Summary
Un método de alto rendimiento para la purificación negativa de un solo paso de Helicobacter pylori recombinante proteína activadora de neutrófilos (HP-PAN) sobreexpresado en Escherichia coli mediante el uso de resinas de dietilaminoetilo en modo batch se describe. HP-PAN purificado por este método es beneficioso para el desarrollo de vacunas, medicamentos o diagnósticos para H. pylori -asociado enfermedades.
Abstract
Helicobacter pylori proteína activadora de neutrófilos (HP-PAN) es un importante factor de virulencia de Helicobacter pylori (H. pylori). Desempeña un papel crítico en H. pylori inducida por inflamación gástrica mediante la activación de varios leucocitos innatos incluyendo neutrófilos, monocitos y mastocitos. Las propiedades inmunogénicas e inmunomoduladoras de HP-NAP lo convierten en un candidato potencial de diagnóstico y de vacuna para H. pylori y un nuevo fármaco candidato para la terapia del cáncer. Con el fin de obtener cantidades sustanciales de purificado HP-NAP utilizado por sus aplicaciones clínicas, un método eficaz para purificar esta proteína con alto rendimiento y pureza necesita ser establecido.
En este protocolo, hemos descrito un método para una sola etapa de purificación cromatográfica negativo de HP-NAP recombinante sobreexpresada en Escherichia coli (E. coli) mediante el uso de dietilaminoetilo resinas de intercambio iónico (DEAE) (por ejemplo., Sephadex) iel modo por lotes n. Recombinante HP-PAN constituye casi el 70% del total de proteínas en E. coli y está casi completamente recuperado en la fracción soluble tras la lisis celular a un pH de 9,0. Bajo la condición óptima a pH 8,0, la mayoría de HP-NAP se recupera en la fracción no unida, mientras que las proteínas endógenas de E. coli se eliminan de manera eficiente por la resina.
Este método de purificación mediante cromatografía de lote modo negativo con resinas de intercambio iónico DEAE produce funcional HP-NAP de E. coli en su forma nativa con alto rendimiento y pureza. El HP-PAN purificada podría ser utilizado más para la prevención, tratamiento y pronóstico de la H. pylori -asociado enfermedades, así como la terapia del cáncer.
Introduction
Helicobacter pylori (H. pylori) es una causa importante de gastritis y úlcera péptica. Esta bacteria también ha sido clasificado como un carcinógeno en humanos por parte de la Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer, que forma parte de la Organización Mundial de la Salud, en el año 1994. Se ha estimado que la prevalencia de H. pylori es del 70% en los países en desarrollo y del 30-40% en los países industrializados 1. A pesar de que la tasa de infección de H. pylori está disminuyendo en los países industrializados, la tasa de infección de H. pylori en los países en desarrollo sigue siendo alta 2. El tratamiento estándar para erradicar H. pylori consiste en la administración de un inhibidor de la bomba de protones, IBP y dos antibióticos, claritromicina o metronidazol más amoxicilina 3. Sin embargo, el aumento de la resistencia a los antibióticos en H. pylori relacionados con la PI terapia de úlceras insta al desarrollo de nuevas estrategias para prevenir or curar la infección. Desarrollo de la vacunación preventiva y / o terapéutica contra H. pylori podría proporcionar un enfoque alternativo para el control de H. pylori.
