Abstract
Hjertesvigt og hjertearytmi er de førende årsager til dødelighed og sygelighed i hele verden. Men stadig den mekanisme af patogenese og myokardie funktionsfejl i det syge hjerte, at være fuldt afklaret. Seneste overbevisende dokumentation viser, at ændringer i myofilament Ca2 + følsomhed påvirker intracellulær Ca2 + homeostase og ionkanal-aktiviteter i hjertemyocytter, de væsentlige mekanismer ansvarlige for hjertets handling potentiale og sammentrækning i raske og syge hjerter. Faktisk aktiviteter af ionkanaler og transportere underliggende hjerte- aktionspotentialer (f.eks Na +, Ca 2+ og K + kanaler og Na + -CA 2+ veksler) og intracellulære Ca 2+ håndtering proteiner (f.eks., Ryanodine receptorer og Ca 2+ -ATPase i reticulum (SERCA2a) eller phospholamban og dets phosphorylering) konventionelt måles til vurspiste de fundamentale mekanismer i hjerte-excitation-kontraktion (EF) kobling. Begge elektriske aktiviteter i membranen og intracellulære Ca 2+ ændringer er trigger signaler af EF-kobling, mens myofilament er den funktionelle enhed af sammentrækning og afslapning, og myofilament Ca2 + følsomhed er afgørende for gennemførelsen af myofibrillære ydeevne. Ikke desto mindre, få studier indarbejde myofilament Ca2 + følsomhed til den funktionelle analyse af myokardiet, medmindre det er i fokus for undersøgelsen. Her beskriver vi en protokol, der måler sarkomer afkortning / re-forlængelse og intracellulær Ca2 + niveau ved hjælp Fura-2 AM (ratiometrisk påvisning) og vurderingen af ændringer af myofilament Ca2 + følsomhed i hjertemyocytter fra rottehjerter. Hovedformålet er at understrege, at myofilament bør tages Ca2 + følsomhed i betragtning i EF-kobling til mekanistisk analyse. Omfattende undersøgelse af ipå kanaler, ion transportører, intracellulær Ca2 + håndtering og myofilament Ca2 + følsomhed, der ligger til grund for myocyt kontraktilitet hos raske og syge hjerter vil give værdifulde oplysninger til at designe mere effektive strategier for translationel og terapeutisk værdi.
Introduction
Cardiac excitation-kontraktion (EF) kobling er den grundlæggende ordning til analyse mekaniske egenskaber af myocardium, dvs, den kontraktile funktion af hjertet 1,2. EF-kobling er initieret af membran depolarisering sekundært til aktiviteter sarcolemmal ionkanaler (f.eks spændingen-gatede Na + kanal, som kan måles via patch-clamp-teknikker). Efterfølgende aktivering af spændingsstyrede L-typen Ca2 + kanaler (LTCCs) og Ca2 + tilstrømning via LTCCs udløse størstedelen af Ca 2+ frigivelse gennem ryanodine receptorer (RyRs), forøgelse af cytosoliske Ca2 + -koncentration fra det nanomolære (nM ) til mikromolær (uM) niveau. En sådan forøgelse i cytosolisk Ca2 + fremmer Ca2 + binding til troponin C (TNC) i tynde filamenter og fremkalder konformationelle ændringer af filamentet komplekset for at lette actin-myosin interaktion og opnår myocardial sammentrækning 3. Omvendt er den cytosoliske Ca2 + er re-uptaken tilbage i reticulum (SR) gennem Ca2 + -ATPase i SR (SERCA2a) eller ekstruderes ud af myocyt via Na + / Ca2 + veksler og plasmalemmal Ca2 + ATPase 1,2. Følgelig faldet i cytosoliske Ca2 + ansporer konformationsændringer af tynde filamenter tilbage til den oprindelige tilstand, hvilket resulterer i dissociation af actin-myosin og myocyt afslapning 1-3. I dette skema er aktiviteten af SERCA2a almindelighed for at bestemme hastigheden af myocardial afslapning fordi den udgør 70 - 90% af cytosolisk Ca2 + fjernelse i de fleste mammale hjerteceller 1. Som sådan, unormal Ca 2+ håndtering af LTCC, RyR og SERCA2a mv har været betragtet de primære mekanismer for svækket kontraktilitet og afslapning i det syge hjerte 1-4.
