Abstract
Här beskriver vi ett detaljerat förfarande för att effektivt och direkt leverera Haemophilus influenzae in i de nedre luftvägarna hos möss. Vi visar förfarandet för framställning av H. influenzae inokulum, intratrakeal instillation av H. influenzae in i lungan, insamling av bronko-alveolär sköljvätska (BALF), analys av immunceller i BALF, och RNA-isolering för differentiell genuttryck analys. Detta förfarande kan användas för att studera lungan inflammatoriska responsen på någon bakterier, virus eller svampar. Direkt trakeal indrypning är oftast att föredra framför intranasal eller aerosol inandning förfaranden eftersom det mer effektivt levererar den bakteriella inokulatet i de nedre luftvägarna med mindre tvetydighet.
Introduction
Inflammation är en grundläggande immunmekanism i försvaret mot smittämnen. Det främjar patogen utrotning och reparation av skadad vävnad. Det underlättar också återhämtning till ett normalt friskt tillstånd 1. Men leder oreglerad inflammation ofta kroniska inflammatoriska sjukdomar 2. Luftvägsinflammation är en första trigger för olika lungsjukdomar såsom kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL), astma och lungfibros 3.
Den icke-typningsbara (icke-inkapslat) Haemophilus influenzae (NTHi) är associerad med kronisk övre och nedre delen av lungan inflammatoriska sjukdomar 4,5. Det är den dominerande arten som isolerats från de nedre luftvägarna hos barn och vuxna med kronisk obstruktiv lungsjukdom 4,6,7. Det inflammatoriska svaret efter NTHi-infektion kännetecknas av uppreglering av proinflammatoriska cytokiner (såsom TNF och IL-1β), och det förmedlas by mitogen aktiverat proteinkinas (MAPK) och nukleär faktor kB (NF-kB) genom avgifts liknande receptorer (TLR) 8.
Musmodeller är mycket användbara verktyg för att analysera den underliggande patologin av lunginflammationssjukdom på grund av tillgängligheten av olika genprodukter-deficient linjer. Flera metoder har använts för att inokulera levande / försvagade bakterier och bakteriella produkter, inklusive intranasal instillation och aeros inandning 9,10. Här visar vi intratrakeal instillation. Även om de används mindre ofta, är detta synsätt mer effektiv och mycket reproducerbar grund av den direkta leveransen av inokulumet till de nedre luftvägarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med riktlinjerna i Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) i Baylor Research Institute.
1. Odling Icke-typningsbara Haemophilus influenzae (NTHi) och förbereda inokulatet
- Plattan NTHi på en chokladagarplatta och hålla plattan upp och ner i en fuktad CO2 inkubator över natten vid 37 ° C och 5% CO2. Följande dag, kultur bakterierna i hjärn-hjärt-infusionsbuljong. Därefter tillsätts 1 ml av buljongen i ett sterilt 1,5 ml rör.
- Centrifugera vid 4000 xg under 5 min vid rumstemperatur. Då, kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml steril 1 x PBS. Upprepa detta steg en gång.
- Överför 100 pl resuspenderas lösning i 900 pl 1 x PBS och mäta absorbansen av den utspädda kulturen vid 600 nm våglängd i en spektrofotometer.
- Bestäm livskraft och kolonibildande enhets (CFU) av inokulatet genom odling av 1:10 seriespädningar på choklad agarplattor och inkubering över natt vid 37 ° C och 5% CO2.
- Baserat på livskraften och CFU bestämdes från det tidigare steget, justera inokulum till en slutlig koncentration av 20 x 10 6 CFU / ml.
2. intratrakeal (det) Instillation
- Injicera musen intraperitonealt (ip) med 0,1 ml / 10 g kroppsvikt hos mus med en 150 mg / ml ketamin + 20 mg / ml xylazin lösning. Förfarandet bör utföras i huven med en ljuskälla för att hålla djuret varm.
- Nyp inter utrymme på musen för att kontrollera att musen är tillräckligt sövd.
- Placera musen på rygg. Raka den ventrala delen av halsen och desinficera med klorhexidin och 70% etylalkohol.
