Abstract
여기, 우리는 효율적으로 자세한 절차를 설명하고 직접 헤모필루스 인플루엔자를 제공 마우스의 하부 호흡기로. 우리는 H. 제조 과정을 보여 인플루엔자 접종, H.의 내부 기관 점안 폐에 인플루엔자, 차동 유전자 발현 분석을위한 기관지 폐포 세척액 (BALF), 폐포 세척액에서 면역 세포의 분석 및 RNA 분리의 컬렉션입니다. 이 절차는 임의의 박테리아, 바이러스 또는 진균에 폐 염증 반응을 연구하는데 사용될 수있다. 적은 모호성으로보다 효율적으로 하부 호흡기로 세균 접종을 제공하기 때문에 직접 기관 점안은 주로 비강 내 또는 에어로졸 흡입 절차를 통해 바람직하다.
Introduction
염증은 감염 인자에 대한 방어의 기본 면역 메커니즘입니다. 그것은 병원균 퇴치 및 손상된 조직의 복구를 촉진한다. 또한, 일반 건강 상태 1로 회복을 용이하게한다. 그러나, 조절 이상 염증은 종종 만성 염증성 질환이 리드. 기도 염증은 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 천식 및 폐 섬유증과 같은 3 가지 폐 질환의 초기 트리거이다.
비 typeable (봉입) 헤모필루스 인플루엔자 (NTHi)의 상부 및 하부 만성 폐 염증성 질환 4,5-와 연관된다. 그것은 만성 폐쇄성 폐 질환 4,6,7 어린이와 성인의 하부기도에서 분리 지배적 인 종이다. NTHi 감염 후 염증 반응은 (예컨대 TNF 및 IL-1β와 같은) 염증성 사이토킨의 상향 조절이 특징이며, B를 매개y를 미토 겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 및 수신자와 같은 수용체를 통해 핵 인자 κB (NF-κB) (TLR에) 8.
마우스 모델 때문에 서로 다른 유전자가 결핍 된 라인의 가용성의 폐 염증성 질환의 기본 병리학을 분석하는 매우 유용한 도구입니다. 여러 방법은 비내 점적 및 에어로졸 흡입 9,10- 포함한 실시간 / 감쇠 박테리아와 세균 제품을 접종하는데 사용되었다. 여기, 우리는 내 기관 점안을 보여줍니다. 덜 빈번하게 사용되지만,이 방법은 더욱 효율적이고 때문에 하부 호흡기 접종원 직접 전달 재현성이다.
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Protocol
모든 실험은 베일러 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 지침에 따라 수행되었다.
1. 배양 비 typeable 헤모필루스 인플루엔자 (NTHi)과 접종 준비
- 초콜릿 한천 플레이트 접시 NTHi를 37 ° C, 5 % CO 2에서 하룻밤 가습 CO 2 배양기에서 거꾸로 판을 유지한다. 다음 날, 문화 뇌 심장 주입 국물에 박테리아. 그런 다음, 멸균 1.5 ML 튜브로 국물 1 ㎖를 추가합니다.
- 실온에서 5 분 동안 4000 × g으로 원심 분리기. 그 다음, 상층 액을 제거하고 멸균 1X PBS 1 ㎖에 펠릿을 다시 일시. 일단이 단계를 반복합니다.
- 분광 광도계로 파장 600nm에서의 희석 배양 흡광도 1X PBS 900 μL에 재현 탁 용액 100 μl를 전송하고 측정한다.
- 생존 및 집락 형성 단위를 결정초콜렛 아가 플레이트에 1시 10분 연속 희석을 배양 CO 2, 37 ℃에서 밤새 배양하고 5 % 접종 S (CFUs).
- 이전 단계에서 결정된 가능성에 기초하고 CFUs, 20 × 106 CFU / ml의 최종 농도로 접종을 조정한다.
2. 인트라 기관 (IT) 점적
- 150 ㎎ / ㎖ + 케타민 20 ㎎ / ㎖ 용액과 자일 라진 마우스 0.1 ml / 10 g 체중으로 마우스의 복강 (IP)을 주입한다. 절차는 동물을 따뜻하게 유지하는 광원과 후드에서 수행해야합니다.
- 마우스가 적절하게 마취되었는지 확인하기 위해 마우스의 인터 공간을 꼬집어.
- 그 뒷면에 마우스를 놓습니다. 목 복부 영역을 면도 클로르헥시딘, 70 % 에틸 알코올로 소독.