+, der fungerer som budbringer i EF-kobling udgør omkring 1% af den samlede intracellulær Ca2 + og størstedelen af Ca 2+ er bundet til intracellulære Ca 2+ buffere 5,6. Dette skyldes det faktum, at forskellige Ca2 + buffere er rigelige i hjertemyocytter, f.eks membranphospholipider ATP, phosphocreatin, calmodulin, parvalbumin, myofibrillære TNC, myosin, SERCA2a, og calsequestrin i SR. 5,6,7. Blandt dem, SERCA2a og TNC er de fremherskende Ca2 + buffere 5,6,7. Endvidere Ca2 + binding til dens buffere er en dynamisk proces under spjæt (f.eks 30-50% af Ca2 + bindes til TNC og dissociere fra det under Ca2 + transienter 7) og ændringen i Ca2 + binding forårsage yderligere "frigive" frie Ca2 + til cytosolen, resulterer i ændringer af intracellulær Ca2 + koncentration. Derfor forstyrrelse af intracellulære Ca2 + niveau inducerer unormale myofilament bevægelser, som er forløberne for kontraktile dysfunktion og arytmier 8,9. Mange faktorer (både fysiologiske og patologiske) kan være kilderne til post-transcriptionale modifikationer af myofilament proteiner, som påvirker myofilament Ca2 + buffering og myofilament Ca2 + følsomhed 8-10. For nylig blev det rapporteret, at mutationer i myofilament proteiner øger Ca2 + bindingsaffinitet og intracellulær Ca2 + håndtering, udløser pause-afhængig potensering af Ca2 + transienter, unormal Ca2 + frigivelse, og arytmier 8. I overensstemmelse med dette koncept har vi også vist, at myofilament Ca2 + desensibilisering i hypertensive rottehjerter sekundært til opreguleringen af neuronal nitrogenoxidsyntase er forbundet med forhøjet diastolisk og systolisk Ca2 + niveauer11, hvilket igen øger sårbarheden af LTCC til Ca 2 + -afhængig inaktivering 12. Derfor myofilament Ca2 + følsomhed er en "aktiv" regulator af intracellulær Ca2 + homøostase og myocyt kontraktile funktion. Det er blevet nødvendigt at analysere samspillet mellem myofilament og Ca 2+ håndtering proteiner til grundig undersøgelse af myocyt EF kobling og hjertefunktion.
Her beskriver vi en protokol, der vurderer ændringerne i myofilament Ca2 + følsomhed i isolerede hjertemyocytter. Omfattende analyse af intracellulær Ca2 + profil, vil myofilament Ca2 + følsomhed og sammentrækning grave nye mekanismer underliggende myokardiale mekanik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen er i overensstemmelse med den vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr, der er offentliggjort af FN National Institutes of Health (NIH publikation nr 85-23, revideret 1996). Den blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) i Seoul National University (IACUC godkendelse nr .: SNU-101.213 til 1).
1. Buffer Forberedelse (tabel Materialer og udstyr)
- Forbered 300 ml frisk isolation opløsning på dagen for eksperimentet (i mM: NaCl, 135; KCl, 5,4; MgCl2, 3,5; glucose, 5; HEPES, 5; Na 2 HPO 4, 0,4, taurin, 20; pH 7,4 med NaOH).
- Fremstilling af 100 ml frisk storage løsning på dagen for eksperimentet (i mM: NaCl 120; KCI 5,4; MgSO4 5; CaCl2 0,2; natrium-pyruvat 5, glucose 5,5; taurin 20; HEPES 10; mannitol 29; pH 7,4 med NaOH).
- Forbered 1L af perfusion opløsning (i mM: NaCl, 141,4, KCI, 4; NaH 2 PO 4, 0,33; MGCl 2, 1; HEPES, 10; glucose, 5,5; CaCl2, 1,8; mannitol, 14,5; pH 7,4 med NaOH).
- Forbered 30 ml collagenase opløsning 1 ved tilsætning af collagenase (1 mg / ml), protease (0,1 mg / ml), okseserumalbumin (BSA, 1.67mg / ml), og Ca2 + (0,05 mM) til 25 ml isolation løsning.
- Forbered 20 ml collagenase opløsning 2 ved tilsætning collagenase (1 mg / ml), BSA (1,67 mg / ml), og Ca2 + (0,05 mM) til 16,7 ml isolation opløsning.
- Forbered 40 ml BSA-opløsning ved at tilsætte 0,4 g BSA til 40 ml isolation opløsning. Separat 10 ml og 30 ml i to bægre. Tilføj Ca2 + til 30 ml BSA-opløsning, således at den endelige Ca2 + -koncentration i BSA-opløsningen er 1 mM.