- Lyft huden på övre ventrala delen av halsen med hjälp av råtta tand pincett. Gör ett litet snitt (0,5-1,0 cm) ovanför bräss med hjälp av en skalpelloch försiktigt dissekera muskeln för att exponera luftstrupen.
- Med hjälp av en 1 ml spruta med en 27 G nål, långsamt injicera 0,05 ml luft, följt av 0,05 ml NTHi erhållits från avsnitt 1 eller saltlösning som kontroll, följt av ytterligare 0,05 ml luft. Håll djur vertikalt för cirka 1 minut.
- Stänga snittet med kirurgiskt lim. Håll musen i sidled liggande och varm i ca 10 min.
3. BALF Collection
- Offra musen genom cervikal dislokation 24 tim efter infektion.
- Öppna bukhålan av musen med anatomiska sax och klippa den ventrala aorta att blöda. Exponera den ventrala delen av lungan.
- Exponera luftstrupen och intubation det med en 20 gauge kateter. Ingjuta 0,8 ml BALF buffert (1x PBS, 0,1% dextros, 10 U / ml heparin) och samla upp skölj genom försiktig aspiration. Upprepa denna procedur tre gånger.
- Räkna det totala antalet celler i 100 pl BALF suspensionen med hemocytometer under 10x förstoring med Trypan Blue-färgning.
- Förbered bilder för modifierad Giemsa färgning. Alikvot 100 pl BALF i lämpliga brunnar i cytospin och centrifugera vid 500 xg under 5 min. Torka glasen för 10 min och färga celler med användning av modifierad Giemsa-färgning enligt tillverkarens protokoll.
- Använda de kvarvarande celler för efterföljande analys, såsom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS), konfokalmikroskopi, genexpression och western blöt 11-13.
4. Histopatologi Framställning
- För histopatologisk analys, infektera möss med NTHi som beskrivs i steg 2,4. Efter 24 timmar av infektion, offra djuren genom halshuggning. Skär öppna brösthålan med anatomiska sax för att exponera lungorna och luftstrupen som tidigare nämnts. Sedan sätter den 20 gauge kateter i luftstrupen.
- Fyll lungorna med 2% varm agaros framställd i 4% formalin. Närlungor är fullt uppblåst, plats is ovanpå lungorna att stelna agaroslösningen.
- Sedan försiktigt bort bröst pluggen och placera den i en 50 ml lösning av 4% formalin i 1x PBS tills det bearbetas för hematoxylin och eosin (H & E) sektioner.
5. FACS färgade celler i BALF
- Sätta 1 x 10 5 celler från BALF vätska i en 96-brunnars V-botten mikrotiterplatta.
- Tvätta cellerna med 300 ul av kall 1 x PBS och centrifugering vid 4000 xg under 3 min vid 4 ° C.
- Färga cellerna med cell fläck lösning i 100 ^ 1 x PBS (1: 1000 utspädning) och hålla vid rumstemperatur under 15 minuter.
- Tvätta cellerna med 300 ul av kallt 1x PBS vid 4000 xg under 3 min vid 4 ° C.
- Hålla cellerna i 100 pl FACS tvättbuffert [Tvättbuffert (1 x PBS, 2% FBS, 1 mM EDTA, 0,1% natriumazid] innehållande 1: 100 utspätt Fc-Block under 15 min vid 4 ° C.
- Centrifugera cellerna vid 4000 xg under 3 min och kasserar supernatant.
- Fläcken celler med 100 | j, l ytfärgning cocktail (1: 100 spädning) i FACS tvättbuffert under 30 min vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna tre gånger med 300 ul av FACS tvättbuffert vid 4000 xg under 3 min vid 4 ° C.
- Fixera celler i 100 pl 4% paraformaldehyd under 15 min vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna två gånger med 300 ^ il 1 x PBS vid 400 xg under 3 min vid 4 ° C och återsuspendera i 300 | il FACS-tvättbuffert.
- Gör enfärgade färgnings kontroller med hjälp av flödescytometri pärlor.
- Tillsätt en droppe av pärlor in i 96-brunnars V-botten mikrotiterplatta och tvätta med 200 ^ il 1 x PBS.