- 쥐 치아 집게를 사용 넥 부의 상부 복부 피부를 리프트. 메스를 이용하여 흉선 상기 작은 절개 (0.5-1.0 cm)를 만들기조심스럽게 기관을 노출 근육을 해부하다.
- 27 G 바늘 1 mL를 주사기를 사용하여 서서히 다른 0.05 ㎖의 공기 다음 컨트롤과 같은 제 1 염에서 얻어진 용액 0.05 NTHi 다음 0.05 ml의 공기를, 주사. 약 1 분 동안 수직 동물을 유지합니다.
- 수술 접착제와 절개를 닫습니다. 약 10 분 동안 옆으로 누운 따뜻한 마우스를 유지합니다.
3. BALF 컬렉션
- 감염 후 자궁 전위 24 시간으로 마우스를 희생.
- 해부 가위와 마우스의 복강을 열고 출혈 복부 대동맥을 잘라. 폐의 복부 부분을 노출.
- 기관을 노출하고 20 게이지 카테터를 삽관. BALF 버퍼의 0.8 ㎖ (1X PBS, 0.1 % 덱 스트로스, 10 U / ㎖ 헤파린)를 주입하고 부드러운 흡입에 의한 세척를 수집합니다. 이 과정을 세 번 반복합니다.
- hemocyto BALF를 사용하여 현탁액 100 ㎕의 세포의 총 수를 카운트트리 판 블루 염색으로 10 배 배율 아래 미터.
- 수정 김사 염색 슬라이드를 준비합니다. 5 분 500 XG에 cytospin 원심 분리기의 적절한 우물에 폐포 세척액의 나누어지는 100 μL. 10 분 동안 슬라이드를 건조 및 제조 업체의 프로토콜에 따라 수정 김사 염색을 사용하여 세포를 얼룩.
- 이러한 개화 (FACS) 정렬 활성화 세포, 공 초점 현미경, 유전자 발현 및 웨스턴 블롯 11-13 후속 분석을 위해 남아있는 세포를 사용합니다.
4. 조직 병리학 준비
- 단계 2.4에 설명 된대로 조직 병리학 분석을 위해, NTHi와 마우스를 감염. 감염 24 시간 후 자궁 전위에 의해 동물을 희생. 폐와 앞서 언급 한 바와 같이 기관을 노출 해부 가위로 흉강을 열고 잘라. 그리고, 기관에 20 게이지 카테터를 삽입합니다.
- 4 % 포르말린에서 제조 된 2 % 따뜻한 아가로 오스 용액으로 폐를 입력합니다. 일단폐는 완전히 아가로 오스 솔루션을 응고 폐의 상단에 장소 얼음, 팽창된다.
- 그런 다음, 조심스럽게 흉부 플러그를 제거하고 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 부분에 대한 처리 될 때까지 1X PBS에서 4 % 포르말린 50 ㎖ 용액에 넣어.
BALF에서 세포를 염색 5. FACS
- 96 웰 V 바닥 마이크로 타이 터 플레이트에 BALF 유체 1 × 10 5 세포를 넣습니다.
- 4 ° C에서 3 분 동안 4,000 XG에 300 차가운 1X PBS의 μL 및 스핀 세포를 씻으십시오.
- (1 : 1000 희석) 1X PBS 100 ㎕를 세포 염색 용액으로 세포를 염색하고 15 분 동안 실온에서 유지한다.
- 4 ° C에서 3 분 동안 4,000 XG에 차가운 1X PBS 300 μL와 세포를 씻으십시오.
- 하나를 포함 FACS 세척 완충액 [세척 완충액 (1X PBS, 2 % FBS, 1 mM의 EDTA, 0.1 % 나트륨 아 지드] 100 ㎕에 세포를 유지 : 100 희석 된 Fc 블록을 4 ℃에서 15 분 동안.
- 4,000 XG에 원심 분리기 세포 3 분 및 저녁을 먹다 폐기ernatant.
- 4 ℃에서 30 분 동안 FACS 세척 버퍼 (100 희석 1) 100 ㎕의 표면 얼룩 칵테일 얼룩 세포.
- 4 ° C에서 3 분 동안 4,000 XG에 FACS 세척 버퍼 300 μL로 세 번 세포를 씻으십시오.
- 실온에서 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데하이드 100 ㎕에 세포를 고정한다.
- 4 ° C에서 3 분 동안 400 XG에서 PBS 1 배 300 μL로 두 번 세포를 씻고 FACS 세척 버퍼 300 μL에 다시 일시 중지합니다.
- 비드 유동 세포 계측법을 사용하여 단색 오염 제어를 만든다.