Helicobacter pylori proteína activadora de neutrófilos (NAP-HP), un importante factor de virulencia de H pylori, se identificó por primera vez en extractos de agua de H. pylori con la capacidad de activar los neutrófilos a adherirse a las células endoteliales y producir especies de oxígeno reactivas (ROS) 4. La infiltración de neutrófilos de la mucosa gástrica se encuentra en H. pylori pacientes infectados con gastritis activa pueden resultar en la inflamación y el daño tisular del estómago. Por lo tanto, HP-NAP puede jugar un papel patológico mediante la activación de los neutrófilos para inducir inflamación gástrica, lo que hace aún más úlcera o H. pylori -asociado enfermedades gástricas. Sin embargo, HP-PAN es un candidato potencial para aplicaciones clínicas 5,6. Debido a la pro inmunogénica e inmunomoduladorpiedades de HP-NAP, esta proteína se podrían utilizar para desarrollar vacunas, agentes terapéuticos, y herramientas de diagnóstico. Un ensayo clínico se ha realizado para el uso de HP-NAP recombinante como uno de los componentes de una vacuna de proteína contra H. pylori. Esta vacuna consiste en HP-NAP recombinante, asociado a la citotoxina gen A (CagA), y las proteínas vacuolizante citotoxina A (VacA) formulado con hidróxido de aluminio y además se ha demostrado que es segura e inmunogénica en humanos 7. Además, HP-PAN actúa como un potente inmunomodulador para desencadenar T auxiliares de tipo 1 (Th1) -polarized respuestas inmunes para la terapia del cáncer 8 y para regular hacia abajo las respuestas inmunitarias mediadas por Th2 provocadas por reacciones alérgicas e infecciones parasitarias 9,10. Como para el diagnóstico, recombinante ELISA basado en HP-PAN se ha aplicado a la detección de anticuerpos séricos contra HP-NAP en H. pylori pacientes infectados 11. Un estudio mostró que el nivel de anticuerpos HP-PAN-específica en sueros de H. pylori pacientes infectados con cáncer gástrico fue significativamente mayor que la de los pacientes con gastritis crónica 12. Otro estudio también demostró que los anticuerpos séricos contra HP-NAP se asocian con la presencia de no cardia adenocarcinoma gástrico 13. Por lo tanto, recombinante ELISA basado en HP-NAP se puede aplicar a la detección de anticuerpos séricos contra HP-NAP para el pronóstico del cáncer gástrico en H. pylori pacientes infectados. En su conjunto, el HP-PAN purificada podría ser utilizado más para la prevención, tratamiento y pronóstico de la H. pylori -asociado enfermedades, así como la terapia del cáncer.
Entre los diversos métodos utilizados para la purificación de recombinante HP-NAP expresado en Escherichia coli (E. coli) en su forma nativa informado hasta ahora, se necesita una cromatografía de filtración en gel segunda etapa de purificación que implica obtener alta pureza HP-NAP 14-16 . Aquí, un método que utiliza cromatografía de modo por lotes negativa condietilaminoetilo (DEAE) resinas de intercambio iónico se describe para la purificación de HP-NAP sobreexpresa en E. coli con alto rendimiento y alta pureza. Esta técnica de purificación se basa en la unión de proteínas y / o impurezas que no sean HP-PAN a la resina de la célula huésped. A pH 8,0, casi no hay otras proteínas, excepto HP-NAP se recuperan de la fracción no unida. Este enfoque purificación utilizando cromatografía de intercambio iónico de DEAE en el modo negativo es simple y ahorrando al permitir la purificación de HP-PAN recombinante mediante cromatografía de un solo paso a través de la recogida de la fracción no unida tiempo. Además de HP-NAP, varias otras biomoléculas, tales como virus 17, la inmunoglobulina G (IgG) 18, la hemoglobina 19, la proteína fosfatasa 20, y el factor de virulencia flagelina 21, también se han informado de que se purificó por cromatografía de intercambio de iones en negativo modo. Se prefiere el modo negativo para la cromatografía de intercambio iónico, si las impurezas son el menorcomponentes presentes en la muestra sometida a purificarse 22. La aplicación de la cromatografía negativo en la purificación de biomoléculas naturales o recombinantes se ha revisado recientemente 23.
El presente informe ofrece un paso a paso el protocolo para la expresión de HP-PAN recombinante en E. coli, lisis de las células, y la purificación de HP-NAP usando cromatografía por lotes modo negativo con resinas de intercambio iónico de DEAE. Si una proteína deseada para la purificación es adecuado para cromatografía de intercambio iónico en el modo negativo, el protocolo descrito también podría ser adaptado como punto de partida para el desarrollo de un proceso de purificación.
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Protocol
La sangre humana se obtuvo de voluntarios sanos con consentimiento informado por escrito antes y aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Nacional Tsing Hua, en Hsinchu, Taiwán.
1. La expresión del recombinante HP-PAN en E. coli
- Preparar el plásmido pET42a-NAP que contiene la secuencia de ADN de HP-NAP de H. pylori cepa 26695 16 como se describió previamente. Preparar los plásmidos que contienen la secuencia de ADN de HP-NAP con las mutaciones puntuales deseadas como se describe (véase el Protocolo, paso 8).
