieze vorm en behandeld met ozon en fibronectine produceert een homogene en niet-afbreekbare micro-omgeving. Afstand micro-pijlers kan ook worden gevarieerd als nodig is om het vermogen van cellen om de matrix 4 voer te meten. De mal wordt gecreëerd door diepe reactief ion etsen van siliciumschijven een negatieve versie van de high-aspect-ratio-array 13 te creëren. Terwijl de test wordt versterkt door de aanpasbaarheid, vermogen modelleren driedimensionale migratie en analyse door directe visualisatie van migrerende cellen, moeilijk maken micro-pijlers arrays economisch belemmert het wijdverbreide gebruik.
De geoptimaliseerde scratch test beschreven in dit protocol zorgt voor een efficiënte, cost-effectieve methode voor het produceren van consistente krassen die kunnen worden geanalyseerd met vrij beschikbare software. In plaats van eenvoudige breedte metingen over de scratch voor en na celmigratie, de software stelt de gebruiker in staat om totale scratch gebieden te bepalen vóór en na de migratie. Deze vooruitgang beperkt de kwestie van het proberen om te bepalen waar de kras de breedte metingen moeten worden genomen, en of de breedte van de kras is uniform langs zijn totale lengte. Bovendien is een zorgvuldige optimalisatie van celaantallen, celconfluentie en het type en de mate van schade toegebracht aan de cellen behandeld om verdere optimalisatie van de assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Voor deze studie, long mesenchymale stromacellen (LR-MSC's) vanaf het distale longweefsel werden geïsoleerd hetzij op basis van hun expressie van celoppervlak merkers (CD45 negatieve, CD31 neg, Sca-1 hoog EpCAM neg) 14,15 behulp explant out-groei van 16, of met behulp van enzymatische vertering 17. Hechtende LR-MSC's werden gekweekt in DMEM met hoge glucose en geen glutamine, 15% FBS, 1 x antibioticum / antimycoticum en 2 mM glutamine (voortaan compleet medium) en geïncubeerd bij 37 ° C, 5% CO2. LR-MSCs werden 3-4 keer gepasseerd om een populatie van cellen te verzekeren relatief homogene groei kenmerken van de migratie assay.
1. Het voorbereiden van een Confluent Monolayer
- Om MSCs van standaard 100 mm kweekschalen los, wassen cellen met 10 ml 37 ° C voorverwarmde PBS, zuig het PBS en voeg 4 ml trypsine (0,25%). Incubeer 3-5 min in een 37 ° C incubator. Zuig de cells in een conische buis, voeg gelijk volume compleet medium en centrifugeer bij 300 g gedurende 5 min om pellet de cellen af.
Opmerking: Langere incubatie in trypsine kan het celoppervlak receptoren veranderen en mogelijk invloed migratie. - Zuig media en resuspendeer cellen in verse volledige media. Tellen cellen, met uitzondering van dode cellen met behulp van trypan blauw exclusie en plaat 500.000 mesenchymale stromale cellen in 4 ml van volledig medium op een 60 mm celkweek schaal.
Opmerking: Afhankelijk van de bron van de cellen, kunnen tests noodzakelijk zijn om het optimale aantal cellen nodig te bepalen. - Incubeer de cellen tot platen 90% confluent optimale celhechting en proliferatie, gewoonlijk 48-72 uur voor MSCs.
Opmerking: 100% samenvloeiing is niet aan te raden, omdat veel verankering-afhankelijke cellen ervaring contact inhibitie, die hun trekkende capaciteit kunnen veranderen. Platen met minder dan 80% confluentie leiden tot onbruikbare's omdat de beeldanalyse software gap interpreterens tussen cellen als deel van de omtrek van de kras (zie figuur 1D). - Nadat de cellen 90% samenvloeiing hebben bereikt, schade aan de cellen afhankelijk van de toepassing. Tot cel schade na blootstelling aan oplosbare sigarettenrook extract (CSE) te beoordelen, het genereren van 100% CSE door het tekenen van de rook van 1 Universiteit van Kentucky onderzoek sigaret (3R4F) tot en met 25 ml van complete media in een Büchner kolf meer dan 2 min 18.
