Introduction
נדידת תאים היא מתואמת ביותר וחיונית לתהליכים פיסיולוגיים רבים כגון פיתוח רקמות, תיקון, והתחדשות, כמו גם תהליכים פתולוגיים כגון גרורות סרטן וטרשת עורקת 1. הבנה של נדידת תאים רלוונטית במיוחד לטיפולים מתעוררים משמשים לתיקון רקמות פגועות וטיפול במצבים פתולוגיים, כולל טכנולוגיות השתלת תאים ורקמות מלאכותיות השתלת 2. לאור ההתעניינות הנוכחית בתפקיד של תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) בתיווך רקמת תיקון 3, כימות יכולת הנדידה של תאים אלה באמצעות assay שהוא בקפדנות לכימות, להתאמה, והוא עניין חסכוני. חשוב לציין, assay כזה חייב להיות רגיש מספיק כדי לזהות שינויים עדינים יחסית ביכולת נדידה סלולרית לאחר נזק. שיטות קיימים לכימותי נדידת תאים, כולל מבחני מאפס, מבחני הגירת טרנס היטב (CH וידןambers), מערכי micropillar, ומבחני אזור הדרת תא יש מגוון של מגבלות בשחזור, ההתאמה האישית, כימות, ועלות-תועלת 1,4,5. Assay השריטה מותאמת המתואר כאן מדגים תוצאות חזקות, יכולות ניתוח וכימות מבוסס תמונה, עלות-תועלת, והתאמה ליישומים אחרים.
מבחני גירוד שימשו בתפקידים מרובים להעריך נדידת תאים והתרבות בתנאי ניסוי שונה 5. Assay כרוך זריעת התאים הייעודיים, גידולם כדי להשלים או מפגש קרוב, ומגרד את monolayer התוצאה עם מחט סטרילית או קצה pipet 6. ניתוח מבוצע בדרך כלל על ידי השוואת הרוחב של השריטה על נקודות זמן מרובות במקומות שנבחרו באקראי 7-9. למרות השימוש הבולט שלה, assay השריטה הוא מבולבל על ידי בעיות עם שחזור וכימות. השתנות בדור של השריטה לא רק משנה את המיקרו-הסביבה של התאים, אבל גם יכול לעכב נדידת תאים על ידי פגיעה במשטח הצלחת ותאית-מטריצה בסיסית 5. מבחני נערכים בתדירות גבוהה מעל 7 לשעה 12, לעומת זאת לשורות תאים בו מוצגות הגירה ופעמים assay יותר איטיות, ריבוי הופך 7,10 משתנים בלבול. לבסוף, תאים מזדקנים שנוצרו על ידי תהליך הגירוד יכולים לשחרר גורמים שמפריעים לאיתות תאית הדרושה כדי לסגור את הפער בשכבה 1. אופטימיזציה של assay מאפס דורשת יצירת פער עקבי שאינו מפריע למאפייני שטח, מזעור אורך זמן assay, ומניעת מוות של תאים לא רצוי במניפולציה. Assay מבוסס פקק הוא אופטימיזציה של assay אזור הדרת תא. assay זה מנצל פקק ממוקם באמצע גם שאינה כולל צמיחת תאים, אבל מאפשר לתאים להיות מצופים ברחבי אזור ההדרה המרכזי.כדי להעריך הגירה, הפקק מוסר, ואזור הדרת התוצאה מספק משטח להגירה להתרחש. עם זאת, assay זה קשה כדי להתאים אישית או להתאים 10 ועבור יישומים מסוימים, טכניקה זו יכולה גם להיות עלות מונעת.