- Transformar 10 ng de los plásmidos de ADN anteriores en E. coli BL21 (DE3) células competentes por choque térmico durante 45 segundos a 42 ° C, las células consecutivas en caldo lysogeny (LB) placas de agar que contenían 50 mg / ml de kanamicina, e incubar las placas a 37 ° C durante 16 horas.
- Inocular colonias individuales en tubos individuales que contienen 5 ml de caldo LB con 50 mg / ml de kanamicina y crecer como cultivos previos en 37 ° C durante 16 horas con agitación a 170 rpm.
- Inocular 2 ml de las células pre-cultivo anterior en 200 ml de caldo LB que contenía 50 mg / ml de kanamicina en un matraz de 1 L. Incubar el matraz de cultivo inoculado a 37 ° C durante 2 horas con agitación a 170 rpm hasta que la absorbancia a 600 nm alcanza aproximadamente desde 0,4 hasta 0,5 detectado por un espectrofotómetro UV / VIS.
- Añadir 80 l de 1 M isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) en el cultivo anterior a una concentración final de 0,4 mM para inducir la expresión de HP-NAP. Incubar el cultivo durante 3 horas hasta que la absorbancia a 600 nm alcanza aproximadamente 1/6 a 1/7.
- Centrifugar las células a 6000 xga 4 ° C durante 15 minutos para eliminar el sobrenadante. Almacenar el sedimento de células a -70 ° C hasta la purificación.
2. Preparación de la fracción de proteína soluble que contiene HP-PAN
Nota: Todas las siguientes etapas se llevan a cabo a 4 ° C.
- Resuspender 50 ml de la célula pEllet preparado en el Protocolo de paso 1,6 en 20 ml de 20 mM Tris-HCl, pH 9,0, NaCl 50 mM que contiene 0,13 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 0,03 mM N-alfa-tosil-L-lisinil-clorometilcetona (TLCK), y 0,03 mM N-tosil-L-phenylalaninyl-clorometilcetona (TPCK) a 4 ° C como se ha descrito previamente 16.
- Romper las células de bacterias haciendo pasar la suspensión bacteriana a través de un homogeneizador de alta presión que funciona a una gama de 15.000 a 20.000 psi durante 7 veces a 4 ° C.
- Centrifugar el lisado de células a 30.000 × g a 4 ° C durante 1 hora para separar las fracciones de proteínas solubles e insolubles mediante el uso de una ultracentrífuga. Transferir el sobrenadante como la fracción de proteína soluble a un vaso de precipitados.
- Medir la concentración de proteína de la fracción de proteína soluble por el método de Bradford utilizando un kit comercial con albúmina de suero bovino (BSA) como el estándar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Añadir 177,6 l de HCl 1 N en 20 ml de THe fracción de proteína soluble obtenida de Protocolo paso 2.3, para ajustar el valor de pH desde pH 9,0 a pH 8,0.
- Añadir 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 50 mM a la solución de proteína de arriba para hacer la concentración de proteínas final sea 0,5 mg / ml.
3. Purificación de recombinante HP-NAP de E. coli mediante cromatografía modo por lotes negativo con resinas de intercambio iónico DEAE
- Preparar 15 ml de resinas DEAE.
- Pesar 0,6 g de polvo seco de resinas DEAE y suspenderlo en 30 ml de 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 50 mM a temperatura ambiente durante al menos 1 día.
- Se centrifuga la resina a 10.000 x g a 4 ° C durante 1 min.
- Retirar y desechar el sobrenadante.
- Añadir 15 ml de 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 50 mM.
- Repetir los pasos Protocolo 3.1.2 a 3.1.4 de cuatro veces más.
- Almacenar los 15 ml se establecieron resina (suspensión al 50% en 30 ml de tampón Tris) a 4 ° C para su uso posterior.
Nota: Todos los siguientes pasoss se llevan a cabo a 4 ° C.
- Añadir 45 ml de las proteínas solubles preparadas en el Protocolo paso 2,6-15 ml de la resina y se agita la suspensión de proteína / resina con un agitador magnético a 4 ° C durante 1 hr.
- Se vierte la suspensión de proteína / resina en una columna de plástico o de vidrio equipado con una llave de paso. Deje que la resina se asiente por gravedad.
- Abrir la llave de paso para permitir que la solución de proteína a través de la columna por flujo de gravedad hasta que el nivel de líquido en la columna es justo por encima de la resina. Recoger el flujo a través de como la fracción no unida, que contiene el purificada HP-NAP.