- Incubeer de cellen gedurende 24 uur in 4 ml 1-4% CSE verdund in volledige media. Na incubatie was de cellen tweemaal met 4 ml warme steriele PBS alvorens te vervangen door 4 ml vers compleet medium.
Opmerking: Beschadiging cellen met hoge concentraties van sigarettenrook extract (> 5%) kunnen aanzienlijk verminderen samenvloeiing.
2. Het creëren van de Scratch
- In een steriele omgeving, verwijder dan het deksel van de 60 mm plaat van beschadigde MSC's, en leggen een rechte rand (bijvoorbeeld een gesteriliseerde kunststof liniaal) across de bovenrand van de plaat. Zonder het verwijderen van de media, een steriele 200 ul pipet tip geleid door de steriele straight-edge om 03:59 parallelle krassen over de plaat van ongeveer 5 mm van elkaar en 50 mm lang.
Opmerking: Een rechte rand minimaliseert de hoeveelheid rotatie-aanpassingen die nodig zijn om de plaat wanneer het op de microscoop podium. Het is noodzakelijk dat de krassen verschijnen volledig verticale (of horizontale) op het scherm. Het genereren van meerdere krassen op een 60 mm plaat neemt niet weg micro zodanig dat celmigratie (data niet getoond) treft, maar kan ook voor andere celtypen. Het gebruik van kleinere putjes wordt niet aanbevolen aangezien de variabiliteit van groeiende cellen nabij de rand van de put wordt meer uitgesproken en kunnen uniform generatie krassen beïnvloeden. - Zuig het medium en voorzichtig wassen van de platen met 2 ml voorverwarmde compleet medium aan cellen voorkomen hechten aan het midden van de kras en naar cel verwijderens die zijn losgemaakt door het krassen. Vervangen door 4 ml vers compleet medium.
- Met behulp van een steriele permanent marker, labelen elke kras 1-4 aan de onderzijde van de plaat op de locatie die niet zal bemoeien met de beeldvorming van de krassen.
Opmerking: Het is belangrijk dat beelden van dezelfde nul vergeleken vóór en na de migratie, omdat er variatie scratch breedte kan worden.
3. Rekening Eerste Beelden van de Scratch
Opmerking: Als de scratch test wordt uitgevoerd op meerdere platen, wordt aanbevolen dat de eerste beelden van de krassen op een enkele plaat worden genomen voordat krassen worden gemaakt op de volgende plaat.
- Gebruik een omgekeerde fase contrast microscoop met een camera nodig zijn om de beelden voor analyse te genereren.
- Plaats de cultuur plaat op de microscoop, en gebruik de laag vermogen doelstelling (10X) op peil te lokaliseren # 1. Als condensatie op het deksel van de cultuur plaat een duidelijk imag belemmerte van de cellen, gebruik maken van een verwarmd podium set tot 37 ° C.
- Houd de kras volledig horizontaal en in het midden van het gezichtsveld verkrijgen zoveel als nodig is om beelden omvatten 90% van de lengte van de kras is. Verkrijgen beelden van de verschillende delen van de kras met geen overlap tussen de beelden.
Opmerking: De lichtbreking aan de randen van de kweekschaal overbelicht afbeeldingen, waardoor ze onmogelijk te analyseren. Daarom niet beelden te nemen van de eerste en de laatste 5% van de lengte van de scratch's. - Afbeeldingen vanaf elke kras in een aparte map.
- Herhaal stap 3,2-3,4 voor krassen 2, 3 en 4.
- Terugkeer platen in de incubator onmiddellijk na de eerste imaging. Laat cellen migreren 4-7 uur.
Opmerking: 7 uur is optimaal bij de beoordeling van MSC's beschadigd met CSE. Incuberen van de cellen gedurende meer dan 7 uur wordt niet aanbevolen omdat celproliferatie kan fungeren als een verstorende variabele celmigratie (zie optionele opmerking 8,2 hieronder).
- Download ImageJ en installeer de Wound Healing Tool plugin (zie de tabel van Materialen / Equipment).
- Open het beeldbestand in ImageJ, klik op "Process" en "Find Edges" om de cellen rond de scratch voor de Wound Healing Tool om de scratch gebied (Figuur 2B) te berekenen markeren. Vervolgens klikt u op "Beeld", "aanpassen", "Color Threshold" en in het dropdown menu label "Threshold Kleur" verander de waarde naar "B & W."