2. Forberedelse af Isolering af venstre ventrikel (LV) Myocytter
- Overfør 8-12 uger gamle, Sprague-Dawley (SD) rotter i rene transportløsninger bure fra dyret facilitet til forberedelse og isolation værelse.
- Hspise to vandbade til 37 ° C.
Bemærk: Brug én vandbad i vandet - med kappe reservoiret og perfusionen rør af Langendorff perfusion system. Bruge den anden vandbad for at agitere myocardiale væv kufferter for at adskille enkelt myocytter. - Tilsæt 5 ml og 3,3 ml BSA opløsning (uden Ca2 +) til 25 ml collagenaseopløsningen 1 og 16,7 ml collagenase løsning 2 for at gøre op for lydstyrken til 30 ml og 20 ml.
- Tilføj isolation opløsning (100 ml) og collagenase opløsning 1 (30 ml) til kolonne 1 (Kol 1) og kolonne 2 (Kol 2) i Langendorff perfusionssystem henholdsvis (figur 1A).
- Ilte isolation opløsning og collagenase opløsning 1 i spalte 1 og Col.2 via oxygen forbindelsesrør i Langendorff-perfusion (figur 1A). Tilsvarende oxygenatorer collagenaseopløsning 2 og BSA-opløsning i rystevandbad med 100% O2 viaoxygen forbindelsesrør.
3. Isolering af LV Myocytter
- Bedøver en SD rotte via intraperitoneal injektion af pentobarbital-natrium (30 mg / kg), og bekræft bedøvelsesmidlet status ved tå klemme og manglende tilbagetrækning refleksion.
- Flyt rotte til en dissektion bakke. I liggende stilling, fastgøre fire ben til siderne af kroppen med tape.
- Påfør thorax mid-aksiale indsnit med kirurgiske saks til at åbne kisten, sikrer ikke at beskadige hjertet. Brug et andet par rene saks til at dissekere hjertet fra de forbindende skibe (f.eks overlegen og inferior vena cava, pulmonale fartøjer, og aorta) og perikardiel membran 13.
- Efterlade en del af aorta af en tilstrækkelig længde (5 - 8 mm), klemme aorta med fin pincet og hurtigt montere kanylen af Langendorff perfusionssystemet inden for 1 min (figur 1A). Bind suturtråd 4/0 stramt over aorta.
- Afmonter fordøjede hjerte ved at skære aorta og overføre det ved at holde aorta med pincet i kolben indeholdende frisk isolation løsning (figur 1Bi). Anvendes der fine sakse og tænger til at skære de fleste af LV frie væg (herunder septum) i mindre stykker (~ 22 mm, fig 1Bii).
- Overfør stykkerne i en kolbe indeholdende foropvarmet og oxygeneret frisk collagenaseopløsning 2 (figur 1Biii). Ryst i 10 min. Hold levere ilt til myocyt-holdige collagenaseopløsningen 2.
- Flyt myocytter - suspension til et 10 ml centrifugerør hjælp pipetter med en suge pære og tilføje Ca 2+ - indeholdende BSA opløsning (1: 1 efter volumen). Centrifugeres ved 30 g i 2 min og kassér supernatanten. Re-suspendere myocyte pellet i 5 ml BSA løsning. Centrifuger og kassér supernatanten.
- Dispergere myocyt pellets og holde myocytter i 10 ml præ-oxygeneret storage opløsning ved stuetemperatur (figur 1Biv-vi).
- Gentag fremgangsmåden (trin 3.7 - 3.9) med den resterende LV væv i kolben.
Bemærk: Hold gentage proceduren (trin 3.7 - 3.9) igen, indtil det meste af LV væv forsvinder at opnå et godt udbytte af myocytter. - Hold myocytter i lagerløsning til 6-8 timer ved stuetemperatur indtil udgangen af eksperimenter.
4. samtidige målinger af intracellulær Ca2 + transienter og myocyt Sammentrækning
- Load LV myocytter med acetoxymethylester Fura-2 AM (2 uM).
Bemærk: Udfør alle lastning procedurer og eksperimenter med indlæst myocytter i en mørk rør (figur 1Bvii).- Centrifuge den myocytter suspensionen (1 ml) ved 2.000 xg i 10 sek. Supernatanten fjernes, og re-suspendere myocyte pellet i 1 ml Tyrode løsning med en lav Ca2 + koncentration (250 uM, Tabel Materialer og udstyr).
