Summary
Rekombinant Helicobacter tek-aşamalı negatif saflaştırılması için yüksek verimli bir yöntem tarif edilmektedir küme modunda dietilaminoetil reçineleri kullanılarak Escherichia coli içinde aşırı eksprese nötrofil aktive edici protein (HP-NAP) pylori. Bu yöntem ile arıtılmış, HP-NAP H. aşı, ilaç veya teşhis maddelerinin geliştirilmesi için faydalıdır pylori hastalıkları -associated.
Abstract
Helikobakter pilori nötrofil aktive edici protein (HP-NAP) Helicobacter pylori (H. pylori) önemli bir virülans faktörü olduğu. Bu H. kritik bir rol oynar pylori nötrofiller, monositler ve mast hücreleri dahil olmak üzere birçok doğuştan lökositlerin aktive ederek mide iltihabı indüklenen. HP-NAP bağışıklık ve bağışıklık düzenleyici özellikleri onu H. için potansiyel bir tanı ve aşı adayı yapmak pylori ve kanser tedavisi için yeni bir ilaç adayı. klinik uygulamalarda kullanılan arıtılmış, HP-NAP önemli miktarlarda elde etmek için, etkili bir yöntem, yüksek verim ve saflıkta bu proteinin oluşturulmasına ihtiyaç saflaştırmak için.
Bu protokol, dietilaminoetil (DEAE), iyon değiştirme reçineleri kullanılarak, Escherichia coli (E. Coli) 'de rekombinant aşırı eksprese HP UEP tek adımlı negatif kromatografik arıtma için bir yöntem tanımlanmıştır (örn., Sephadex i)n toplu modunda. Rekombinant HP-NAP E. toplam proteinin yaklaşık% 70 oluşturmaktadır E. coli ve hemen hemen tam olarak pH 9.0 hücre lizizi sonrasında çözünebilir fraksiyondan elde edilir. PH 8.0'da iyi şartlar altında, HP-NAP çoğunluğu bağlanmamış fraksiyon geri kazanılır ise E. endojen proteinler E. coli etkin reçinesi ile giderilirler.
DEAE iyon değişim reçineleri ile negatif mod toplu kromatografisi kullanılarak bu saflaştırma yöntemi E fonksiyonel HP NAP verir yüksek verim ve saflıkta doğal biçiminde coli. Saflaştınldı HP NAP daha önleme, tedavi için kullanılan ve H. prognozu edilebilir pylori hastalıkları yanı sıra kanser tedavisi -associated.
Introduction
Helikobakter pilori (H. pilori) gastrit ve peptik ülser bir ana sebebidir. Bu bakteri, aynı zamanda Kanser, Dünya Sağlık Örgütü adına Araştırmaları Uluslararası Ajansı tarafından insanlarda karsinojen olarak sınıflandırılmıştır, 1994 yılında tahmin edildiğini H. prevalansı pylori enfeksiyonu gelişmekte olan ülkelerde% 70 ve sanayileşmiş ülkelerde 1 30-40% 'dir. Olsa H. enfeksiyon oranı pylori, sanayileşmiş ülkelerde H. enfeksiyon oranını azaltmak olduğunu Gelişmekte olan ülkelerde pylori halen 2 yüksektir. Standart tedavi H. ortadan kaldırmak için pylori enfeksiyonu, bir proton pompası inhibitörü, PPI ve iki antibiyotik, klaritromisin artı amoksisilin veya metronidazol 3 uygulanmasından oluşur. H. antibiyotik direnci Ancak, yükselişi pylori ülser tedavisi o önlemek için yeni stratejilerin geliştirilmesini çağrısı lır enfeksiyonu tedavi. H. karşı önleyici ve / veya terapötik bir aşı geliştirilmesi H. pylori kontrol etmek için alternatif bir yaklaşım sağlayabilir pylori enfeksiyonunun.