- In het menu "Color Threshold", passen zowel helderheid drempel schuifjes tot een optimaal contrast tussen de nul en cel voorzijde wordt bereikt. Met het oog op de grootste bereik wanneer het proberen om het contrast in het beeld te creëren, beweegt de onderste schuif helemaal naar rechts (volledig zwart beeld), en daarna pas de bovenste schuifknop om maximaal contrast te genereren.
- Langzaam aan te passen de top brightness schuifregelaar van links naar rechts totdat het beeld verschijnt netjes de contour van de scratch (figuur 2C). Zodra de randen van de kras zijn geïdentificeerd, klikt u op "More Tools" in de werkbalk ImageJ, selecteer "MRI_Wound_Healing_Tool" uit het dropdown menu, en druk op de "M" knop (die zal verschijnen in de werkbalk ImageJ) om de scratch gebied markeren en de output van de berekende gebied in een resultaten pop-out-venster (Figuur 2D).
- Kopieer en plak alle nummers uit de resultaten (Figuur 2E) in een Excel-spreadsheet. Zorg ervoor dat u de gegevens van individuele krassen scheiden.
5. Met Final Beelden van de Scratch
- Nadat de cellen zijn gemigreerd (4-7 uur) Herhaal stap 3,2-3,4. Afbeelding de platen in de volgorde waarin ze werden bekrast zodat cellen op elke plaat evenveel tijd te migreren hebben gehad.
Opmerking: De cellen kunnen worden afgebeeld op verschillende tijdstippen, afhankelijk van de Sensiteit voor zowel temperatuur als pH-veranderingen. Als alternatief kan live cell imaging gebruikt om de cellen te volgen in real-time als ze migreren.
6. Het analyseren van Final Scratch Afbeeldingen
- Herhaal stap 4,2-4,5 voor de uiteindelijke scratch beelden.
7. Berekening van de Scratch gebied van migratie Kwantificeer
- Bereken het gemiddelde pre-migratie gebied door het middelen van de beginstrook waarden van de respectievelijke krassen.
- Bereken de totale migratie door het aftrekken van de uiteindelijke migratie oppervlak per beeld, berekend in stap 6, de gemiddelde pre-migratie gebied (stap 7,1). Genereer een lijst met waarden voor elke kras die de verandering in de migratie.
- Verzamel de gegevens van meerdere krassen van dezelfde testgroep (alle borden en al krassen cellen blootgesteld aan 0% CSE). Gebruik een variantie analyse test om de verschillen tussen de experimentele groepen te analyseren.
- Als de cellen langzaam migrerenen vereisen een langere incubatietijd na krabben (meer dan 10-12 uur), voeren een BrdU incorporatie assay of EDU 19 om te bepalen of cellen zij enige proliferatie tijdens de periode waarin de assay migratie optreedt. Kies een migratie assay tijd om significante celproliferatie te voorkomen.