- Tilføj Fura-02:00 og poloxamer 407 (2 pi), forsigtigt sprede myocyt suspension, og holde blandingen ved RT (20-24 ° C) i 15 min (Figur 1Bvii).
- Centrifuger blandingen i 5 sek, kasseres supernatanten og sprede myocyte pellet i 1 ml perfusion opløsning indeholdende 500 uM Ca2 +. Efter 10 min, centrifugeres blandingen i 5 sek og kassér supernatanten.
- Tilføj frisk perfusion opløsning (500 uM Ca2 +, 1 ml) og holde Fura-02:00 - loaded myocyt pellet i denne opløsning i optagelser.
- Måling af LV myocyt sammentrækning og intracellulær Ca2 +
- Før optagelse, fylde perfusion rør, der løber gennem envandkappe med Tyrode-opløsning, der er forvarmet til 36 ° C.
- Placer et par dråber af den Fura 02:00 - indlæst LV myocyt suspensions kammer et omvendt fluorescensmikroskop 5 - 8 min. perfundere langsomt Tyrode-opløsning (2,2 ml / min).
- Tryk på knappen "start" på frontpanelet af den digitale stimulator at starte felt stimulation (2 Hz).
Bemærk: Udgangsspændingen (10 V, 5 ms varighed) påføres på myocytterne i kammeret gennem platintråde placeret på hver side af kammeret.- Vælg myocytter at kontrakt stabilt (ikke dem viser hyper- eller hypo-sammentrækning) til optagelse.
- Juster myocytter valg i den vandrette position af videobaseret sarkomer detection system og justere fokus af mikroskopet at opnå optimale billeder af sarkomerer. Placer lilla rektangulær kasse på det område, hvor klare sarkomerer er klart overholdes, indtil den gennemsnitligeaf sarkomeret længder (rød peak) viser en ental skarp top (figur 2A, nederste billede).
- Registrere ændringerne af sarkomer længde som respons på feltstimulering (figur 2A og B).
Bemærk: Brug indlæste myocytter inden for 1 - 2 timer. - Juster åbningen i kameraet, så feltet i videobaseret sarkomer påvisningssystem er størrelsen af myocyt (figur 2A). Stimulere myocytter med excitation ved 360 nm / 380 nm og emission ved 510 nm (erhvervelse frekvens 1000 Hz). Optag sarkomer afkortning og fura2 AM-forholdet med felt stimulation (figur 2B).
5. Vurdering af Myofilament Ca 2+ følsomhed
- Gennemsnit sarkomeret længder og Ca 2 + transienter ved steady-state (10 - 20 spor) og plot fase-planet løkke af Fura-2-forhold vs. sarkomeret længde af samme myocyt (begge målt værdis og delta ændringer; Figur 2C).
- I hvert plot, definerer Fura -2 ratio på 50% afslapning (EF 50, Figur 2C). Undersøg både løkken og EF 50 af hver intervention.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LV myocytter isoleres fra normale og hypertensive rottehjerter. Stavformede myocytter med klare striber (som repræsenterer sarkomerer) og stabile sammentrækninger i respons på marken stimulering anses for at være de optimale myocytter og udvælges til optagelser (figur 2A). I den i F igur 2A eksempel en Fura 02:00 -loaded LV myocyt står vandret, og åbningen af kameraet er indstillet således, at myocyt optager det meste af optagelsen felt og minimal baggrund område er inkluderet. I optagelsen felt, justere dimensionerne af det violette felt ved at klikke og trække denne boks på computerskærmen (gennem optagelsesprogrammet). Når den gennemsnitlige sarkomeret længde viser en skarp rød top, starter optagelsen (figur 2A, nederste billede).
Både sarkomer længde og intracellulær Ca2 + transie NTS (Fura-2-forhold) registreres samtidigt fra samme myocytter (figur 3A). De gennemsnitlige spor af sarkomer længde og Ca2 + transienter er vist i figur 3B. Individuelt, diastoliske / systoliske sarkomeret længder, tid til at toppe (PT), og sarkomer afkortning måles til at undersøge amplituden og dynamik myocyt kontraktilitet. Tid til 50% afslapning (TR 50) er analyseret for at vurdere lempelse af myocyt. Tilsvarende diastoliske og systoliske Fura-2-forhold (Ca 2 + transienter), tid til at toppe (PT) af Ca 2 + transienter og tidskonstant Ca 2 + forbigående henfald (tau) analyseres for at vurdere myocyt sammentrækning og afslapning (tabel 1). I dette eksempel er amplituderne af Ca2 + transienter moderat forøget i LV myocytter fra en hypertensiv rotte og sammentrækning er moderat reduceret (figur 3B og tabel 1).