בניגוד למבחנים מאפס ונגזרותיהם, מבחני הגירת טרנס היטב (או מבחני קאמריים בוידן) להעריך הגירה על ידי כימות את מספר התאים שעוברים מתא אחד, דרך קרום מסנן microporous, לתא המכיל סוכני chemotactic 8,11, 12. טכניקה זו מוגבלת שירות עבור תאים חסיד כמו MSCs כי בעקבות הגירה דרך הקרום הנקבובי, תאים לדבוק בצד הקרום נחשף לסוכני chemotactic, ויכולים להיות קשה לכמת במדויק. בעוד assay הוא מסוגל לבחון כמה דפוסי הגירה תלת-ממדיים, סוגים המוגבלים התא שהוא מסוגל לכמת מגבלת נדידת תאי השירות שלה בצורה מדויקת 10. חלופה נוספת למבחני שריטה משתמשת מערך מיקרו-עמוד, אשר מודד תנועתיות סלולרית דרך מרחב תלת-ממדים באמצעות היכולת של תאים כדי לעוות ולהעביר לתוך המערך כפונדקאי. Polydimethlysiloxane אלסטומרים (PDMS) נרפאו על עובש מדויק וטופלו באוזון ופיברונקטין מייצר מייקרו-סביבה הומוגנית ואינו מתכלה. מרווח מיקרו-עמוד גם יכול להיות מגוון לפי צורך לאמוד את יכולתם של תאים להיכנס למערך 4. העובש נוצר באמצעות תחריט יון תגובה עמוק של פרוסות סיליקון כדי ליצור גרסה שלילית של מערך יחס רוחב-גובה הגבוה 13. בעוד assay מתחזק על ידי ההתאמה האישית שלה, היכולת לבנות מודל תלת ממדי הגירה, וניתוח באמצעות הדמיה ישירה של תאים נודדים, קושי ביצירת מערכי מיקרו-כלכלי עמוד מעכב השימוש הנרחב שלה.
Assay השריטה מותאמת מתואר בפרוטוקול זה מספק יעיל, cosשיטה לא יעילים להפקת סריטות עקביות שניתן לנתח באמצעות תוכנה זמינה באופן חופשי. במקום מדידות רוחב פשוט עשו על פני השריטה לפני ואחרי נדידת תאים, התוכנה מאפשרת למשתמש לקבוע כלל אזורי מאפס לפני ואחרי ההגירה. קידום זה מגביל את סוגיית מנסה לקבוע היכן השריטה צריכה לקחת מדידות הרוחב, ואם הרוחב של השריטה הוא אחיד לכל אורכו של. בנוסף, אופטימיזציה זהירה של מספרים סלולריים, מפגש תא ואת הסוג ומידת הנזק שנגרם לתאים נדונה על מנת לייעל את assay נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: במחקר זה, תאי סטרומה mesenchymal ריאות (LR-MSCs) מרקמת הריאה דיסטלי היו מבודדים או המבוסס על ביטוים של סמנים פני התא (נג CD45, CD31 נג, 1-Sca נג הגבוה, EpCAM) 14,15, באמצעות explant את הצמיחה 16, או באמצעות עיכול אנזימטי 17. חסיד LR-MSCs היה בתרבית בDMEM עם גלוקוז גבוה ולא גלוטמין, FBS 15%, גלוטמין 1x האנטיביוטי / antimycotic, ו -2 מ"מ (להלן תקשורת מלאה) וטופחו על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. LR-MSCs היה passaged 3-4 פעמים על מנת להבטיח אוכלוסייה של תאים בעלי מאפייני צמיחה הומוגני יחסית עבור assay ההגירה.
1. הכנה חד שכבתי ומחוברות
- כדי לנתק MSCs מתרבות מנות 100 מ"מ סטנדרטית, לשטוף תאים עם 10 מיליליטר של 37 מעלות PBS מראש חימם C, לשאוב PBS ולהוסיף 4 מיליליטר של טריפסין (0.25%). דגירה 3-5 דקות בחממה 37 ° C. לשאוב גאמות לתוך צינור חרוטי, להוסיף נפח שווה של תקשורת וצנטריפוגות המלאה ב 300 גרם במשך 5 דקות עד גלולה את התאים.
הערה: דגירה ארוכה יותר בטריפסין יכולה לשנות את הקולטנים בתא שטח ופוטנציאל להשפיע הגירה. - תקשורת לשאוב ותאים גלולים בתקשורת מלאה טרי. ספירת תאים, כולל תאים מתים באמצעות הרחקת trypan כחולה וצלחת תאי סטרומה 500,000 mesenchymal ב 4 מיליליטר של מדיה מלאה על צלחת תרבית תאי 60 מ"מ.