- Añadir 15 ml de helado de 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 50 mM en la columna.
- Abrir la llave de paso para permitir que el tampón de lavado a través de la columna por flujo de gravedad hasta que el nivel de líquido en la columna es justo por encima de la resina. Recoger el flujo a través de como la fracción de lavado.
- Repetir los pasos Protocolo de 3.5 a 3.6 cuatro veces más para recoger las fracciones de lavado adicionales.
- Añadir 15 ml de helado de 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl en una columna.
- Abrir la llave de paso para permitir que el tampón de elución a través de la columna por flujo de gravedad hasta que el nivel de líquido en la columna es justo por encima de la resina. Recoger el flujo a través de como la fracción de elución.
- Repetir los pasos Protocolo de 3,8 a 3,9 cuatro veces más para recoger las fracciones de elución adicionales.
4. El cambio de tampón y la eliminación de endotoxina de HP-PAN purificó mediante cromatografía en modo batch negativa con DEAE Resinas
Nota: El purificada HP-NAP expresa en E. coli tiene que ser sometido a intercambio de tampón y la eliminación de endotoxina antes de estimular neutrófilos.
- Realizar la diálisis para cambiar el tampón de la purificado HP-PAN a la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS), pH 7,2, a 4 ° C mediante el uso de un tubo de diálisis con corte de peso molecular de 14 kDa como se ha descrito previamente 24.
- Se filtra la HP-PAN se dializa a través de un syringfiltro de correo con una membrana cargada positivamente, hidrófila unida a una jeringa desechable de 20 ml a velocidades de flujo entre 2,5 y 4 ml / minuto a 4 ° C para eliminar la endotoxina.
5. Caracterización de las propiedades moleculares de recombinante purificada HP-PAN por dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida electroforesis en gel (SDS-PAGE), Western Blot, nativo-PAGE, cromatografía de filtración en gel y dicroísmo circular Espectroscopía
- Analizar el purificada HP-NAP recombinante por SDS-PAGE y transferencia Western con sobrenadantes de cultivo de hibridoma que contiene el anticuerpo monoclonal de ratón MAb 16F4 25 como se describió anteriormente 24.
- Analizar el HP-PAN se purifica mediante nativo-PAGE y cromatografía de filtración en gel para examinar su estado oligomérico como se ha descrito previamente 26.
- Analizar el purificada HP-PAN recombinante mediante espectroscopía de dicroísmo circular para examinar su estructura secundaria como se ha descrito previamente 26.
6. Evaluación de la pureza de HP-PAN por tinción de plata de un gel SDS-PAGE
- Preparar la solución de fijación, solución, solución de plata, solución de revelado sensibilizante, la solución de parada, y la solución de lavado de acuerdo con las instrucciones del fabricante de un kit de tinción de plata.
- Realizar tinción de plata de un gel SDS-PAGE de acuerdo con las instrucciones del fabricante de un kit de tinción de plata.
- Adquirir la imagen del gel con un sistema de imagen.
7. Medición de la Producción de ROS por los neutrófilos inducida por HP-PAN
- Aislar los neutrófilos humanos a partir de sangre heparinizada humana mediante sedimentación con dextrano seguido de centrifugación en gradiente de densidad como se describió anteriormente 24.
- Medición de la producción de ROS por los neutrófilos estimulados con HP-NAP mediante el uso de un ensayo de quimioluminiscencia de luminol-dependiente.
- Encienda un lector de placas y ajustar la temperatura a 37 ° C. Coloque unainferior plato vacío plana de 96 pocillos blanca dentro de la cámara de lector de placas, lo que permite que se caliente a 37 ° C.
- Preparar las mezclas de estímulo en el D-PBS, pH 7,2, que contiene 0,9 mM CaCl 2, 0,5 mM MgCl 2, y 13,3 M 5-amino-2,3-dihidro-1,4-phthalazinedione (luminol) con la presencia y ausencia de 0,67 M-endotoxina eliminado HP-PAN preparado a partir de Protocolo paso 4.2.
- Ajustar la concentración de neutrófilos humanos preparados a partir de Protocolo de paso 7,1 a 2 x 10 6 células / ml en D-PBS, pH 7,2, que contenía glucosa 5 mM.