Helikobakter pilori nötrofil aktive edici protein (HP-NAP), H. pylori önemli bir virülans faktörü, birinci bir H. su ekstreleri tespit edilmiştir endotel hücrelerine ve reaktif oksijen türlerini (ROS) 4 üretmek için uygun nötrofillerin aktive etme kabiliyetine sahip pylori. H. bulunan mide mukozasının nötrofil infiltrasyonu pylori- aktif gastrit ile enfekte olan hastalarda mide enflamasyon ve doku hasarına yol açabilir. Bu nedenle, HP-NAP fazla ülser veya H. neden gastrik enflamasyon, indükleme nötrofillerin aktive ederek patolojik bir rol oynayabilir pylori mide hastalıkları -associated. Bununla birlikte, HP-NAP klinik uygulamalara 5,6 için potansiyel bir adaydır. Nedeniyle bağışıklık ve bağışıklık düzenleyici proHP UEP perties, bu proteinin aşılar, terapötik ajanlar ve diyagnostik araçlar geliştirmek için kullanılabilir. Bir klinik çalışma H. karşı bir protein aşı bileşenleri olarak yeniden birleştirici HP NAP kullanılarak gerçekleştirilmiştir pylori. Bu aşının, alüminyum hidroksit ile birlikte formüle rekombinant HP NAP, sitotoksin ilişkili gen A (CagA) ve vakuolasyon sitotoksin A (VacA) proteinlerden oluşur ve daha fazla güvenli ve insanlarda 7 imünojenik olduğu gösterilmiştir. Ayrıca HP NAP-kanser terapisi 8 immün yanıtları -polarized aşağı alerjik reaksiyonlar ve parazit enfeksiyonları 9,10 ile ortaya çıkarılan Th2 immün yanıtları düzenleyen (Th1) T yardımcı tip 1 tetiklemek için güçlü bir bağışıklık düzenleyici olarak işlev görür. Diagnostik olarak, yeniden birleştirici HP NAP-tabanlı ELISA H. HP-NAP karşı serum antikorları tespit etmek için uygulanmıştır pylori hasta 11 ile enfekte. Bir çalışma göstermiştir ki H. serumunda HP NAP-özgü antikorların seviyesi pylori mide kanserli hastaların kronik gastrit 12 olan hastalardan alınan göre anlamlı derecede yüksek olduğu ile enfekte. Bir başka çalışma, HP-NAP karşı serum antikorları olmayan kardiya gastrik adenokarsinoma 13 varlığı ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, yeniden birleştirici HP NAP-tabanlı ELISA H. mide kanseri prognoz için HP-NAP karşı serum antikorları tespit etmek için tatbik edilebilir pylori hastaları ile enfekte. Birlikte ele alındığında, arıtılmış, HP-NAP daha önleme, tedavi için kullanılan ve H. prognozu edilebilir pylori hastalıkları yanı sıra kanser tedavisi -associated.
Rekombinant HP NAP saflaştırılması için kullanılan çeşitli yöntemler arasında doğal biçiminde Escherichia coli (E. Coli) 'de ifade edilen ikinci bir saflaştırma aşaması ile ilgili jel filtrasyon kromatografisi yüksek ölçüde saf, HP-NAP 14-16 elde etmek için gerekli olan şu ana kadar rapor . Burada, negatif mod toplu kromatografisi kullanılarak bir yöntemdietilaminoetil (DEAE) iyon-değiştirme reçineleri E. aşırı eksprese HP NAP saflaştırılması için açıklanan yüksek verim ve yüksek saflıkta coli. Bu saflaştırma tekniği konakçı hücre proteinleri ve / veya reçine HP-NAP dışındaki yabancı maddeler bağlanmasının dayanıyordu. pH 8.0, HP-NAP dışında neredeyse başka hiçbir proteinler bağlanmamış fraksiyonu geri kazanılır. negatif modda DEAE iyon değişimi kromatografisi kullanılarak bu saflaştırma yaklaşımı basit ve zaman bağlı olmayan fraksiyon toplama yoluyla tek adımlı kromatografisi ile yeniden birleştirici HP NAP saflaştırılmasını sağlayarak kazandıran. 17, immünoglobülin G (IgG) 18 hemoglobin 19, protein fosfataz 20 ve hastalık oluşturma faktörü flagellin 21 virüsleri gibi, aynı zamanda negatif iyon değişim kromatografisi ile saflaştırılabilir bildirilmiştir HP-NAP, birçok biyomoleküllerin ek olarak, modu. yabancı maddeler küçük ise negatif mod iyon değişimli kromatografi için tercih edilirtabi numunede mevcut olan bileşenlerin 22 arıtılacak. Doğal ya da yeniden birleştirici biyomoleküllerin saflaştırma negatif kromatografi uygulanması en son 23 gözden geçirilmiştir.
Bu rapor E. rekombinant HP NAP ifadesi için adım protokolü tarafından bir adım sağlar E. coli, DEAE iyon değişim reçineleri ile negatif mod toplu kromatografisi kullanılarak HP-UEP hücrelerin parçalanması ve saflaştırılması. arıtma için arzu edilen bir protein negatif modda iyon değiştirme kromatografisi için uygun ise, açıklanan protokol, aynı zamanda bir saflaştırma işleminin geliştirilmesi için bir başlangıç noktası olarak adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan kanı Ulusal Tsing Hua Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu, Hsinchu, Tayvan önceden yazılı aydınlatılmış onam ve onayı ile sağlıklı gönüllülerden alındı.
E. Rekombinant HP NAP 1. İfade E. coli
- H. HP NAP-DNA dizisini içeren plazmid pET42a NAP-hazırlama pylori 26695 suşu olarak daha önce 16 nitelendirdi. tarif edildiği gibi arzu edilen nokta mutasyonu olan HP NAP DNA dizisini ihtiva eden plasmidler hazırlama (Protokolü, adım 8).
- E. yukarıdaki DNA plazmid, 10 ng Dönüşümü E. coli BL21 (DE3) 42 ° C'de 45 saniye için ısı şok kompetan hücreler, çizgi 50 ug / ml kanamisin ve 16 saat 37 ° C'de plakalar inkübe ihtiva eden agar plakaları lizojeni bulamacında hücreleri (LB).