הערה: בהתאם למקור של התאים, בדיקות עשויות להיות נחוצות כדי לקבוע את המספר האופטימלי של תאים דרושים. - דגירה תאים עד צלחות ומחוברות 90% עבור קובץ מצורף תא אופטימלי ושגשוג, בדרך כלל 48-72 שעות לMSCs.
הערה: מפגש 100% אינו מומלץ, שכן עיכוב רב מעגן תלוי קשר ניסיון תאים, אשר עשוי לשנות את יכולת הנדידה שלהם. צלחות עם מפגש פחות מ -80% יגרמו לתמונות שמישים כי תוכנת ניתוח תמונה תפרש פערים בין תאים כחלק מהמערכת של השריטה (ראה איור 1D). - לאחר שהתאים הגיעו 90 מפגש%, לגרום נזק לתאים בהתאם ליישום. כדי להעריך תא נזק לאחר חשיפה לתמצית עשן סיגריות מסיסה (CSE), ליצור 100% CSE על ידי ציור העשן מהסיגריה מחקר 1 אוניברסיטת קנטאקי (3R4F) באמצעות 25 מיליליטר של מדיה מלאה בבקבוק ביכנר מעל 2 דקות 18.
- דגירה התאים עבור 24 שעות בCSE 4 מיליליטר 1-4% בדילול מלא בתקשורת. לאחר דגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם 4 מיליליטר של PBS סטרילי החם, לפני החלפה עם תקשורת מלאה טרי 4 מיליליטר.
הערה: תאי פגיעה בריכוזים גבוהים של תמצית עשן סיגריות (> 5%) יכול להפחית באופן משמעותי מפגש.
2. יצירת Scratch
- בסביבת סטרילית, להסיר את המכסה מצלחת 60 מ"מ של תאי גזע פגומים, ולהניח קצה ישר (לדוגמא שליט פלסטיק מעוקר) ACרוס השפה העליונה של הצלחת. מבלי להסיר את התקשורת, השתמש טיפ pipet סטרילי 200 μl מונחה על ידי סטרילי הקצה ישר לעשות 03:59 סריטות מקבילות פני הצלחת מלבד כ 5 מ"מ ו -50 מ"מ ארוך.
הערה: קצה ישר ממזער את כמות ההתאמות הדרושות כדי סיבוב הצלחת כאשר הוא על הבמה מיקרוסקופ. זה הכרחי כי השריטות מופיעות אנכיות לחלוטין (או אופקית) על המסך. יצירת סריטות מרובות על צלחת 60 מ"מ אינו משנה את המיקרו-הסביבה, באופן שמשפיע על נדידת תאים (מידע לא מוצג), אבל יכול להיות שיקול לסוגי תאים אחרים. השימוש בבארות קטנות יותר אינו מומלצת שכן ההשתנות של תאים גדלה קרוב לקצה של הבאר הופכת בולטת יותר ועלולה להשפיע על דור אחיד של סריטות. - לשאוב התקשורת ולשטוף בעדינות את הצלחות עם 2 מיליליטר של מדיה מלאה מראש חימם כדי למנוע מתאים מהדבקות במרכז של השריטה, וכדי להסיר תאיםים שכבר שחרר את ידי הגירוד. החלף עם 4 מיליליטר של מדיה מלאה טרי.
- באמצעות סמן קבע סטרילי, לתייג כל שריטה מ 1-4 על החלק התחתון של הצלחת במיקום זה לא יפריע הדמיה השריטות.
הערה: חשוב שתמונות מאותו מאפס הן בהשוואה לפני ואחרי ההגירה, שכן יש יכולה להיות וריאציה ברוחב מאפס.
3. לוקחים תמונות ראשוניות של השריטה
הערה: אם assay השריטה מתבצע על צלחות מרובות, מומלצת שהתמונות ראשוניות של כל השריטות על צלחת אחת נלקחות לפני סריטות נעשות על הצלחת הבאה.
- השתמש במיקרוסקופ לעומת שלב הפוך עם מצלמה כדי ליצור את התמונות דרושות לניתוח.