- Añadir 50 l de suspensión de neutrófilos en cada pocillo de la placa de 96 pocillos tiempo.
- Añadir 150 l de las mezclas preparadas a partir de estímulo Protocolo paso 7.2.2 en los neutrófilos así que contienen en un intervalo de tiempo de 5 segundos por pocillo.
- Medir la emisión de quimioluminiscencia durante 5 segundos por pocillo durante un período de tres horas usando un lector de placas.
8.Construcción de plásmidos de ADN que albergan HP-PAN mutantes por Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) a base de mutagénesis directa
Nota: mutagénesis directa basada en PCR fue generado básicamente como se ha descrito previamente 27, excepto que los sitios de restricción "silenciosas" fueron introducidos en los cebadores de mutagénesis por mutagénesis dirigida (SDM) software -Ayudar 28.
- Realizar la reacción de PCR.
- Añadir 10 ng de plásmido pET42a-NAP, 1 M de pares de cebadores de mutagénesis listados en la Tabla 1, 200 mM de trifosfatos de desoxinucleósidos (dNTP), y 3 unidades de alta fidelidad mezcla de enzimas PCR en un tubo de PCR que contiene agua desionizada, dando una final volumen de 25 l.
- Iniciar los ciclos de PCR en 95 ° C durante 10 minutos para desnaturalizar el ADN molde, y sigue con 12 ciclos de amplificación a 95 ° C durante 1 minuto, Tm sin -5 ° C durante 1 minuto y 72 ° C durante 6 minutos.
- Terminar los ciclos de PCR conuna etapa de recocido en T m pp -5 ° C durante 1 minuto y una etapa de extensión a 72 ° C durante 30 min.
- Tratar 15 l de producto de PCR con 0,4 l de enzima de restricción Dpn I a 37 ° C durante 2 horas y luego analizar 2 l del producto de PCR tratado con Dpn I mediante electroforesis en gel de agarosa.
- mutantes de pantalla.
- Transformar 2 l de producto de PCR en E. coli DH5a células competentes por choque térmico de 45 segundos a 42 ° C.
- Propagar las células transformadas en una placa LB que contiene 50 mg / ml de kanamicina y se incuba la placa a 37 ° C durante 16 horas.
- Aislar el ADN plasmídico de las colonias bacterianas utilizando un kit comercial de lisis alcalina de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Se trata el ADN de plásmido aislado en el Protocolo paso 8.3.3 con enzima de restricción XhoI para verificar la presencia de las mutaciones silenciosas deseado de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- secuencia de laplásmido de ADN verificado por paso Protocolo 8.3.4 con el cebador promotor T7 para confirmar la corrección de las secuencias codificantes de mutantes HP-NAP según el protocolo del fabricante.
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Representative Results
El diagrama esquemático del procedimiento experimental de la purificación negativa de recombinante HP-NAP expresa en E. coli mediante el uso de resinas de intercambio iónico de DEAE en modo por lotes se muestra en la Figura 1. Esta técnica de purificación se basa en la unión de proteínas y / o impurezas que no sean HP-PAN a la resina de la célula huésped. A pH 8,0, casi no hay otras proteínas, excepto HP-NAP en su forma nativa se recuperan de la fracción no unida (Figura 2A y B). El purificada HP-NAP en la fracción no unida fue inmunodetectado por el anticuerpo contra HP-NAP (Figura 2C), y su pureza fue mayor que 97% como se confirmó por tinción con plata (Figura 2D). Además, el purificada HP-NAP recombinante mantiene su forma oligomérica tal como se analizó por PAGE nativa (Figura 2B) y cromatografía de filtración en gel (Figura 3A). spectroscop dicroísmo circularanálisis ic mostró que la proteína purificada se compone principalmente de alfa-hélices (Figura 3B). Además, el purificada HP-NAP era capaz de estimular los neutrófilos humanos para producir ROS (Figura 3C). Por lo tanto, la HP-NAP recombinante purificada por este enfoque es en su forma nativa con la actividad biológica. Además, este modo por lotes cromatografía negativa se puede utilizar para purificar HP-NAP recombinante con mutaciones puntuales en un solo paso. Como se muestra en la Figura 4, los dos mutantes HP-NAP Y101H y HP-NAP E97GY101H recombinantes, que imitan HP-NAP de H. pylori NCTC 11639 y NCTC 11.637 cepas, respectivamente, se purificaron por cromatografía de este lote modo negativo con pureza superior al 95%.