- 50 ug / ml kanamisin ile LB suyu 5 ml ihtiva eden tek tek tüpler içinde tek koloniler inoküle ve 3 ön kültür olarak büyür170 rpm'de çalkalanarak 16 saat, 7 ° C.
- 1 L'lik bir şişede 50 ug / ml kanamisin içeren LB suyu 200 ml, yukarıda ön-kültür hücreleri 2 ml ile inoküle. Yaklaşık bir UV / VIS spektrofotometre ile tespit 0.4-0.5 ulaşır 600 nm'de absorbans ve 170 rpm'de çalkalanarak, 2 saat boyunca 37 ° C'de aşılandı kültür şişesi inkübe edin.
- HP NAP ekspresyonunu indüklemek için 0.4 mM nihai bir konsantrasyona kadar yukarıdaki kültüre 1 M izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) 80 ul ekle. Yaklaşık 1.6-1.7 ulaştığı 600 nm'de absorbans kadar 3 saat boyunca kültür inkübe.
- Santrifüj 15 dakika boyunca 4 ° C'de 6,000 x g'de hücre süpernatan. saflaştırılmadan kadar -70 ° C 'de hücre pelletini saklayın.
HP NAP içeren çözünür protein fraksiyonu 2. Hazırlık
Not: Aşağıdaki adımların hepsi 4 ° C sıcaklıkta gerçekleştirilmektedir.
- Hücre p yeniden süspanse 50 miProtokol adım 1.6 hazırlanan ellet 20 20 mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 mM NaCI ihtiva eden 0.13 mM fenilmetilsülfonil florid (PMSF), 0.03 mM N-alfa-tosil-L-lizinil-klorometilketon (TLCK) ve 0.03 mi 4 ° C'de mM N-tosil-L-fenilalanin-klorometilketon (TPCK) daha önce olduğu gibi 16 tarif.
- 4 ° C 'de 7 kez 15,000 psi ile 20,000 arasında bir dizi çalışan yüksek basınçlı homojenleştirici ile bakteriyel bir süspansiyon geçirilmesiyle bakteri hücreleri bozabilir.
- Santrifüj 1 saat boyunca 4 ° C'de 30.000 x g'da hücre lisatı, bir ultra santrifüj ile çözünen ve çözünmeyen protein fraksiyonları ayırmak için. Bir behere çözünür protein fraksiyonu olarak supernatant aktarın.
- üreticinin talimatlarına göre standart olarak sığır serum albümini (BSA) ile ticari bir kit kullanılarak Bradford metodu ile çözünür protein fraksiyonu Protein konsantrasyonu ölçümü.
- th 20 ml 1 N HCI 177.6 ul eklepH 8.0, pH 9.0 olan pH değerini ayarlamak için Protokol adım 2.3 elde edilen E çözünür protein fraksiyonu.
- Nihai protein konsantrasyonu 0.5 mg / ml olması için yukarıda protein çözeltisine, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCI ekleyin.
E. itibaren Rekombinant HP NAP 3. saflaştırılması DEAE iyon-değişim reçineleri ile Negatif Mod Toplu Kromatografisi coli
- DEAE reçine 15 ml hazırlayın.
- DEAE reçine üzerinden 0,6 gr kuru toz tartılır ve en az 1 gün süre ile oda sıcaklığında, 20 mM Tris-HCI, pH 8.0, 50 mM NaCI, 30 ml içinde askıya.
- 10.000 x reçine santrifüj 1 dakika boyunca 4 ° C 'de örn.
- Süpernatantı çıkarın ve atın.
- 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCI, 15 mL ekleyin.
- Protokol 3.1.2 dört 3.1.4 kez daha adımları tekrarlayın.
- 15 mi daha sonraki kullanım için 4 ° C'de reçinesi (30 ml Tris tamponu içinde% 50 bulamaç) yerleşmiş saklayın.
Not: Bir sonraki adımda tüms, 4 ° C'de gerçekleştirilmektedir.
- reçine 15 ml protokolün adım 2.6 hazırlanan çözünür proteinlerin 45 ml ilave edilir ve 1 saat boyunca 4 ° C 'de manyetik bir karıştırıcı ile, protein / reçine cıvık çamuru ilave edin.
- Bir durdurma musluğu takılmış plastik ya da cam sütuna protein / reçine cıvık çamuru dökün. Reçine yerçekimi altında yerleşmek için izin verin.
- sütununda sıvı seviyesi sadece reçine üzerine kadar protein çözeltisi yerçekimi akışı ile sütun aracılığıyla çalışmasına izin vermek için musluğunu açın. akış yoluyla saflaştırılmış HP NAP içeren ilişkisiz fraksiyon olarak toplayın.
- sütuna buz soğukluğunda 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCI, 15 mL ekleyin.