8. Optioneel
- Om te beoordelen of significant celsenescentie optreedt als gevolg van het krassen procedure, voert een senescentie-geassocieerde beta-galactosidase test op een proefplaat op vooraf bepaalde tijdstippen na 19 krabben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De scratch assays hier gepresenteerde werden uitgevoerd met muizen long inwoner mesenchymale stromale cellen (LR-MSC) en geïsoleerd zoals genoemd in het protocol toelichting. De LR-MSC's werden geënt bij een dichtheid van 500.000 cellen in een 60 mm weefselkweekplaat en gekweekt tot 90% confluentie in 48 uur. Om schade te genereren, 4% CSE (hierboven beschreven) werd geïncubeerd met de cellen gedurende 24 uur na de initiële zaaien maar vóór de scratch test. Voor elke test werd de scratch gegenereerd met behulp van een 200 ul pipet tip. Initiële beelden werden genomen na de kras was gegenereerd en losse cellen en resten werden weggewassen met volledig medium. Zoals getoond in Figuur 1A en B, geschikte samenvloeiing is belangrijk dat de beeldverwerkingssoftware kunnen de grenzen van de kras kan identificeren. Zoals getoond in figuur 1C, cellen onvoldoende confluent (omdat onvoldoende zaaien dichtheden, inadequate Incubation tijden, of overmatige slijtage), wat kan leiden tot krassen heterogene grenzen die niet gemakkelijk worden onderscheiden door de beeldverwerkingssoftware (figuur 1D). Figuur 2 toont het verwerven en analyseren. Figuur 2A toont de originele afbeelding voordat de analyse. Figuur 2B toont het resultaat van de "Find Edges" tool onder het menu "Actie" (Stap 4.2) en figuur 2C toont het beeld na aanpassing van het "Color Threshold" schuifbalk (Stap 4.3). Figuur 2D toont het uiteindelijke geanalyseerd afbeelding na het uitvoeren van de MRI_Wound_Healing_Tool plugin (Stap 4.4). Figuur 2E toont de resultaten pop-out venster, markeren (rode doos) de nummers die worden gegenereerd. Representatieve pre- en post-migratie beelden worden getoond in Figuur 3, met bijbehorende scratch gebiedsgrenzen zoals gedefinieerd door de beeldverwerkingssoftware. Figuur 4 graphically illustreert de gewijzigde trekkende capaciteit gezien in LR-MSC na schade met 4% CSE. In figuur 4A en B, de gemiddelde berekende scratch gebieden (in pixels) voor elk 4 krassen gemaakt over een plaat van LR-MSC's van 95% confluentie hetzij pre- of post-migratie met blootstelling aan 0% CSE of 4% CSE worden vergeleken. Figuur 4C vergelijkt de berekende gemiddelde verandering in de scratch gebied (post-migratie gebied afgetrokken van pre-migratie gebied) in LR-MSC's blootgesteld aan 0% of 4% CSE, waaruit blijkt minder migratie (lagere gemiddelde verandering in de scratch gebied ) na blootstelling aan 4% CSE.
Figuur 1: Correcte samenloop is cruciaal voor het genereren van de robuuste reproduceerbare scratch test. (A) Muizen LR-MSC's op 95% samenvloeiing, geschikt voor scratching. (B) Een succesvolle kras op 95% samenvloeiing. (C) LR-MSC's op 70% samenvloeiing, te laag voor een succesvolle scratch. (D) Afbeelding overname op 70% samenvloeiing kan valse grenzen produceren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve beelden tonen het verwerven en analyseren (A) Origineel beeld.. (B) Afbeelding na toepassing van de "Find Edges" tool onder het menu "Actie" (Stap 4.2). (C) Afbeelding na aanpassing van de "Color Threshold" schuifbalk (Stap 4.3). (D) Afbeelding na het uitvoeren van de MRI_Wound_Healing_Tool plugin (Stap 4.4). (E) Resultaten pop-up venster highlighting (rode doos) de nummers die worden gegenereerd voor elk gebied. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve beelden van kras test vergelijken gekrast LR-MSC's voor en na de migratie (A) Vertegenwoordiger oorspronkelijke beeld pre-migratie.. (B) een overzicht van de berekende scratch gebied pre-migratie. (C) Vertegenwoordiger oorspronkelijke beeld post-migratie. (D) Overzicht van berekende scratch gebied na de migratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
<img alt = "Figuur 4" src = "/ files / ftp_upload / 53.414 / 53414fig4.jpg" />
Figuur 4: Representatieve resultaten van kras test vergelijken kwantificering van scratch gebied voor en na LR-MSC migratie, en blootstelling aan 0% of 4% CSE. (A) Grafische weergave van de gemiddelde berekende kladgebied (in pixels) voor elk 4 krassen gemaakt over een plaat van LR-MSC's van 95% confluentie hetzij vóór of na de migratie bij blootstelling aan 0% CSE, met data gepresenteerd als gemiddelde en standaarddeviatie. (B) Grafische weergave van de gemiddelde berekende scratch gebied (in pixels) voor elk van de 4 krassen gemaakt over een plaat van LR-MSC's op 95% samenvloeiing hetzij vóór of na de migratie, met de blootstelling aan 4% CSE, met data gepresenteerd als gemiddelde en standaarddeviatie. (C) Vergelijking van de berekende gemiddelde verandering in de scratch gebied (post-pre migratie) in LR-MSC's blootgesteld aan 0% of 4% CSE, waaruit blijkt minder migratie (lagere gemiddelde verandering in scratch gebied) na blootstelling aan 4% CSE, met gegevens gepresenteerd als gemiddelde en de standaarddeviatie, * p = 2,99 x 10 -8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven protocol voorziet in een kwantitatief robuuste, gestandaardiseerde methode om te presteren en scratch testen analyseren. Eenvoudige scratch testen worden routinematig gebruikt in veel verschillende gebieden van onderzoek om cellulaire migratie te onderzoeken. Echter, van oudsher de kras test is een gestandaardiseerde set-up en kwantificering protocol, wat heeft geleid tot problemen met reproduceerbaarheid 7,10 ontbrak. Veel van de wijzigingen en optimalisaties voor de verbetering van de scratch test hebben deze problemen, met inbegrip van individuele live cell imaging, gestandaardiseerde-stop gebaseerde testen, en driedimensionale micro-pijler assays 4,8,10 verminderd. Toch kunnen deze assays moeilijk te passen of aan te passen 10 en voor sommige toepassingen, deze technieken kunnen ook hoge kosten.