- 96 웰 V 바닥 마이크로 리터 판에 구슬 한 방울을 추가하고 PBS 1 배 200 μL 세척.
- PBS와 구슬 1 배 100 μL에 염색 항체의 1 μl를 추가하고 5 분 동안 실온에서 품어.
- PBS 1 배 300 μL로 두 번 구슬을 씻으십시오.
- 14 유동 세포 계측법에 의해 단일 염색 컨트롤과 세포를 분석 할 수 있습니다.
RNA를 분리하기 위해 폐 조직의 균질화 6.
- 감염 후 폐 (20 ~ 40 mg)의 작은 조각을 수집하고 밤새 4 ° C에서 시약을 안정화 RNA에 보관합니다. 그리고, 다음 단계까지 -80 ℃에서 보관.
- RNA 안정화 시약 없애 차가운 1X PBS의 폐 조직을 씻으십시오.
- 1.5 ㎖의 원심 분리기 튜브 포함 용해 버퍼 (1 ml의 용해 버퍼 + 10 μL의 β-머 캅토 에탄올)로 조직을 놓습니다.
- 뾰족한 가위를 사용하여 작은 조각으로 조직을 잘라 및 20 ~ 40 초 동안 무선 모터 펠렛 유봉을 사용하여 균질화.
- 5 분 동안 얼음에 해물을 유지하고 단계 7.1를 진행합니다.
폐 7. RNA 분리
- 3 분 동안 18,000 XG에 해물을 원심 분리기. 피펫으로 상층 액을 제거하고 조심스럽게 새로운 1.5 ML 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 해물을 70 % 에탄올 1 볼륨을 추가합니다. 피펫 즉시 혼합하고 2-4 분 동안 기다립니다.
- 배치 스핀 컬럼에 해물의 700 μL까지 이동2 ml의 포집 관에서.
- 15 초 동안 9,600 XG에 원심 분리기와 흐름을 통해 폐기하십시오.
- 15 초 동안 9,600 XG에 350 μL에게 엄격한 세척 버퍼와 원심 분리기를 추가합니다. 흐름을 통해 폐기하십시오.
- I 직접 스핀 컬럼 막에 80 μL의 DNase를 추가하고 실온에서 15 분 동안 유지.
- 15 초 동안 9,600 XG에 스핀 컬럼 및 원심 분리기 350 μl의 엄격한 세척 버퍼를 추가합니다. 흐름을 통해 폐기하십시오.
- 15 초 동안 9,600 XG에 500 ㎕의 RNA 세척 버퍼와 원심 분리기를 추가합니다. 흐름을 통해 폐기하십시오.
- 2 분 동안 9,600 XG에 500 ㎕의 RNA 세척 버퍼와 스핀을 추가합니다. 흐름을 통해 폐기하십시오.
- 1 분 동안 9,600 XG에 새로운 2 ㎖의 수집 튜브와 원심 분리기에 스핀 열을 놓습니다. 흐름을 통해 폐기하십시오.
- 1 분 동안 9,600 XG에 스핀 컬럼 및 원심 분리기에 직접 30 ~ 50 μL의 RNase없는 물을 추가합니다. -80 ° C에서 보관 RNA.
- RNAseq 분석 (14)을 수행합니다.
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Representative Results
내 기관 점안은 식염수 설치보다 폐포 세척액 (그림 1A, 왼쪽 패널)에서 백혈구의 현저하게 증가 된 수의 결과. 백혈구의 미분 계수 분석 분명히 증가 호중구 침윤 (도 1, 오른쪽 패널)을 보였다. BALF에서 세포의 FACS 분석은 상기 호중구 수의 증가 (도 1b)를 확인했다. 폐 조직을 H & E 염색 섹션의 조직 학적 분석은기도 염증 (도 1C)을 증가 하였다. 이러한 데이터 집합 내 기관 점안은 생쥐의기도 염증을 유도하는 것이 좋습니다. 기도 기전을 조절하는 신호 전달 경로를 연구를 위해이 방법의 사용을 지원하기 위해, 우리는 E3 유비퀴틴 리가 가려움에 대한 결핍 마우스를 사용 하였다. 가려움은 15 염증성 신호 전달 경로를 조절에 관여하는 것으로 알려져있다. 우리는 접종나이와 성별을 일치 야생형 C57BL / 6 제어 및 가려움는 - / - NTHi와 마우스. - / - 우리는 제어 WT과 가려움의 폐 조직에서 RNA를 격리 마우스와 차별적으로 발현되는 염증 유전자를 식별하기 위해 전체 전 사체 서열 분석을 수행 하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 가려움 결핍 여러 유전자의 차등 발현 결과. 이것은 인트라 기관 점적은 폐 염증, 유전자 발현 프로필 및 신호 전달 경로를 조사하기 위해 사용될 수 있음을 시사한다.