- מקם את צלחת התרבות על המיקרוסקופ, ולהשתמש במטרת צריכת החשמל הנמוכה (10X) כדי לאתר # שריטה 1. אם עיבוי על המכסה של צלחת תרבות פגיעה מתאר לעצמי ברור דואר של התאים, להשתמש תפאורה מחוממת ל -37 מעלות צלזיוס.
- שמירה על השריטה לחלוטין אופקי ובמרכז שדה הראייה, להשיג תמונות רבות כמו צורך להקיף 90% מהאורך של השריטה. להשיג תמונות של חלקים שונים של השריטה ללא חפיפה בין תמונות.
הערה: השבירה של אור בשולי צלחת תרבות overexposes תמונות, מה שהופך אותם בלתי אפשרי לנתח. לכן, לא לוקח תמונות מהראשונה ואחרונים 5% מהאורך של השריטה. - לשמור תמונות מכל שריטה בתיקייה נפרדת.
- חזור על שלבים 3.2-3.4 לסריטות 2, 3, ו -4.
- חזור צלחות לחממה מייד לאחר הדמיה ראשונית. בואו תאים לנדוד ל4-7 שעות.
הערה: 7 שעות היא אופטימליות כאשר הערכת MSCs פגום עם מנוע חיפוש מותאם אישית. דוגרים תאים ליותר מ -7 שעות אינם מומלצים משום שהתפשטות תאים יכולה לפעול כמשתנה מתערב לנדידת תאים (ראו הערה אופציונלית 8.2 להלן).
class = "jove_title"> 4. ניתוח תמונות Scratch ראשוניות
- הורד ImageJ ולהתקין את תוסף ריפוי פצע הכלי (עיין בטבלה של חומרים / ציוד).
- פתח את קובץ התמונה בImageJ, לאחר מכן לחץ על "תהליך" ו- "מצא את הקצוות" כדי להדגיש את התאים המקיפים את השריטה לכלי ריפוי פצע כדי לחשב את השטח מאפס (איור 2). לאחר מכן, לחץ על "תמונה", "להתאים", "סף צבע" ובתפריט הנפתח שכותרתו "צבע סף" לשנות את הערך ל" B & W. "
- בתוך התפריט "סף צבע", להתאים את שני מחווני סף הבהירות עד ניגוד אופטימלי בין חזית השריטה ותא מושגת. כדי לאפשר למגוון הרחב ביותר כאשר מנסה ליצור ניגוד בתמונה, הזז את המחוון התחתון לחלוטין לימין (תמונה שחורה לחלוטין), ולאחר מכן להתאים את המחוון העליון כדי ליצור ניגוד מרבי.
- לאט לאט להתאים את BRI העליוןמחוון ghtness משמאל לימין עד לתמונה נקיה מציגה את קווי המתאר של השריטה (איור 2 ג). ברגע שהקצוות של השריטה זוהו, לחץ על "כלים נוספים" בסרגל כלי ImageJ, בחר "MRI_Wound_Healing_Tool" מהתפריט הנפתח, ולחץ על הכפתור "m" (שיופיע בסרגל כלי ImageJ) כדי להדגיש את אזור השריטה ופלט האזור ממוחשבים בחלון פופ-את תוצאות (איור 2 ד).
- להעתיק ולהדביק את כל המספרים מחלון התוצאות (איור 2E) לגיליון אלקטרוני Excel. הקפד להפריד נתונים משריטות בודדות.
5. לוקחים תמונות סופיות של השריטה
- אחרי התאים היגרו (4-7 שעות), חזור על שלבים 3.2-3.4. תמונת הצלחות באותו סדר שהם גירדו כך שתאים על כל צלחת היו זמן שווה להגר.
הערה: ניתן הדמיה התאים בנקודות זמן מרובות, בהתאם Sensitivity לשני שינויי הטמפרטורה וחומציות. לחלופין, הדמיה תא חי יכולה להשתמש כדי לעקוב אחר התאים בזמן אמת כפי שהם נודדים.
6. ניתוח תמונות Scratch סופיות
- חזור על שלבים 4.2-4.5 לתמונות מאפס סופיות.