indhold "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Desuden forholdet mellem Fura - er to forhold og sarkomer længde (angiver myofilament Ca2 + følsomhed LV myocytter) plottet i både fingeret og hypertensive rotter ( . figur 3C) The Fura 2 - sarkomeret længde bane under lempelse fase af myocyt definerer en kvasi-ligevægt i cytosolen Ca 2+, myofilament Ca 2+ bindende, og sarkomer længde 14, og derfor er afslapning fase sammenlignet mellem de to grupper. den højrerettede forskydning af forløb i myocytter fra hypertensive gruppe angiver en reduceret myofilament respons på Ca2 + (figur 3C). Følgelig intracellulær Ca2 + koncentration, der kræves til halv afslapning (EC50) øges (figur 3C) med henvisning til myofilament Ca2 + -desensitization ved hypertension.Figur 1. Procedurer til isolering LV myocytter fra rotte hjerte. (A) Langendorff perfusionssystem anvendes til at perfundere isolation opløsning ind i hjertet kanyleret via aorta (indsat, forstørret billede af den monterede hjerte på perfusionssystemet) (B) i - iii:. Hjertet efter fordøjelse med collagenase opløsning 1 og dissekeret LV væv i et fad og flaske (B) iv - vi:.. myocyt suspension efter tilsætning af collagenase løsning 2, myocyt pellet efter centrifugering, og re-suspenderet myocyt pellet i lagerløsning (B) vii: Incubation, inkuberes LV myocytter i Fura 02:00 - indeholder isolation opløsning (2 uM Fura 02:00, 250 uM Ca2 + og med 2 pi poloxamer 407); udvaskning, vask LV myocytter med isolation opløsning med 500 uM Ca 2+; opbevaring, holder Fura-02:00 - indlæst LV myocytter ifrisk isolation opløsning indeholdende 500 uM Ca2 +. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Måling af sarkomeret afkortning og Fura-2-forhold (betegnende for det intracellulære Ca2 + niveau). (A) Et diagram over sarkomeret, et billede af en Fura-2 -loaded LV myocyt og gennemsnit sarkomeret længde (den røde peak) vises på computeren. I det nedre panel, den sorte linje er gennemsnittet af hver vandret pixellinje inden den lilla område af interesse. Den blå linje er de samme data nulstilles ved hver ende. Den røde linje er den hurtige Fourier transformation (FFT) kraftspektret, som repræsenterer antallet af signaler FFT har beregnet. En skarp peak: en ren sarkomeret optagelse. (B) Samtidige optagelser af sarkomer længde og Fura -2-forhold i respons på feltstimulering (2 Hz). (C) Phase-plan afbildning af Fura 2-forhold vs. sarkomer længde af samme LV myocyt (bemærk, at både den faktiske længde / Fura 2-forhold og delta ændringer i disse parametre analyseres). EF 50 (Fura 2 ratio på 50% afslapning, cirkel angivet med pil) er den kvalitativ sammenligning af myofilament Ca2 + følsomhed mellem grupperne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Repræsentative resultater af analysen af LV myocyt sammentrækning i fingeret og hypertensive rotter. (A) Rå spor af sarkomer shortening og Fura - 2 forholdet måling i LV myocytter fra fingeret og hypertensive rotter (B) Gennemsnitlige spor af sarkomer længde og Fura -. 2 signaler. Parametre analyseret i de midlede spor er vist i tabel 1. (C) Phase-plane afbildninger af Fura - 2-forhold vs. sarkomer længde (både den faktiske længde og Fura - 2-forhold og delta ændringer i disse parametre) i de to grupper . Bane sløjfen er forskudt til højre og EC50 tendens til at være højere i hypertension, hvilket tyder myofilament Ca2 + desensibilisering. PT, tid til at toppe (sek); Tau, tidskonstant Ca2 + forbigående henfald (sec) (opnået ved at tilpasse tilbagegangen fase af Fura - 2-forhold med en eksponentiel funktion) .TR 50: tid til 50% afslapning (sek). 