- sütununda sıvı seviyesi sadece reçine üzerine kadar yıkama tamponu yerçekimi akışı ile sütun aracılığıyla çalışmasına izin vermek için musluğunu açın. akış yoluyla yıkama fraksiyonu olarak toplayın.
- Protokol ek yıkama kesirler toplamak için 3,5 dört 3,6 kez daha adımları tekrarlayın.
- bir kolona buzla soğutulmuş 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCI, 15 mL ekleyin.
- sütununda sıvı seviyesi sadece reçine üzerine kadar elüsyon tamponu yerçekimi akışı ile sütun aracılığıyla çalışmasına izin vermek için musluğunu açın. akış yoluyla elüsyon fraksiyonu olarak toplayın.
- Protokol ek elüsyon kesirler toplamak için 3,8 dört 3,9 kez daha adımları tekrarlayın.
4. Tampon Değişim ve DEAE Reçinelerle Negatif Mod Toplu Kromatografi ile saflaştırılmaktadır HP-NAP Endotoksin Kaldırma
Not: Saflaştırılmış HP NAP-E'de ifade E. coli değişimi ve nötrofilleri stimüle önce endotoksin kaldırma tampon maruz bırakılması gerekmektedir.
- Daha önce tarif edildiği gibi 24 14 kDa molekül ağırlığı kesme diyaliz tüpleri kullanılarak, 4 ° C de, Dulbecco fosfat tamponlu tuz (D-PBS), pB 7.2, saflaştırılmış HP UEP tampon değiştirme diyaliz gerçekleştirin.
- Bir Syring yoluyla diyaliz HP-NAP Filtreendotoksini çıkarmak için 4 ° C sıcaklıkta 2.5 ila 4 ml / dakika arasında değişen akış hızında, 20 ml'lik atılabilir bir şırınga bağlı pozitif yüklü, hidrofilik membrandan e filtresi.
Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), Western blotting, yerel-PAGE, jel filtrasyon kromatografisi ve Dairesel Dikroizm Spektroskopisi ile arıtılmış rekombinan HP UEP moleküler özellikler 5. karakterizasyonu
- Fare monoklonal antikoru Mab 16F4 25 ihtiva eden hibridom kültür süpernatanları ile SDS-PAGE ve Western blotting ile saflaştırılmış rekombinant HP NAP analiz, daha önce 24 tarif.
- Daha önce 26 tarif edildiği gibi oligomerik durumunu incelemek için ana-PAGE ve jel filtrasyon kromatografisi ile arıtılmış, HP-NAP analiz edin.
- Daha önce 26 açıklandığı gibi ikincil yapısını incelemek için dairesel dikroizm spektroskopi ile saflaştırılmış rekombinant HP-NAP analiz edin.
Bir SDS-PAGE jeli gümüş rengine boyanması HP-UEP Saflık 6. Değerlendirme
- Bir gümüş boyama kiti üreticinin talimatlarına göre çözüm, gümüş çözüm, çözüm geliştirme hassaslaştırıcı, sabitleme çözeltisi hazırlayın çözüm durdurmak ve yıkama solüsyonu.
- Bir gümüş boyama kiti üreticinin talimatlarına göre bir SDS-PAGE jel gümüş lekeleme gerçekleştirin.
- Bir görüntüleme sistemiyle jel görüntü elde.
HP-NAP Bağlı Nötrofiller itibaren ROS üretimi 7. ölçümü
- Daha önce tarif edildiği gibi 24 yoğunluk gradyan santrifüjü takiben dekstran çökeltmesi ile insan heparinize kandan İnsan nötrofilleri izole edin.
- nötrofillerden ROS üretiminin ölçümü luminol bağımlı kemikuminensans kullanarak HP-NAP ile uyarılır.
- Bir plaka okuyucusu üzerinde açma ve 37 ° C'de sıcaklık ayarlanır. bir yerleştirinBu, 37 ° C ye ısınmasına izin plaka okuyucu bölmesi içi boş, düz tabanlı 96 oyuklu beyaz levha,.
- Varlığında veya yokluğunda 0,9 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, ve 13.3 uM 5-amino-2,3-dihidro-1,4-phthalazinedione (luminol) ihtiva eden, D-PBS, pH 7.2 içinde teşvik karışımlarını hazırlamak Protokol adım 4.2 hazırlanan 0.67 uM endotoksin kaldırıldı HP-NAP.
- 5 mM glukoz ihtiva eden D-PBS, pH 7.2 içinde 7.1 6 10 ila 2 x hücre / mi, Protokol aşamasından hazırlanan insan nötrofil konsantrasyonu ayarlayın.
- 96 oyuklu ise plakanın her oyuğuna nötrofil süspansiyon 50 ul ekle.
- oyuk başına 5 saniyelik bir zaman aralığı de ihtiva eden nötrofiller Protokol aşama 7.2.2 hazırlanabilir teşvik karışımlarından 150 ul ekle.
- Bir plaka okuyucusu kullanılarak, üç saatlik bir süre boyunca göz başına 5 saniye için kemilüminesans emisyonunu ölçün.