7. חישוב שטח Scratch לכמת הגירה
- לחשב את השטח שלפני ההגירה הממוצעת על ידי חישוב ממוצע ערכי שטח הראשוניים של השריטות בהתאמה.
- לחשב את הסכום הכולל של הגירה על ידי הפחתת השטח הסופי הגירה לכל תמונה, מחושב בשלב 6, מהאזור הממוצע טרום ההגירה (שלב 7.1). ליצור רשימה של ערכים עבור כל שריטה המייצגת את השינוי בהגירה.
- בריכת נתונים משריטות מרובות באותה קבוצת הבדיקה (כלומר כל הצלחות וכל השריטות על תאים שנחשפו לCSE 0%). השתמש בניתוח של מבחן שונות לנתח את ההבדלים בין קבוצות ניסוי.
- אם התאים הם איטיים להגרודורש זמן דגירה ארוך יותר לאחר הגירוד (יותר מ 10-12 שעות), לבצע BrdU או assay התאגדות edu 19 כדי לקבוע אם תאים עוברים כל התפשטות בתקופה שבי assay ההגירה מתרחש. בחר זמן assay הגירה כדי למנוע התפשטות תאים משמעותית.
8. אופציונליים
- על מנת להעריך האם הזדקנות תא משמעותית מתרחשת כתוצאה מהליך הגירוד, לבצע assay Beta-galactosidase הקשורים הזדקנות על צלחת בדיקה בזמנים שנקבעו מראש לאחר מגרד 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מבחני השריטה שהוצגו כאן בוצעו באמצעות תאי סטרומה mesenchymal עכברי תושב ריאות (LR-MSCs) ומבודדים שבסימוכין בביאורים הפרוטוקול. LR-MSCs היה זורעים בצפיפות של 500,000 תאים בצלחת תרבית רקמת 60 מ"מ, וגדל למפגש 90% ב- 48 שעות. כדי ליצור נזק, מנוע חיפוש מותאם אישית של 4% (שתואר לעיל) הודגר עם התאים למשך 24 שעות לאחר תקופת הזריעה הראשונית אבל לפני assay מאפס. לכל assay, השריטה נוצרה באמצעות קצה pipet 200 μl. תמונות ראשוניות נלקחו לאחר השריטה שנוצרה, וכל תאים ופסולת רופפים שנשטפו עם תקשורת מלאה. כפי שניתן לראות באיור 1 א 'וב', מפגש מתאים חשוב לוודא שתוכנת ההדמיה בצורה נכונה יכולה לזהות את הגבולות של השריטה. כפי שניתן לראות בתרשים 1C, תאים אינם מספיק מחוברות (או, Inc לבלתי מתאימה בגלל צפיפות זריעה לקויהפעמים ubation, או נזק מוגזם), אשר יכול לגרום לסריטות עם גבולות הטרוגנית שאינם נבדלים בקלות על ידי תוכנת ההדמיה (1D איור). איור 2 מדגים רכישת תמונה וניתוח. איור 2 א מתאר את התמונה המקורית לפני הניתוח. איור 2 מראה התוצאה של כלי "מצא את הקצוות" תחת תפריט "התהליך" (שלב 4.2) ואיור 2C מציג את התמונה הבאה התאמה של סרגל שקופיות "צבע סף" (שלב 4.3). איור 2 ד מתאר את התמונה ניתחה הסופית לאחר הפעלת MRI_Wound_Healing_Tool תוסף (שלב 4.4). איור 2E מתאר את חלון תוצאות פופ-החוצה, הדגשה (תיבה אדומה) מספרים שנוצרים. תמונות מראש נציג ופוסט-הגירה מוצגות באיור 3, עם מקביל גבולות אזור השריטה כהגדרתו בתוכנת ההדמיה. איור 4 Graphically ממחיש את יכולת הנדידה שינתה ראתה בLR-MSCs לאחר נזק עם מנוע חיפוש מותאם אישית של 4%. באיור 4 א 'וב', אזורי השריטה הממוצעת מחושב (בפיקסלים) לכל אחד מ4 סריטות שנעשו על פני צלחת של LR-MSCs ב 95% או מפגש הגירת הודעה מראש או, עם חשיפה לאו CSE 0% או 4% מנוע חיפוש מותאם אישית הוא בהשוואה. איור 4C משווה את השינוי מחושב הממוצע באזור מאפס (אזור לאחר הגירה המופחתת מאזור קדם-הגירה) בLR-MSCs נחשף לאו 0% או 4% CSE, מפגין פחות הגירה (שינוי ממוצע נמוך יותר באזור השריטה ) לאחר החשיפה לCSE 4%.