그림 1 : NTHi의 인트라 기관 접종 쥐에서 폐 염증을 유도 마우스가 NTHi (106 CFU / 마우스) 또는 식염수 제어 접종 하였다.. 접종 24 시간 후, 마우스 (A) BALF 수집 한 희생시켰다. 총 백혈구, 단핵구 및 호중구 수를 측정 하였다. 데이터 제시으로는 ± SEM을 의미한다. N = / 그룹 4 쥐. * 식염수 처리 된 마우스에 비해 P <0.05를 나타냅니다. (B)의 BALF 세포는 안티 GR1 항체로 염색하고, FACS로 분석 하였다. (C) H & 백혈구 침윤과 염증을 보여주는 폐 섹션을 E-스테인드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 : WT 가려움의 폐 차등 유전자 발현 - / - 인트라 기관 NTHi 접종 NTHi 접종 후 24 시간이 RNA 두 WT의 폐에서 분리 된 다음 마우스 (1, 2) 및 두 개의 가려움 - / -. (1, 2) 마우스. (A) RNA의 품질 bioanalyzer를 사용하여 분석 하였다. (B) 열 맵에서 멀리 SD의 척도로 해석 (Z-점수를 표시백만 분의 로그 2 수의 평균)을 (가려움에 에저를 사용하여 식별 172 차등 발현 유전자의 2 CPM)을 로그 - / -. WT 마우스에 비해 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서, 우리는 박테리아 폐 병원체와 마우스의 폐를 접종 독특하고 최소 침습 절차를 설명합니다. 우리는이 절차 염증성 신호 전달 경로의 유전자 결핍 마우스를 이용하여 다양한 유전자의 기능을 연구하는데 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 이 절차는 또한 바이러스 및 진균 감염에 폐 염증 반응을 연구하는데 사용될 수있다. 이러한 비내 에어로졸 또는 흡입 같은 다른 방법을 통해이 절차의 이점 (1)이 절차에서 병원성 접종 직접 하부 호흡기 점적되며 (2) 균액의 크기를 제어 할 수있는 기능; (3) 박테리아 핸들러 노출 위험을 감소시켰다.
수술 박테리아 주입 용 기관의 노출 치료가 주위 조직, 특히 혈관 손상을주지 않도록주의해야 중요한 단계이다.
기관 쉬에 박테리아의 점안에 의한 질식으로 마우스의 사망 가능성을 방지하기 위해주의 깊게 수행 할 수 울드. 접종 (50 μL)을 천천히 출시 및 공기 전과 접종 후 주입하는 것이 좋습니다. 잠시 동안 점안 다음 마우스가 수직 유지하고는 옆으로 누운 유지하는 빠른 복구를 용이하게한다. 이 방법의 주요 단점은 짧은 시간 내에 다수의 노출로 인해 수술의 필요에 불가능하다는 것이다. 잠재적 인 문제는 카테터 기관지 너무 깊게 배치하면, BALF 세포 수가 낮은 것 때문이다. 이 문제는 약간 위쪽으로 튜브를 당겨 해결 될 수있다.
기도 염증 질환의 발병률이 질환의 병태 생리에 대한 이해 전세계 3,16 증가되므로 가장 중요하다. 이 연구에 기술 된 기술은 조절 키 경로를 식별하는 데 도움이 될 수 있고, 개발을 촉진 할 수새로운 치료 방법의.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
| Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Iml syringe | BD | REF 309602 | |
| Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
| Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
| Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Working dilution 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Working dilution 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
| Formaldehyde | Polyscience | 4018 |
References
- Medzhitov, R.
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M.
- Barnes, P. J. Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).
- Sethi, S., Murphy, T. F. Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).
- King, P. T., Sharma, R. The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi). J Immunol Res. 2015, 706376 (2015).
- Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis. Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).
- King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. Respir Med. 101, 1633-1638 (2007).
- Shuto, T., et al. Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).
- Moghaddam, S. J., et al. Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).
- Rajagopalan, G., et al. Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice. Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).
- Ganesan, S., et al. Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A. Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).
- Hogner, K., et al. Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia. PLoS Pathog. 9, e1003188 (2013).
- Karisola, P., et al. Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation. PloS one. 10, e0129446 (2015).
- Theivanthiran, B., et al. The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1. Sci Signal. 8, 22 (2015).
- Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation. Immunol Cell Biol. , (2015).
- Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M.