Een gestandaardiseerd kras testprotocol produceren, zijn er verschillende kritische stappen in het protocol hier gepresenteerde dat specifieke informatie over de cellen INVOL vereisenved, en optimalisatie van de analyse op basis van de relevante cellulaire kenmerken. In het bijzonder is het belangrijk om het aantal cellen dat nodig is en de tijd in kweek nodig optimaliseren om zo een uniform monolaag bereikt bij 90-100% confluentie voor de test (stap 1,3 en stap 1,4). Met te weinig cellen (minder dan 90% confluent), zullen de cellen vormen geen voldoende monolaag. Niet alleen zal dit voor de cellulaire micro-omgeving, maar ook van invloed op het vermogen van het grafische software om de randen van de kras correct te identificeren. Daarentegen kan te veel cellen in de monolaag (100% confluent, of gestapelde cellen) ook resulteren in contactinhibitie, en daarom verandert de migrerende kenmerken van de cellen. Sommige varianten van de kras assayprotocol raden celgroei tot 100% samenvloeiing en houden geen rekening met deze mogelijke beperking voor bepaalde contact-gevoelige cellen zoals MSC 8. Dezelfde problemen worden gebruikt om de mate van schade die inflicted op de cellen (stap 1,5). De hier beschreven protocol is ontworpen om veranderingen in celmigratie beoordelen na beschadiging door blootstelling aan oplosbare sigarettenrook de trekkende capaciteit MSCs, maar deze test kan eveneens nuttig om het effect van verschillende soorten schade aan celmigratie zijn. Het is belangrijk dat de getroffen schade voldoende is om een statistisch herkenbaar te maken tussen de experimentele en controlegroepen. Echter kan te veel schade ook resulteren in verminderde celconfluentie, hetgeen waarschijnlijk het vermogen van het grafische software om de randen van de kras correct identificeren beïnvloeden.
Zowel cellulaire senescentie en celproliferatie kunnen verstorende factoren die ten onrechte de resultaten van de scratch test kan veranderen. In het bijzonder moet de vorming van de kras zorgvuldig worden overwogen om overmatige schade aan omringende cellen die kunnen leiden tot senescentie voorkomen. Krabben met een plastic pipet tip in plaats van een hypodermic naald of scalpel voorkomt overmatige schade terwijl ook de integriteit van de kweekplaat oppervlak in de zone migratie en extracellulaire matrix (stap 2,1). Bovendien moet de tijdsduur waarover celmigratie mogen plaatsvinden zorgvuldig worden beschouwd als significant celproliferatie vermeden dat verstorende variabele (stap 3,7). Voor de analyse van LR-MSC migratie, 7 uur is optimaal bij het beoordelen van de cellen beschadigd met CSE. Incubatie van cellen voor meer dan 12 uur is in het algemeen niet aan te raden, maar dit geldt niet voor alle soorten cellen, met name die met een zeer lage verdubbeling tarieven. Om zowel cellulaire senescentie en celproliferatie, een combinatie van senescentie-geassocieerde beta-galactosidase en BrdU incorporatie of EDE kan worden uitgevoerd op de cellen aan het eind van de test 19 beoordelen. Belangrijk is dat de hier beschreven protocol is toegankelijk voor laboratoria met een beperkte technische capaciteit, die alleen een goede kwaliteit omgekeerde fase contrast microscoop en camera. Dereagentia zijn goedkoop, en de imaging software is open source. Echter, om optimale resultaten van deze assay, waaronder goede reproduceerbaarheid en het vermogen om strikt statistische analyse kan uitvoeren, zorgvuldige optimalisatie moet worden overwogen voor elk nieuw celtype of experimentele beschadiging scenario dat wordt geprobeerd.