איור 1: מפגש נכון הוא קריטי עבור הדור של assay מאפס לשחזור חזק. () Murine LR-MSCs ב 95% מפגש, מתאים לSCRatching. שריטה מוצלחת בנקודת מפגש 95% (ב). (ג) LR-MSCs בנקודת מפגש 70%, נמוך מדי לשריטה מוצלחת. רכישת תמונה (ד ') ב 70% מפגש יכולה לייצר גבולות שווא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: תמונות נציג הוכחת רכישת תמונה וניתוח תמונה מקורית ().. (ב) תמונה הבאה יישום של הכלי "מצא את הקצוות" תחת תפריט "התהליך" (שלב 4.2). (C) תמונה הבאה התאמה של סרגל שקופיות "צבע סף" (שלב 4.3). תמונה (ד ') לאחר שהפעיל את תוסף MRI_Wound_Healing_Tool (שלב 4.4). R (E)esults מוקפץ הדגשת חלון (תיבה אדומה) מספרים שנוצרים לכל אחד מתחומים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: נציג תמונות מassay השריטה השוואה גירדו LR-MSCs לפני ואחרי ההגירה (א) תמונה המקורית מראש הגירת נציג.. מתאר (ב) לאזור שריטה מראש הגירה מחושבת. לאחר הגירה-תמונה מקורית נציג (C). מתאר (ד ') באזור השריטה מחושב לאחר הגירה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
<img alt = "איור 4" src = "/ קבצים / ftp_upload / 53,414 / 53414fig4.jpg" />
איור 4: תוצאות נציג מassay השריטה השוואת כימות של אזור מאפס לפני ואחרי הגירת LR-MSC, וחשיפה לאו 0% או 4% CSE. (א) ייצוג גרפי של אזור שריטה המחושב ממוצע (בפיקסלים) לכל אחד מ4 סריטות שנעשו על פני צלחת של LR-MSCs ב 95% או מפגש הגירת הודעה מראש או, עם חשיפה לCSE 0%, עם נתונים שהוצגו כ אומר וסטיית תקן. (ב) ייצוג גרפי של אזור שריטה המחושב ממוצע (בפיקסלים) לכל אחד מ4 סריטות שנעשו על פני צלחת של LR-MSCs ב 95% או מפגש הגירת הודעה מראש או, עם חשיפה לCSE 4%, עם נתונים שהוצגו כ אומר וסטיית תקן. (ג) השוואה של שינוי מחושב ממוצע באזור מאפס (הגירת הודעה מראש) בLR-MSCs נחשפה לאו 0% או 4% CSE, מפגינה פחות הגירה (שינוי ממוצע נמוך יותר בSCRאזור Atch) לאחר החשיפה לCSE 4%, עם נתונים שהוצגו כממוצע וסטיית תקן, * P = 2.99 x 10 -8. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטת כמותית חזקה, תקנית לבצע ולנתח מבחני מאפס. מבחני שריטה פשוטים משמשים באופן שיגרתי בתחומים רבים ושונים של מחקר לבחון הגירה סלולרית. עם זאת, באופן מסורתי assay השריטה חסר פרוטוקול הגדרה וכימות סטנדרטי, מה שהוביל לבעיות בשחזור 7,10. רבים מהשינויים ואופטימיזציות לשיפור assay השריטה צמצמו נושאים אלה, כוללים הדמיה פרט לחיות תאים, מבחני מבוססי פקק סטנדרטיים, ושלושה מבחני מיקרו-ממדיים עמוד 4,8,10. עם זאת, מבחני אלה יכולים להיות קשים כדי להתאים אישית או להתאים 10 ועבור יישומים מסוימים, ניתן גם לעלות מונעת טכניקות אלה.