8.Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile DNA Plazmidler Barınma HP-NAP Mutantlarının Şantiye doğrudan Mutagenezler tabanlı
Not: "sessiz" restriksiyon bölgeleri bölge-yönlendirmeli mütajenez (SDM) -assist yazılımı 28 ile bir mutagenez primeri tanıtıldı hariç, daha önce tarif edildiği gibi 27, PCR tabanlı bir site doğrudan mutajenez temel oluşturulmuştur.
- PCR reaksiyonu gerçekleştirmek.
- Nihai verir plazmid pET42a NAP-10 ng, Tablo 1 'de listelenen mutagenez primer çiftleri 1 uM, deoksinükleosid trifosfat (dNTP) ve iyonu giderilmiş su ihtiva eden bir PCR tüpüne yüksek güvenilirlikli PCR enzim karışımı 3 adet 200 uM ekleme 25 ul hacmi.
- 95 PCR döngüleri başlatın 10 dakika boyunca ° C şablon DNA'yı denatüre ve 1 dakika süre ile 95 ° C de 12 amplifikasyon döngüsü ile takip etmek, T 1 dakika süre ile -5 ° C Resim m, 6 dakika boyunca 72 o C.
- PCR döngüleri bitirmek1 dakika için Tm s -5 O ° C'de bir tavlama aşaması, ve 30 dakika süreyle 72 ° C'de bir uzatma aşamasından oluşuyordu.
- 2 saat boyunca 37 ° C'de Dpn I sınırlama enzimi 0.4 ul PCR ürünü 15 ul tedavi ve daha sonra agaroz jel elektroforezi ile Dpn I ile tedavi edilen PCR ürünü 2 ul analiz eder.
- Ekran mutantları.
- E. içine PCR ürünü 2 ul Transform 42 ° C'de 45 saniye boyunca ısı şoku ile coli DH5α kompetan hücreler.
- 50 ug / ml kanamisin içeren bir LB plakası üzerinde dönüştürülmüş hücrelerinin yayılmasını ve 16 saat boyunca 37 ° C'de inkübe plakası.
- imalatçının protokolüne göre, ticari bir alkalin liziz kiti kullanılarak bakteriyel kolonilerden plazmid DNA izole edin.
- üreticinin protokolüne göre istenen sessiz mutasyonların varlığını doğrulamak için XhoI kısıtlama enzimi ile protokolün adım 8.3.3 izole plazmid DNA tedavi edin.
- diziPlazmid DNA, üretici protokolüne göre HP NAP-mutantlarının kodlama dizilerinin düzeltme teyit etmek için T7 promoter primeri ile protokolün adım 8.3.4 tarafından doğrulanan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rekombinant HP-NAP negatif arınma deneysel işlemin şematik E. ifade Toplu modunda DEAE iyon değişim reçineleri kullanılarak E. coli, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bu saflaştırma tekniği konakçı hücre proteinleri ve / veya reçine HP-NAP dışındaki yabancı maddeler bağlanmasının dayanmaktadır. PH 8.0 'de, kendi doğal formunda HP NAP dışında hemen hemen hiçbir proteinler, bağlanmamış fraksiyon (Şekil 2A ve B) elde edilmiştir. Bağlı olmayan fraksiyon saflaştırıldı HP NAP-HP-NAP (Şekil 2C) karşı bir antikor ile bağışıklık kazandırılmış olan ve gümüş boyama (Şekil 2D) ile de doğrulandığı gibi saflığı daha yüksek% 97 idi. Yerel-PAGE (Şekil 2B) ve jel filtrasyon kromatografisi (Şekil 3A) ile analiz Buna ek olarak, saflaştırılmış rekombinant HP NAP-onun oligomerik şeklini muhafaza. Dairesel dikroizm spectroscopic analizi saflaştırılmış protein ağırlıklı α-heliksinden (Şekil 3B) oluşan olduğunu göstermiştir. Ayrıca, arıtılmış HP NAP-ROS (Şekil 3C) üretmek için, insan nötrofilleri stimüle etme yeteneğine sahipti. Bu durumda, bu yaklaşım ile saflaştırılmış rekombinant HP NAP biyolojik aktiviteye sahip olan doğal biçimindedir. Bundan başka, bu negatif mod toplu kromatografisi bir aşamada nokta mutasyonları rekombinant HP NAP saflaştırmak için kullanılabilir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, iki yeniden birleştirici HP NAP-Y101H ve HP-NAP E97GY101H mutantlar, H. HP NAP taklit eden pylori NCTC 11639 ve NCTC 11,637 suşları sırasıyla% 95 daha yüksek saflıkta, bu negatif mod toplu kromatografisi ile saflaştırılmıştır.