Para realizar la cromatografía de modo por lotes negativa usando resinas DEAE para purificar HP-NAP, el valor pH del tampón utilizado para la purificación se debe ajustar a 8,0para asegurar que la mayoría de HP-NAP está presente en la fracción no unida. Menor cantidad de HP-NAP estaba presente en las fracciones no unidas cuando el valor de pH del tampón era mayor o menor que 8,0 (Figura 5). A pesar de que la pureza de HP-NAP presente en las fracciones no unidas se incrementó sólo un poco como pH aumentó desde 7,0 hasta 9,0, la cantidad de HP-NAP presente en las fracciones no unidas fue la más alta cuando el valor de pH del tampón era pH 8.0 (Figura 5). La cantidad de las proteínas solubles a partir de lisados celulares cargados en la resina es otro factor importante para esta purificación. Aquí, la relación es de 1,5 mg de proteínas por mililitro de resina para lograr la capacidad máxima de la resina para absorber las impurezas de E. coli (Figura 6). Además, la pureza y el rendimiento de HP-NAP obtenido por este cromatografía modo por lotes negativo se puede aumentar sustancialmente mediante el aumento de la cantidad de HP-NAP presente en la fracción soluble deLisados de E. coli. Recombinante HP-NAP se recuperó casi completamente en la fracción soluble tras la lisis celular a pH 9,0 (Figura 7). A pesar de que la solubilidad de HP-NAP recombinante en E. coli lisados se aumentó notablemente cuando las células se lisaron en el tampón con pH superior a 7,5 (Figura 7), a menos de 90% de HP-NAP estaba presente como la proteína soluble cuando las células se lisaron en el tampón con pH inferior a 9,0.
Figura 1:. Representación esquemática de la purificación negativa de HP-PAN por DEAE Resinas en modo batch La purificación comienza con un procedimiento de unión por lotes. La fracción de proteína soluble que contiene HP-NAP obtenido a partir de lisados bacterianos se añade a la resina DEAE pre-equilibrada con tampón Tris a pH 8,0. Las proteínas / suspensiones de resina se incuban a 4 ° C durante 1 hora con mixi suaveng. Durante la incubación, las proteínas de la célula huésped se unen a la resina. HP-PAN presente en la fracción libre se obtiene por medio recogiendo el sobrenadante después de la centrifugación o la fracción de flujo a través de una columna dirigido por flujo por gravedad. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Resultado Ejemplar de Purificación de HP-PAN por cromatografía modo por lotes negativo con resinas de intercambio iónico DEAE Todo el lisado celular (W) y la fracción de proteína soluble (S) de E. coli BL21 (DE3) que expresa HP-NAP y la fracción no unida (U) que contiene HP-NAP de la cromatografía de intercambio iónico DEAE se analizaron por SDS-PAGE (A),-PAGE nativa (B), y el Western Blot (C). El frac no unidoción con la cantidad indicada de las proteínas que van desde 1 mg a 10 g se analizó en un gel SDS-PAGE teñido con plata (D). Las masas moleculares (M) en kDa se indican a la izquierda de los geles teñidos y la mancha. (Adaptado de la referencia 24) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: estructural y caracterización funcional de recombinante HP-NAP purificada a partir de E. coli por cromatografía modo por lotes Negativo. (A) El perfil de absorbancia UV se registró para HP-NAP eluida de una columna de filtración en gel. Las masas moleculares de los marcadores de proteínas se indican en el cromatograma. (B) El dicroísmo circular UV lejano SPECTron de HP-PAN fue grabado en el rango de longitud de onda de 195 a 260 nm. (C) Los neutrófilos humanos (1 x 10 5 células) fueron tratados con 0,5 mM HP-NAP y D-PBS, pH 7,2, como un control negativo en 37 ° C. El contenido de ROS generados a partir de los neutrófilos se midió continuamente mediante el uso de un ensayo de quimioluminiscencia de luminol-dependiente. Los datos se representan como la media ± desviación estándar de un experimento por triplicado. (Adaptado de la referencia 24) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Purificación de mutantes recombinantes HP-PAN expresaron en E. coli mediante cromatografía modo por lotes negativo. Las fracciones de proteínas solubles de E. coli BL21 (DE3) que expresan dos mutantes recombinantes E97GY101H HP-PAN Y101H y HP-PAN y de tipo salvaje HP-PAN se purificaron por cromatografía en modo negativo con resinas DEAE. Las fracciones no unidas se analizaron por SDS-PAGE. Las masas moleculares (M) en kDa se indican a la izquierda de los geles