Optimalisaties die in dit protocol adres een aantal van de huidige in eerdere werk te krabben assays standaardiseren beperkingen. Terwijl scratch test protocollen van oudsher nemen kras breedte metingen van een momentopname van de kras 8,9, het protocol hier gepresenteerde maakt gebied metingen van beelden die over de gehele lengte van de kras statistische strengheid te verhogen en om rekening te houden inconsistenties in de breedte van de eerste scratch. Op basis van herhaalde testen (gegevens niet getoond), scratch breedte kan niet worden aangenomen volkomen verenigbaar zijn gehele lengte te zijn. Na de migratie, de randen van the kras worden meer heterogeen, waardoor het steeds moeilijker om nauwkeurig te berekenen een kras breedte, en verder noodzakelijk gebied berekeningen. Dit protocol maakt gebruik MRI_Wound_Healing_Tool een gespecialiseerde computerprogramma, om subjectiviteit te verlagen en de consequente analyse krasoppervlak. Hoewel het niet bekend of eenvoudig breedte berekeningen resultaten specifiek genoeg te onderscheiden subtiele verschillen in migratie doordat vooraf CSE of andere schadelijke kan opleveren, dit protocol toont deze gevoeligheid. Optimalisaties die in dit protocol te vernieuwen de gemeenschappelijke scratch test om deze beperkingen aan te pakken op een economisch haalbare manier, om opties op maat te bieden en extra technieken om de gevoeligheid aan te tonen en de resultaten te valideren.
De geoptimaliseerde kwantitatieve scratch assay beschreven in dit protocol is nog steeds beperkt door te overwegen een cel populatie, in plaats van individuele cellen. Deze techniek Assumes dat de celpopulatie relatief homogeen, en dit zal resulteren in relatief homogene migratie karakteristieken. Afhankelijk van de toepassing, kan het meer relevant zijn voor de migratie van individuele cellen in plaats daarvan 8 overwegen. Bovendien is de kras testprotocol hier beschreven is afhankelijk van een populatie van cellen die niet snel genoeg om de analyse van migratie verwarren gedurende een 4-7 uren periode prolifereren. Cellijnen die uitgebreid kan prolifereren gedurende deze korte periode zouden niet geschikt zijn voor analyse met behulp van deze techniek. Ondanks deze beperkingen dit kwantitatieve scratch testprotocol heeft het potentieel voor gebruik in veel verschillende toepassingen. Bijvoorbeeld, een celbeschadiging gebaseerde bepaling worden geoptimaliseerd en vervolgens gebruikt om het vermogen van specifieke behandelingen voor celbeschadiging beperken beoordelen. Als alternatief kan deze test worden gebruikt kankercellijnen mogelijke behandelingen evalueren trekkende capaciteit, dus metastatisch potentieel beperken, of deze cellen. Deze geoptimaliseerde scratch test wordt ook nog beperkt door mogelijke verstoringen van de cel micro-omgeving die onvermijdelijk in het genereren van de kras zijn. Echter door het zorgvuldig selecteren van celconfluentie niveau verhoogde apoptose en de vorming van vellen van cellen die gedeeltelijk zijn gescheiden op de rand van de kras kan worden vermeden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200 mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200 μl pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healing plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
- Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay. J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).
- Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).
- Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices. Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).
- Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates. Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).
- Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).
- Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism. Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).
- Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts. J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).
- Chung, C. A., Chen, C. Y. The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber. J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).
- Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules. Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).
- Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).
- Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy. Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).
- McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).
- Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung. Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).
- Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One. 9 (12), e115963 (2014).
- Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD. Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).