HP NAP saflaştırmak için DEAE reçineleri kullanılarak negatif mod toplu kromatografisi gerçekleştirmek için, saflaştırma için kullanılan tampon, pH değeri 8.0 olarak ayarlandı olmalıdırHP NAP çoğunluğu bağlanmamış fraksiyonunda olduğundan emin olmak için. Tampon pH değeri yüksek veya 8.0 (Şekil 5) daha düşük iken, HP-NAP daha az miktarda ilişkisiz kesirler mevcuttu. pH, 9.0'a 7.0 ila arttıkça bağlanmamış fraksiyon HP-NAP mevcut saflığı sadece biraz artmıştır bile tampon pH değeri ne zaman bağlı olmayan kısımların HP-NAP miktarı, en yüksek 8,0 (Şekil 5). reçinesine hücre lizatları çözünür protein miktarı, bu temizleme için diğer bir önemli faktördür. Burada oran E. kirleri emmek için reçinenin maksimum kapasiteye ulaşmak için mililitre reçine başına proteinlerin 1.5 mg E. coli (Şekil 6). Buna ek olarak, saflık ve negatif mod toplu kromatografisi ile elde HP NAP verimi büyük ölçüde eriyebilir bölümündeki HP NAP mevcut miktarının arttırılmasıyla arttırılabilirE. coli lizatları. Rekombinant HP NAP-neredeyse tamamen pH 9.0 (Şekil 7) hücre lizizi sonrasında çözünebilir bir fraksiyon halinde elde edildi. Olsa da E. rekombinant HP NAP çözünürlüğünün Hücreler 9.0'dan daha düşük bir pH'a sahip tampon maddesi içinde lize edilmiştir, hücreler 7.5 (Şekil 7) daha yüksek bir pH'a sahip tampon maddesi içinde lize edildiğinde coli lizatları belirgin bir artış olduğu, HP-NAP% 90'ından az çözünebilir bir protein olarak mevcuttu.
Şekil 1:. Toplu modunda DEAE Reçineler HP-NAP Olumsuz Arıtma şematik Anahat arıtma toplu bağlayıcı prosedür ile başlar. bakteriyel lizatlardan alınan HP NAP içeren çözünür protein fraksiyonu DEAE reçinesine pH 8.0 Tris-tampon maddesi ile önceden dengelenmiş ilave edilir. proteinler / reçine Bulamaçlar daha sonra yumuşak bir MIXI 1 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edilirng. İnkübasyon sırasında, konakçı hücre proteinleri reçineye bağlanır. Ilişkisiz fraksiyon HP-NAP mevcut santrifüj veya yerçekimi akışı tarafından işletilen bir sütundan flow-through fraksiyon sonra süpernatant toplayarak ya elde edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. DEAE iyon-değişim reçineleri ile Negatif Mod Toplu Kromatografisi HP NAP-temizlemesi örnek için sonuçlar tam hücre lisatı (W) ve E. çözünür protein fraksiyonu (G) HP NAP ve DEAE iyon değişimli kromatografi HP-NAP ihtiva bağlanmamış bölümünü (U) ifade eden E. coli BL21 (DE3), SDS-PAGE (A), ana-PAGE (B) ve western blotting (C) ile analiz edilmiştir. ilişkisiz frac1 ug ila 10 ug arasında değişen proteinlerin belirtilen miktarı ile, o anda bir gümüşle boyanmış SDS-PAGE jeli (D) üzerinde analiz edilmiştir. kDa'daki moleküler kütleler (M) lekeli jeller ve leke solunda gösterilmiştir. (Referans 24 den uyarlanmıştır) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Yapısal ve E. itibaren Arıtılmış Rekombinant HP NAP Fonksiyonel Karakterizasyonu Negatif Mod Toplu Kromatografisi coli (A). UV emme profili bir jel filtrasyon kolonundan elüte HP NAP için kaydedilmiştir. Protein belirteçleri molekül kütleleri kromatogramda belirtilmiştir. (B) uzak UV dairesel dikroizm spectHP-NAP rom 195 260 nm dalga boyu aralığında kaydedildi. (C) İnsan nötrofilleri (1 x 10 5 hücre) 37 ° C'de bir negatif kontrol olarak, 0.5 uM, HP-NAP D-PBS, pH 7.2 ile muamele edilmiştir. nötrofiller üretilen ROS içeriği luminol bağımlı kemikuminensans kullanılarak sürekli olarak ölçüldü. Veri üç nüsha olarak bir denemenin ortalama ± standart sapma olarak temsil edildi. (Referans 24 den uyarlanmıştır) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: E. rekombinant HP NAP mutantların pürifikasyonu Negatif Mod Toplu Kromatografisi coli. E. çözünür protein fraksiyonları E. coli BL21 (DE3), iki yeniden birleştirici HP NAP-Y101H ve HP-NAP E97GY101H mutantları eksprese eden ve vahşi tip, HP-NAP DEAE reçineleri ile negatif mod kromatografisi ile saflaştırılmıştır. Ilişkisiz fraksiyonlar SDS-PAGE ile analiz edilmiştir. KDa Moleküler kitleler (M) lekeli jellerin solda belirtilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: E. rekombinant HP NAP temizlemesi üzerine Tampon pH Etkisi Negatif Mod Toplu Kromatografisi coli. E. çözünebilir fraksiyon pH 9.0'da lize HP NAP ifade E. coli BL21 (DE3) 7.0 ila 9.0 arasında değişen belirtilen pH ve 0.3 mg / ml'lik bir protein konsantrasyonuna ayarlanmıştır. bu düzeltilmişYük olarak gösterilen kısımlar, daha sonra 4 ° C de negatif mod toplu kromatografisi ile yeniden birleştirici HP NAP saflaştırmak için DEAE reçine üzerine yüklendi. Bağlanmamış, yıkama ve elüsyon fraksiyonları, SDS-PAGE ile analiz edildi. kDa'daki moleküler kütleler (M) lekeli jellerin solda gösterilmiştir. (Referans 24 den uyarlanmıştır) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: E. ifade Arındırıcı rekombinant HP NAP için DEAE Reçineler üzerine Loaded Proteinlerin miktarı Etkisi E. coli., E. çözünür protein fraksiyonları E. coli BL21 (DE3) ifade HP NAP göre DEAE reçine üzerine yüklendi Biraraya getiren arındırmak için reçine mililitrede mg proteinlerin belirtilen orannant HP NAP pH 8.0'da negatif mod toplu kromatografisi ile. Çözünür proteinler, yük (L), bağlanmamış fraksiyon (A), yıkama fraksiyonu (B) ve SDS-PAGE ile analiz edildi elüsyon fraksiyonu (C) göstermektedir. kDa'daki moleküler kütleler (M) lekeli jellerin solda gösterilmiştir. (Referans 24 Kimden) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7: E. HP-NAP Çözünürlüğüne üzerine pH etkisi E. coli Lisatlar. (A), E. E. coli BL21 (DE3) ifade HP NAP 7.0 ila 9.5 arasında değişen bir pH değerinde gösterilen buz soğukluğunda Tris-HCl tamponu içinde süspansiyon haline getirilmiştir. Hücreler parçalanmıştır ve sonra bütün hücre lizatları (W) t santrifüjlendiO çözülebilen fraksiyonlar, (S) ve çözünemeyen peletler (I) 'in ayrı. proteinler SDS-PAGE ile analiz edildi. kDa'daki moleküler kütleler (M) lekeli jellerin solda gösterilmiştir. (B) her pH değerinde bütün hücre lizatı rekombinant HP UEP çözünürlük yüzdesi B (bütün hücre lizatı söz konusu bölünmüş çözünebilir fraksiyon (G) için SDS jelleri HP NAP-bant yoğunluğuna hesaplandı ). Veriler, en az iki deneyin ortalama ± standart sapma olarak temsil edildi. (Referans 24 Kimden) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1: Muta oluşuma yönelik kullanılan primerler. Cl lütfenBu tablonun büyük halini görmek için buraya ick.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan DEAE anyon-değişim reçineleri ile negatif mod toplu kromatografisi E coli içinde aşırı eksprese rekombinant HP NAP saflaştırılması için uygundur. Hücre lizizi ve saflaştırma aşamasında kullanılan tamponların pH değerleri E. HP-NAP çözünürlüğünü sağlamak için çok önemlidir E. coli lizatları ve sırasıyla konak hücre yabancı maddelerden rekombinant HP NAP verimli ayrılması. Bakteri hücreleri, pH 9.0 lize olmalıdır ve negatif saflaştırma yüksek bir verimle ve yüksek saflıkta, HP-hav elde etmek üzere pH 8.0 yapılmalıdır. HP-NAP tipik kurtarma% 90, ve tipik saflık% 95 24 olduğunu. HP NAP ilişkisiz fraksiyonunda mevcut olduğu için, bir reçine az ama yeterli miktarda yabancı maddeleri emmek için maksimal kapasitenin elde edilmesi için kullanılır. Bizim durumumuzda, maksimum yükleme kapasitesi E. çözünür proteinler 1.5 mg mililitre reçine başına E. coli lizatları.
yazarlaraded protokol 50 mi E. rekombinant HP NAP saflaştırılması için tasarlanmış E. coli kültürü. HP-NAP verimi yaklaşık 15 mg'dır. saflaştırma işlemi ya aşağı ölçekli veya ölçekli yukarı buna göre yapılabilir. Örneğin, iki yeniden birleştirici HP NAP-Y101H ve HP-NAP E97GY101H mutantları 1 ml E. saflaştırılmıştır Bu negatif mod toplu kromatografisi kullanılarak E. coli kültürü.% 95 den daha yüksek bir saflığa sahip iki HP NAP mutantlan bağlanmamış bölümünü (Şekil 4) toplanması ile elde edildi. Bu negatif mod toplu kromatografisi da 860 mL E. rekombinant HP NAP saflaştırmak için uygulanmıştır E. coli kültürü. DEAE negatif mod toplu kromatografisi kullanılarak aşamasının kazanımı% 90 daha yüksek saflıkla% 97 yükselmiştir.