teñidos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Efecto del tampón de pH en la purificación de recombinante HP-NAP Expresado en E. coli por cromatografía modo por lotes negativo. La fracción soluble de E. coli BL21 (DE3) que expresa HP-NAP se lisaron a pH 9,0 se ajustaron a pH indicado que van desde 7,0 hasta 9,0 y una concentración de proteína de 0,3 mg / ml. estos ajustadofracciones, que se indican como la carga, después se cargaron en resinas DEAE para purificar HP-NAP recombinante por cromatografía en modo por lotes negativa a 4 ° C. Los, lavado, y fracciones de elución no unidas se analizaron por SDS-PAGE. Las masas moleculares (M) en kDa se indican a la izquierda de los geles teñidos. (Adaptado de la referencia 24) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Efecto de la cantidad de proteínas Se cargó en DEAE resinas para purificar recombinante HP-PAN expresaron en E. coli. Las fracciones de proteínas solubles de E. coli BL21 (DE3) que expresa HP-NAP se cargaron en resinas DEAE de acuerdo con la relación indicada de proteínas mg por mililitro de resinas para purificar recombinante HP-PAN por la cromatografía por lotes negativa a pH 8,0. Las proteínas solubles, indican como la carga (L), la fracción no unida (A), la fracción de lavado (B), y la fracción de elución (C) se analizaron por SDS-PAGE. Las masas moleculares (M) en kDa se indican a la izquierda de los geles teñidos. (De referencia 24) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Efecto del pH sobre la solubilidad de HP-NAP en E. coli lisados. (A) E. coli BL21 (DE3) que expresa HP-NAP se suspendió en tampón Tris-HCl enfriado con hielo al pH indicado que van desde 7,0 hasta 9,5. Las células fueron lisadas y los lisados de células enteras a continuación (W) se centrifugaron to separar las fracciones solubles (S) y sedimentos insolubles (I). Las proteínas se analizaron por SDS-PAGE. Las masas moleculares (M) en kDa se indican a la izquierda de los geles teñidos. (B) El porcentaje de solubilidad de HP-NAP recombinante en todo el lisado celular en cada pH se calcula a partir de la intensidad de la banda de HP-NAP en geles de SDS de la fracción soluble (S) dividido por que, para el lisado de células enteras (W ). Los datos se representan como la media ± desviación estándar de al menos dos experimentos. (De referencia 24) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: cebadores utilizados para la mutagénesis. Por favor click aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
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Discussion
La cromatografía por lotes modo negativo con resinas de intercambio aniónico DEAE que aquí se presenta es adecuado para la purificación de HP-NAP recombinante sobreexpresada en E coli. Los valores de pH de los tampones utilizados en las etapas de lisis celular y la purificación son muy críticos para asegurar la solubilidad de HP-NAP en E. Los lisados de E. coli y la separación eficiente de HP-NAP recombinante a partir de las impurezas de la célula huésped, respectivamente. Las células bacterianas deben ser lisadas a pH 9,0, y la purificación negativa deben realizarse a pH 8,0 para obtener HP-NAP con alto rendimiento y alta pureza. La recuperación típica de HP-NAP es 90%, y la pureza típica es de 95% 24. Desde HP-NAP está presente en la fracción no unida, una cantidad mínima pero suficiente de la resina se debe utilizar para conseguir su máxima capacidad de absorber las impurezas. En nuestro caso, la capacidad máxima de carga es de 1,5 mg de las proteínas solubles de E. Los lisados de E. coli por mililitro de resina.
el provided protocolo está diseñado para la purificación de HP-PAN recombinante a partir de un 50 ml E. cultivo de E. coli. El rendimiento de HP-PAN es de alrededor de 15 mg. El proceso de purificación se puede escalar hacia abajo, ya sea o mayor escala en consecuencia. Por ejemplo, los dos mutantes E97GY101H HP-NAP Y101H y HP-NAP recombinantes se purificaron a partir de un ml E. 1 cultivo de E. coli mediante el uso de este modo por lotes cromatografía negativa. Ambos mutantes HP-NAP con pureza superior al 95% se obtiene recogiendo la fracción no unida (Figura 4). Esta cromatografía modo por lotes negativo también se han aplicado para purificar HP-NAP recombinante a partir de un ml E. 860 cultivo de E. coli. La recuperación de la etapa de cromatografía usando el modo por lotes negativo DEAE ha alcanzado 97% con una pureza mayor que 90%.