- Tillsätt 1 pl av färgnings antikropp till 100 | il 1 x PBS och pärlor och inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
- Tvätta pärlor två gånger med 300 pl 1 x PBS.
- Analysera enkel färgade kontroller och celler med flödescytometri 14.
6. Homogenisering av lungvävnad att isolera RNA
- Efter infektion, samla en liten bit av lungan (20-40 mg) och hålla den i RNA stabiliseringsreagens vid 4 ° C över natten. Därefter förvaras vid -80 ° C tills nästa steg.
- Tvätta lungvävnad i kall 1x PBS för att bli av med RNA-stabilisering reagens.
- Placera vävnaden i en 1,5 ml centrifugrör innehållande lyseringsbuffert (1 ml lysbuffert + 10 | il β-merkaptoetanol).
- Hacka vävnaden i små bitar med hjälp av spetsiga sax och homogenisera med hjälp av en trådlös motor pellets mortelstöt för 20-40 sekunder.
- Håll lysatet på is i 5 minuter och fortsätt med steg 7,1.
7. RNA Isolering från Lung
- Centrifugera lysatet vid 18000 xg under 3 min. Avlägsna supernatanten genom pipettering och försiktigt överföra den till en ny 1,5 ml rör.
- Lägga en volym av 70% etanol till lysatet. Blanda omedelbart genom att pipettera och vänta 2-4 minuter.
- Överför upp till 700 pl lysat till en spinnkolonn placeradi en 2 ml uppsamlingsrör.
- Centrifugera vid 9600 x g under 15 sek och kassera genomströmning.
- Lägg 350 ul stringent tvättbuffert och centrifugera vid 9600 xg under 15 sek. Kassera genomströmning.
- Lägg 80 | il DNas I direkt till spinnkolonn membranet och hålla den vid rumstemperatur under 15 min.
- Lägg 350 ul stringent tvättbuffert till spinnkolonn och centrifugera vid 9600 xg under 15 sek. Kassera genomströmning.
- Tillsätt 500 l RNA tvättbuffert och centrifugera vid 9600 xg under 15 sek. Kassera genomströmning.
- Tillsätt 500 l RNA tvättbuffert och centrifugering vid 9600 xg under 2 minuter. Kassera genomströmning.
- Placera spinnkolonn i ett nytt 2 ml uppsamlingsrör och centrifugera vid 9600 xg under 1 min. Kassera genomströmning.
- Lägga 30-50 | il RNas-fritt vatten direkt till spinnkolonn och centrifugera vid 9600 xg under 1 min. Store RNA vid -80 ° C.
- Utföra RNAseq analys 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intratrakeal instillation resulterade i en markant ökning av antalet leukocyter i BALF (Figur 1A, vänstra panelen) än installationen med saltlösning. Den differentialräkning analys av leukocyterna visade tydligt ökad neutrofil infiltration (Figur 1, högra panelen). FACS-analys av cellerna i BALF bekräftade vidare det ökade antalet neutrofiler (Figur 1B). Histologisk analys av H & E-färgade sektioner av lungvävnaden visade ökad luftvägsinflammation (Figur 1C). Dessa data tyder kollektivt att intratrakeal instillation inducerar luftvägsinflammation hos möss. Att stödja användningen av denna metod för att studera signalvägar som reglerar luftvägarna patogenes, använde vi möss som är bristfälliga för E3 ubiquitin ligas klia. Itch är känd för att vara involverad i regleringen av inflammatoriska signalvägar 15. vi inokuleradeålders- och könsmatchade vildtyp C57BL / 6 kontroll och klia - / - möss med NTHi. Vi isolerade RNA från lungvävnader för kontroll WT och klia - / - möss och utfört hela transkriptom sekvensering för att identifiera de inflammatoriska gener som uttrycks differentiellt. Såsom visas i figur 2, Itch-brist resulterade i differentiell expression av flera gener. Detta tyder på att intratrakeal instilla kan användas för att undersöka lunginflammation, genuttrycksprofilerna och signalvägar.