HP-NAP (B. subtilis) de başarıyla Bu DEAE negatif mod toplu kromatografisi ile saflaştırılmıştır edilmiş Bacillus subtilis olarak ifadebir adım 26'da. Bizim B'de subtilis ifade sistemi, HP-NAP ifadesi seviyesi düşüktür. HP-NAP sadece bakteriyel lizatları toplam çözünür proteinlerin yaklaşık% 5'ini. arıtma için hedeflenen HP NAP-etkin bir şekilde hemen hemen tüm endojen çıkarmak için küçük bir miktar,% 90'dan daha fazla reçine üzerine yüklendi hücre lizatlarından protein miktarının oranını azaltarak elde edilebilir saflıkta HP NAP mevcut olsa bile B. proteinler subtilis 26. Böylece, bu yöntem, aynı zamanda, diğer bakteri konukçularında eksprese edilen rekombinant HP NAP saflaştırmak için uygulanabilir.
Çeşitli yöntemler doğal yapısında 14-16 rekombinant HP NAP saflaştırılması için rapor edilmiştir. Bununla birlikte, ek bir jel filtrasyon kromatografisi adımı, yüksek saflıkta, HP-hav elde etmek üzere gereklidir. Bu negatif kromatografik saflaştırma verimli tek adımda yüksek saflıkta işlevsel rekombinant HP-NAP verebilir. Additi içindeüzerinde, deniz suyu arıtma adımı sebebiyle ilişkisiz fraksiyon düşük tuz konsantrasyonuna gerekli değildir. kesikli tarzda saflaştırma da sütun duyulan ihtiyaç ortadan kalkar. Bu nedenle, DEAE reçinesi kullanılarak, bu negatif mod toplu kromatografisi, yüksek verim ve saflıkta doğal biçiminde, HP-HAP saflaştırmak için basit ve etkili bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem ile arıtılmış, HP-NAP daha H. aşılar, yeni ilaçların ve teşhis geliştirilmesi için yararlanılabilir pylori hastalıklar ya da diğer yeni tedavi uygulamaları için lı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| pET42a-NAP | N/A | N/A | prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317 |
| E. coli BL21 (DE3) | Thermo Fisher Scientific Inc | C6000-03 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 |
| Kanamycin | Amresco | 25389-94-0 | http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | MD Biomedical Inc | 101-367-93-1 | http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20 |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 10837091001 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW |
| N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) | Sigma-Aldrich | T7254 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW |
| N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) | Sigma-Aldrich | T4376 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW |
| Protein standard (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | P5619 | a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW |
| DEAE–Sephadex A-25 chloride form | Sigma-Aldrich | A25120 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW |
| Spectrum/Por dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132720 | with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720; |
| Acrodisc® units with Mustang® E membrane | Pall | MSTG25E3 | for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992 |
| mouse monoclonal antibody MAb 16F4 | N/A | N/A | raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585 |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare Life Sciences | 28989335 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335 |
| PlusOne silver staining kit, protein | GE Healthcare Life Sciences | 17-1150-01 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002 |
| Flat bottom 96-well white plate | Thermo Fisher Scientific Inc | 236108 | http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW |
| Expand long template PCR system | Sigma-Aldrich | 11681834001 | source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW |
| Dpn I | New England Biolabs | R0176S | https://www.neb.com/products/r0176-dpni |
| Xho I | New England Biolabs | R0146S | https://www.neb.com/products/r0146-xhoi |
| E. coli DH5α | Thermo Fisher Scientific Inc | 18265-017 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017 |
| Name | Company | Product Number | Comments |
| Equipment | |||
| U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer | Hitachi | N/A | out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers |
| EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer | Avestin Inc | C315320 | http://www.avestin.com/English/c3page.html |
| Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge | Hitachi Koki Co | 90106401 | for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 18-1900-26 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026 |
| Aviv model 62ADS CD spectrophotometer | Aviv Biomedical | N/A | out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php |
| LAS-3000 imaging system | Fujifilm | N/A | discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810 |
| Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter | Perkin-Elmer | 1420-018 | for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. Brunette, G. W., et al. , Oxford University Press. (2015).
- Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease. Ulcers. 2011, 340157 (2011).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection--the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Evans, D. J. Jr., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).
- Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications. World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).
- de Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe? Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).
- Malfertheiner, P., et al. Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study. Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).
- Del Prete,, G,, et al. Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).
- Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies. World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).
- Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer. World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).
- Song, H., et al. A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology. Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).
- Kottakis, F., et al. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection--novel approaches against Helicobacter pylori inflammation. FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).
- Thoreson, A. C., et al. Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects. J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).
- Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).
- Iyer, G., et al. Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles. J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).
- Wongchuphan, R., et al. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).
- Lu, X., Zhao, D., Su, Z. Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).
- Brooks, S. P., Storey, K. B. Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).
- Gewirtz, A. T., et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).
- Levison, P. R. Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).
- Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives. Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).
- Yang, Y. C., et al. High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli. BMC biotechnol. 15 (23), (2015).
- Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).
- Shih, K. S., et al. One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis. PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC biotechnol. 8 (91), (2008).
- Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites. BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).