Klik her for at se en større versionaf dette tal.
| Parametre | Falsk | Forhøjet blodtryk | |
| Intracellulær Ca2 + | Diastolisk Ca2 + | 1,189 | 1,124 |
| Systolisk Ca2 + | 1,71 | 1,691 | |
| Amplitude (Δ-forhold) | 0,521 | 0,567 | |
| Tid til top (PT, s) | 0.021 | 0,031 | |
| Tau (r) | 0,079 | 0,076 | |
| sarkomer | Diastolisk | 1,758 | 1,78 |
| sarkomer længde (um) | |||
| sarkomer | 0,122 | 0,115 | |
| afkortning (16; længde, mm) | |||
| Tid til top (PT, s) | 0,064 | 0,055 | |
| Tid til 50% | 0,032 | 0.03 | |
| Afslapning (TR 50, s) | |||
| EC50 | [Ca2 +] i (Fura-2-forhold) til 50% sarkomer relengthening | 0,2382 | 0,3224 |
Tabel 1. Analyse af Fura - 2-forhold (intracellulær Ca2 +) og sarkomer længde målinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi de protokoller, til at vurdere ændringer i myofilament Ca2 + følsomhed i enkelt isoleret hjertemyocyt og understrege vigtigheden af at måle denne parameter sammen elektrofysiologiske egenskaber, intracellulære Ca 2 + transienter, og myofilament dynamik. Dette skyldes, at optagelser af en eller to af de parametre, der ikke kan explicate mekanismerne bag hjerte- sammentrækning og afslapning. I modsætning til konventionelle metoder, der måler myocyt sammentrækning og intracellulær Ca2 + profil individuelt 1, den foreliggende fremgangsmåde undersøger begge parametre samtidigt i de samme hjertemyocytter.
En række metoder anvendes generelt til at vurdere myofilament Ca2 + følsomhed muskler eller myocytter 15,16,17, fx, undersøgelse af samspillet mellem eksogen Ca 2+ og sarkomeret / celle længde / spænding i flået myocytter(Behandlet med detergenter, såsom saponin eller β-esin at permeabilisere membranen). Længder måles med foto-diode og laserstrålen diffraktion teknikker, og spændinger med krafttransducere eller kulfibre). Disse teknikker er meget udbredt i muskel studier fordi de muliggør kvantitative vurderinger af myofilament Ca2 + følsomhed. Men endogene ionkanal aktiviteter i plasmamembranen og intracellulær Ca2 + håndtering, der er forpligtet til at indlede mekanikken i myofilament, er forsømt i disse teknikker. Desuden musklen strimler eller myocytter, der undersøges, er forstrakt i en vis diastolisk længde, og under disse betingelser, kan den oprindelige sarkomeret længde afvige fra den faktiske diastoliske længde af myocytter (især ved sygdomstilstande og med interventioner). Dette understreger den fordel, at den aktuelle måling, hvor cellulære organeller forblive relativt uanfægtet derved muliggør omfattende stillingtagen til,ation af myocyt kontraktile funktion.
Forståeligt, kvalitet myocytter (Ca 2+ -tolerating) og den optimale læsning af Fura - 2 am er to centrale elementer for en vellykket vurdering af myofilament Ca2 + følsomhed. Derfor er flere ændringer anvendes til protokollen for at opnå levedygtige stavformede myocytter (60-80% af de samlede celler, som tidligere 18,19,20 beskrevet). Først foretages en lav dosis af Ca2 + sat til opløsningerne under omsætningen processer (f.eks, Ca2 + koncentrationen er 50 um i collagenase løsninger og 200 pM i opbevaringsopløsningen). For det andet, i løbet af fordøjelsesprocessen, er BSA tilsat til collagenase løsninger til at forbedre membranens stabilitet. Tredje, de fleste af opløsningerne iltet under isolering, som øger procentdelen af funktionelle myocytter og varigheden af eksperimenterne (6-8 timer). For det fjerde er isolerede myocytter oplagres løsning containing 200 uM Ca2 +.
At opnå optimal belastning med Fura 02:00, er to forskellige Ca2 + koncentrationer (250 og 500 um) anvendes og poloxamer 407 (2 pi, 20% fremstillet i dimethylsulfoxid) tilsættes for at forbedre permeabiliteten af Fura-02:00 gennem membranen og dets stabilitet i myocytter. Det skal bemærkes, at alle Ca2 + indikatorfarvestoffer er Ca2 + buffere 21. Derfor bør forskere undgå at bruge en høj koncentration af Fura-2 AM eller en længere inkubation for at undgå overdreven buffering og reduceret myocyt kontraktilitet. Det anbefales, at myocyt sammentrækning uden Fura - 2 loading rutinemæssigt kontrolleres, hvilket er et vigtigt skridt til at vurdere kvaliteten af myocyt og lastning status. Variation i læsning er uundgåelig. Derfor er det vigtigt at kontrollere variabiliteten af myocyt sammentrækning, særligt om det antal kontraherende myocytter i kammeret er den samme før og enfter belastning. Analyse af hyper- eller hypo-kontraherende myocytter bør undgås, fordi de ikke repræsenterer den gennemsnitlige status myocytter og kan forårsage skæve resultater og evalueringer.