כדי לייצר פרוטוקול assay השריטה סטנדרטי, ישנם מספר צעדים קריטיים בפרוטוקול המובא כאן הדורשים מידע ספציפי על תאי involved, ואופטימיזציה של assay המבוסס על המאפיינים הסלולריים הרלוונטיים. בפרט, חשוב כדי לייעל את מספר התאים הדרושים והזמן בתרבות הכרחית על מנת להשיג monolayer אחיד בנקודת מפגש% 90-100 עבור assay (שלב 1.3 ושלב 1.4). עם מעט מדי תאים (מחוברות פחות מ -90%), התאים לא יוצרים monolayer מספיק. לא רק זה ישפיע על מייקרו-הסביבה הסלולרית, אבל זה גם ישפיע על היכולת של תוכנת ההדמיה לזהות בצורה נכונה את הקצוות של השריטה. לעומת זאת, יותר מדי תאים בשכבה (מחוברות 100%, או תאים מוערמים) עשויים לגרום לעיכוב מגע, ולכן לשנות את מאפייני הנדידה של התאים. וריאציות חלק מפרוטוקול assay השריטה ממליצה צמיחת תאים למפגש 100% ולא מחשיבה את הגבלת הפוטנציאל הזה לתאים רגישים למגע מסוימים, כגון תאי גזע 8. אותו החששות יש להחיל את מידת הנזק שהוא inflicted על התאים (שלב 1.5). הפרוטוקול המתואר כאן נועד להעריך את השינויים בנדידת תאים לאחר נזק על ידי חשיפה לעשן סיגריות מסיסה בתאי גזע יכולת הנדידה, אבל assay זה יכול להיות שימושי באותה מידה בהערכת ההשפעה של סוגים שונים של נזק על נדידת תאים. חשוב שניזק מעונה הוא מספיק כדי לספק הבחנה סטטיסטית בין קבוצות ניסוי ובקרה. עם זאת, נזק רב מדי עלול גם לגרום למפגש תא מופחת, ששוב עלול להשפיע על היכולת של תוכנת ההדמיה לזהות בצורה נכונה את הקצוות של השריטה.
שתי הזדקנות התאית והתרבות תאים יכולים להיות גורמים מבלבלים שיכול בטעות לשנות את התוצאות של assay מאפס. בפרט, הדור של השריטה יש לשקול בזהירות כדי למנוע נזק מופרז לתאים המקיפים שעלולה לגרום להזדקנות. מגרד עם קצה פיפטה פלסטיק ולא hypodermמחט IC או אזמל ימנע נזק עודף תוך שמירה על השלמות של פני השטח צלחת התרבות באזור ההגירה ותאית-המטריצה (שלב 2.1). בנוסף, משך זמן שנדידת תאים מותרת להתרחש יש לשקול בזהירות כדי למנוע התפשטות תאים משמעותית כמשתנה מתערב (שלב 3.7). לניתוח של הגירת LR-MSC, 7 שעות היא אופטימליות כאשר הערכת תאים פגומים עם מנוע חיפוש מותאם אישית. דוגרים תאים לשעה יותר מ 12 הוא בדרך כלל לא מומלץ, אולם זה אינו חלים על כל סוגי התאים, במיוחד אלו עם שיעורי הכפלה נמוכים מאוד. כדי להעריך את שני הזדקנות תאית והתפשטות תאים, שילוב של קשורים הזדקנות בטא galactosidase וBrdU או התאגדות edu יכול להתבצע על התאים בסוף assay 19. חשוב לציין, הפרוטוקול המתואר כאן הוא נגיש למעבדות עם יכולת טכנית מוגבלת, הדורשות רק מיקרוסקופ באיכות טובה הפוך שלב ניגודיות ומצלמה.ריאגנטים הם לא יקרים, ואת תוכנת ההדמיה היא קוד פתוח. עם זאת, על מנת להבטיח תוצאות אופטימליות מassay זה, כולל שחזור טוב והיכולת לבצע ניתוח סטטיסטי קפדני, אופטימיזציה זהירה צריכה להיחשב לכל סוג תא חדש או תרחיש נזק ניסיוני שניסה.