HP-NAP expresó en Bacillus subtilis (B. subtilis) también se ha purificado con éxito por este cromatografía por lotes modo negativo DEAEen un solo paso 26. En nuestro B. sistema de expresión subtilis, el nivel de expresión de HP-PAN es baja. HP-PAN sólo representa alrededor del 5% de las proteínas solubles totales de los lisados bacterianos. A pesar de que HP-NAP específica para la purificación está presente en una cantidad pequeña, HP-NAP con pureza superior al 90% se puede obtener mediante la reducción de la relación de la cantidad de proteínas de lisados celulares cargados en la resina para eliminar eficazmente casi todo el endógeno proteínas de B. 26 subtilis. Por lo tanto, este método también puede aplicarse para purificar HP-NAP recombinante expresada en otros huéspedes bacterianos.
Varios métodos han sido reportados para la purificación de HP-NAP recombinante en su forma nativa 14-16. Sin embargo, se requiere una etapa de cromatografía de filtración en gel adicional para obtener HP-NAP en alta pureza. Esta purificación cromatográfica negativa puede producir de manera eficiente funcional HP-NAP recombinante con alta pureza en un solo paso. en additien, la etapa de desalinización no es necesario debido a la baja concentración de sal en la fracción no unida. La purificación en modo por lotes también podría obviar la necesidad de una columna. Por lo tanto, este modo por lotes cromatografía negativa utilizando resina DEAE ofrece un método simple y eficiente para purificar HP-HAP en su forma nativa con alto rendimiento y pureza. HP-NAP purificada por este método podría ser utilizado además para el desarrollo de vacunas, nuevos medicamentos y diagnósticos para H. pylori relacionados con la PI enfermedades o por otras nuevas aplicaciones terapéuticas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| pET42a-NAP | N/A | N/A | prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317 |
| E. coli BL21 (DE3) | Thermo Fisher Scientific Inc | C6000-03 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 |
| Kanamycin | Amresco | 25389-94-0 | http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | MD Biomedical Inc | 101-367-93-1 | http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20 |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 10837091001 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW |
| N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) | Sigma-Aldrich | T7254 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW |
| N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) | Sigma-Aldrich | T4376 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW |
| Protein standard (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | P5619 | a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW |
| DEAE–Sephadex A-25 chloride form | Sigma-Aldrich | A25120 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW |
| Spectrum/Por dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132720 | with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720; |
| Acrodisc® units with Mustang® E membrane | Pall | MSTG25E3 | for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992 |
| mouse monoclonal antibody MAb 16F4 | N/A | N/A | raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585 |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare Life Sciences | 28989335 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335 |
| PlusOne silver staining kit, protein | GE Healthcare Life Sciences | 17-1150-01 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002 |
| Flat bottom 96-well white plate | Thermo Fisher Scientific Inc | 236108 | http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW |
| Expand long template PCR system | Sigma-Aldrich | 11681834001 | source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW |
| Dpn I | New England Biolabs | R0176S | https://www.neb.com/products/r0176-dpni |
| Xho I | New England Biolabs | R0146S | https://www.neb.com/products/r0146-xhoi |
| E. coli DH5α | Thermo Fisher Scientific Inc | 18265-017 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017 |
| Name | Company | Product Number | Comments |
| Equipment | |||
| U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer | Hitachi | N/A | out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers |
| EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer | Avestin Inc | C315320 | http://www.avestin.com/English/c3page.html |
| Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge | Hitachi Koki Co | 90106401 | for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 18-1900-26 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026 |
| Aviv model 62ADS CD spectrophotometer | Aviv Biomedical | N/A | out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php |
| LAS-3000 imaging system | Fujifilm | N/A | discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810 |
| Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter | Perkin-Elmer | 1420-018 | for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018 |
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