Det skal bemærkes, at de målte ændringer i Fura 2-forhold er refleksioner af intracellulær Ca2 + niveau, snarere end den faktiske kemiske koncentration af Ca2 +. Derfor er den her beskrevne metode evaluerer kvalitative ændringer af myofilament Ca2 + følsomhed, snarere end den faktiske følsomhed myofilaments til Ca2 +. Kalibrering af Fura - 2 signal til det intracellulære Ca2 + -koncentration er løsningen for pålidelige Ca2 + koncentrationer i individuelle myocytter. Kalibreringsproceduren kræver loading myocytter med forskellige koncentrationer af Ca2 + -konjugeret Fura - 2 AM (Ca2 + -koncentration området fra 0 til 39 uM), og den opnåede Fura - 2 nøgletal er beregnet med the følgende formel: [Ca2 +] i = Kd * (R - Rmin) / (Rmax - R) * F380max / F380min 21. Det er muligt at udlede de puljede gennemsnitsværdier for Ca2 + koncentrationer gennem sådan en kalibreringsprocedure. Men fordi lastning af Ca 2+ indikatorer er variabel blandt myocytter og kalibrering ikke udføres i en individuel celle, Ca 2 + koncentrationer kan ikke erhverves præcist. Desuden, hvis F360 / F380 måles snarere end F340 / F380 (som i den foreliggende undersøgelse), Fura 2-forhold er mindre nøjagtig (fordi F360 er den isobestic bølgelængde på Fura-2-fluorescens 22). Ikke desto mindre er det stadig et gyldigt metode til at vurdere kvalitative ændringer i myofilament Ca 2+ følsomhed i fysiologiske eksperimenter, især i syge menneskers hjerter, hvor myofilaments kan samtidigt ændres efter ændringer i det intracellulære miljø. Det anbefales, at denne metode er kombineret med alternative metoder (som debeskrevet tidligere i diskussionen afsnit) til præcist at analysere den sande følsomhed myofilaments til Ca2 +.
Den anden begrænsning af fremgangsmåden i studiet af myocyt sammentrækning er ubelastet tilstand. Det kan undervurdere eller overvurdere ændringerne i myofilament Ca 2+ følsomhed. Derfor præcist at vurdere myofilament Ca2 + følsomhed, bør analyser udføres med alternative målinger for både kvalitativ og kvantitativ vurdering.
Teknikken kan anvendes til vurdering myocardial funktion hos raske og syge hjerter, herunder humane kardiale prøver, hvor det cellulære redox miljø og post-transcriptionale modifikationer ændres, hvilket resulterer i samtidig ændringer i myofilament funktioner. Især ionkanaler, intracellulær ion homeostase og regulatoriske proteiner i myofilaments er interaktive; derfor alle disse komponenter fungerer i concert for at bestemme hjerte ydeevne in vivo (fx som målt i ekkokardiografi).