Figur 1: intratrakeal ympning av NTHi inducerar lunginflammation hos möss Möss ympades med NTHi (10 6 CFU / mus) eller en saltlösningskontroll.. 24 h efter ympningen avlivades mössen (A) BALF uppsamlades. De totala leukocyter, monocyter och neutrofiler tal bestämdes. Data presenterassom medelvärden ± SEM. n = 4 möss / grupp. * Indikerar p <0,05 jämfört med saltlösningsbehandlade möss. (B) Cellerna i BALF färgades med anti-Gr1 antikropp och analyserades med FACS. (C) H & E-färgade lungsektioner visar leukocytinfiltration och inflammation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Differential genuttryck i lungorna hos WT och klia - / - möss efter intra-trakeal NTHi ympning 24 h efter NTHi inokulering, isolerades RNA från lungorna av två WT (1, 2) och två Itch - / -. (1, 2) möss. (A) RNA kvalitet analyserades med användning av en Bioanalyzer. (B) Värme karta som visar Z-poäng (tolkas som ett mått på sd ifrånmedelvärdet) för stocken 2 talet per miljon (log 2 CPM) av 172 differentiellt uttryckta gener som identifierades med hjälp av kant i Itch - / -. jämfört med WT möss Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Häri beskriver vi en unik och minimalt invasiv procedur för att ympa lungorna hos möss med en bakteriell lung patogen. Vi visar att detta förfarande kan användas för att studera funktionen av olika gener med användning av möss som har brist på gener av inflammatoriska signalvägar. Detta förfarande kan också användas för att studera de inflammatoriska svar mot virala och fungala infektioner i lungorna. Fördelarna med detta förfarande jämfört med andra metoder, såsom intranasal eller aerosolinhalation är (1) i detta förfarande, den patogena inokulatet är direkt instilleras till de nedre luftvägarna; (2) förmågan att styra inokulum storlek; och (3) minskad risk för bakteriell exponering för föraren.
Exponering av luftstrupen kirurgiskt för att ingjuta bakterier är ett avgörande steg där man måste vara försiktig för att undvika skador på omgivande vävnader, speciellt blodkärlen.
Instillation av bakterier in i luftstrupen should göras noggrant för att undvika risken för dödsfall av mössen genom kvävning. Det föreslås att inokulatet (omkring 50 | j, l) frigöras långsamt och luft injiceras före och efter inokulum. Att hålla musen vertikala efter instillation för en stund och hålla dem i sidled tillbakalutad underlättar snabbare återhämtning. Den största nackdelen med detta förfarande är att flera exponeringar inom en kort tidsperiod är inte möjligt på grund av kravet på operationen. En potentiellt problem är att om katetern placeras för djupt i bronker kommer celltal BALF vara lägre. Detta problem kan lösas genom att man drar i röret något uppåt.
Eftersom förekomsten av luftvägsinflammatoriska sjukdomar ökar över hela världen 3,16, förstå patofysiologin av dessa sjukdomar är av största vikt. Den teknik som beskrivs i denna studie kan bidra till att identifiera viktiga regulatoriska vägar och skulle kunna underlätta utvecklingenav nya behandlingsmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
| Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Iml syringe | BD | REF 309602 | |
| Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
| Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
| Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Working dilution 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Working dilution 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
| Formaldehyde | Polyscience | 4018 |
References
- Medzhitov, R.
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M.
- Barnes, P. J. Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).
- Sethi, S., Murphy, T. F. Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).
- King, P. T., Sharma, R. The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi). J Immunol Res. 2015, 706376 (2015).
- Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis. Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).
- King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. Respir Med. 101, 1633-1638 (2007).
- Shuto, T., et al. Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).
- Moghaddam, S. J., et al. Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).
- Rajagopalan, G., et al. Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice. Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).
- Ganesan, S., et al. Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A. Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).
- Hogner, K., et al. Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia. PLoS Pathog. 9, e1003188 (2013).
- Karisola, P., et al. Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation. PloS one. 10, e0129446 (2015).
- Theivanthiran, B., et al. The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1. Sci Signal. 8, 22 (2015).
- Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation. Immunol Cell Biol. , (2015).
- Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M.