אופטימיזציות מוצגות בכתובת פרוטוקול זה חלק מהמגבלות קיימות בנעשתה כדי לתקן מבחני שריטה העבודה קודמת. ואילו פרוטוקולי assay שריטה לקחת מסורתיים מדידות רוחב שריטה מתמונת מצב של 8,9 מאפס, הפרוטוקול המובא כאן משתמש במדידות שטח מתמונות שצולמו לכל האורך של השריטה להגדיל הקפדה סטטיסטית ולקחת בחשבון חוסר עקביות ברוחב של השריטה הראשונית. בהתבסס על בדיקות חוזרות ונשנות (מידע לא מוצג), רוחב שריטה לא ניתן להניח להיות עקבי בצורה מושלמת בכל אורכו. לאחר הגירה, הקצוות ההשריטה דואר הפכה הטרוגנית יותר, ולכן קשה יותר ויותר לחישוב מדויק רוחב מאפס, ועוד מחייב חישובי אזור. פרוטוקול זה משתמש MRI_Wound_Healing_Tool, תכנית מחשב מיוחדת, על מנת להקטין את הסובייקטיביות ולהגדיל את העקביות בעת ניתוח האזור מאפס. אמנם זה לא ידוע אם חישובי רוחב פשוטים יכולים להניב תוצאות ספציפיות מספיק כדי להבחין בין הבדלים דקים בהגירה בשל CSE לפני או מזיק אחר, פרוטוקול זה מדגים רגישות זו. אופטימיזציות שהוצגו בפרוטוקול זה לשפץ את assay השריטה הנפוץ לטיפול במגבלות אלה באופן מבחינה כלכלית, להציע אפשרויות להתאמה אישית, ולספק טכניקות נוספות להפגין רגישות ולאמת את התוצאות.
Assay השריטה כמותי מותאם מתואר בפרוטוקול זה עדיין מוגבל על ידי בהתחשב אוכלוסיית תא, ולא תאים בודדים. assum טכניקה זוes שאוכלוסיית התא היא הומוגני יחסית, ושזה יגרום למאפייני הגירה הומוגני יחסית. בהתאם ליישום, זה עשוי להיות רלוונטי יותר לשקול ההגירה של תאים בודדים במקום 8. יתר על כן, פרוטוקול assay השריטה שתואר כאן הוא תלוי באוכלוסייה של תאים שלא להתרבות במהירות מספיק כדי לבלבל את הניתוח של הגירה על פני תקופה 4-7 שעות. שורות תאים שעלולים להתרבות בהרחבה בפרק זמן קצר זה לא תהיינה מתאימה לניתוח באמצעות טכניקה זו. למרות מגבלות אלה, יש פרוטוקול assay השריטה כמותי זה הפוטנציאל לשימוש ביישומים רבים ושונים. לדוגמא, assay מבוסס נזק לתאים עשוי להיות מותאם ולאחר מכן השתמש כדי להעריך את היכולת של טיפולים מסוימים להגביל נזק לתאים. לחלופין, assay זה עשוי לשמש עם שורות תאי הסרטן להעריך טיפולים פוטנציאליים להגביל את יכולת נדידה, ולכן פוטנציאל גרורתי, oו תאים אלה. assay שריטה מותאם זה גם עדיין מוגבל על ידי הפרעות אפשריות למייקרו-סביבת התא שהם בלתי נמנעים ביצירה מאפס. עם זאת, על ידי בחירת רמת מפגש תא, אפופטוזיס מוגבר והדור של גיליונות של תאים שמופרדים באופן חלקי על הקצה של השריטה בזהירות ניתן להימנע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200 mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200 μl pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healing plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
- Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay. J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).
- Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).
- Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices. Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).
- Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates. Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).
- Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).
- Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism. Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).
- Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts. J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).
- Chung, C. A., Chen, C. Y. The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber. J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).
- Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules. Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).
- Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).
- Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy. Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).
- McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).
- Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung. Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).
- Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One. 9 (12), e115963 (2014).
- Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD. Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).