Afslutningsvis beskriver vi en metode til at evaluere ændringerne i myofilament Ca2 + følsomhed og understrege betydningen af at analysere denne parameter sammen med hjerteelektrofysiologi, intracellulær Ca2 + håndtering, og myocyt sammentrækning at opnå fuld profil af myocyt funktion. Myofilament Ca 2+ følsomhed bør måles rutinemæssigt i mekanistiske undersøgelser ved hjælp af syge hjerte modeller, hvor ændringer i disse parametre samt forskellige intracellulære signalveje er indbyrdes forbundne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af Basic Science Research Program gennem National Research Foundation Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi (2013068067); af Brain Sydkorea 21 Graduate Programme af den koreanske ministerium for undervisning, videnskab og teknologi, Seoul National University Hospital, den koreanske Society of Hypertension (2013), SK Telecom Research Fund (nr. 3420130290), og fra National Natural Science Foundation of China (NSFC 31.460.265; NSFC 81.260.035).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dawley rat | Koatech | 8-12 weeks | |
| Pentobarbital Sodium | Hanlim Pharmaceutical (Korea) | AHN901 | Insurance code:645301220 |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | |
| Mannitol | Sigma | M4125 | |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Taurine | Merck | 8.08616.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | |
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | |
| Protease | Sigma | P6911 | |
| Fura-2 (AM) | Molecular Probes | F1221 | |
| Pluronic F127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Shaking Water Bath | Chang Shin Scientific | Model: C-108 | |
| IonWizard Softwae Suite | IonOptix Ltd | Experimental Builder | Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes |
| Myocyte Calcium & Contractility Recording System | IonOptix Ltd | ||
| Circulating Water Bath | BS-Tech | BW2-8 | |
| Myocyte Fluorescence Microscope | Nikon | DIATPHOTO 200 | |
| MyoCam-S Power | IonOptix | ||
| Fluorescence & Video Detection | IonOptix | MyoCam-S | |
| CFA300 | |||
| PMT400 | |||
| Fluorescence & System Interface | IonOptix | FSI700 | |
| Excitation Light Source | IonOptix | mSTEP | |
| High intensity ARC Lamp Power supply | Cairn Reseach | ||
| Filter wheel controller | IonOptix | GB/MUS200 | |
| Digital Stimulator | Medical Systems Corportion | S-98 Mutimode | |
| Compositions of Experimental Solutions | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 135 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 5 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5 |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 3.5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | Concentration (mmol) 0.4 |
| Storage Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 120 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.2 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 29 |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | Concentration (mmol) 5 |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | Concentration (mmol) 5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 141.4 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 4 |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Concentration (mmol) 0.33 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1.8 For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 1 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 14.5 |
| Collangenase Solution 1 | |||
| Isolation Solution (30mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| Protease | Sigma | P6911 | Concentration (mmol) 0.1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| Collangenase Solution 2 | |||
| Isolation Solution (20mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| BSA solution | |||
| Isolation Solution (40mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | Concentration (mmol) 400 mg |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1mM |
References
- Bers, D. M., et al.
- Eisner, D. A., et al. Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle. Circ Res. 87 (12), 1087-1094 (2000).
- Palmiter, K. A., et al. Molecular mechanisms regulating the myofilament response to Ca2+: implications of mutations causal for familial hypertrophic cardiomyopathy. Basic Res Cardiol. 92 (S1), 63-74 (1997).
- Missiaen, L., et al. Abnormal intracellular Ca2+ homeostasis and disease. Cell Calcium. 28 (1), 1-21 (2000).
- Trafford, A. W., et al. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437 (3), 501-503 (1999).
- Berlin, J. R., et al. Intrinsic cytosolic calcium buffering properties of single rat cardiac myocytes. Biophys J. 67 (4), 1775-1787 (1994).
- Robertson, S. P., et al. The time-course of Ca2+ exchange with calmodulin, troponin, parvalbumin, and myosin in response to transient increases in Ca2+. Biophys J. 34 (3), 559-569 (1981).
- Schober, T., et al. Myofilament Ca2+ sensitization increases cytosolic Ca2+ binding affinity, alters intracellular Ca2+ homeostasis, and causes pause-dependent Ca2+-triggered arrhythmia. Circ Res. 112 (2), 170-179 (2012).
- Briston, S. J., et al. Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during β-adrenergic stimulation in cardiac myocytes. Cardiovasc Res. 104 (2), 347-354 (2014).
- Patel, B. G., Wilder, T., John Solaro, R. J., et al. Novel control of cardiac myofilament response to calcium by S-glutathionylation at specific sites of myosin binding protein C. Front Physiol. 4, 336 (2013).
- Jin, C. Z., et al. Myofilament Ca2+ desensitization mediates positive lusitropic effect of neuronal nitric oxide synthase in left ventricular myocytes from murine hypertensive heart. J Mol Cell Cardiol. 60, 107-115 (2013).
- Wang, Y., et al. Modulation of L-type Ca2+ channel activity by neuronal nitric oxide synthase and myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from hypertensive rat. Cell Calcium. 58 (3), 264-274 (2015).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M., et al. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).
- Spurgeon, H. A., et al. Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation. J Physiol. 447, 83-102 (1992).
- Preston, L. C., et al. Functional effects of the DCM mutant Gly159Asp troponin C in skinned muscle fibres. Pflugers Arch. 453 (6), 771-776 (2007).
- Willott, R. H., et al. Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function? J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).
- Yasuda, S. I., et al. A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).
- Sears, C. E., et al. Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling. Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).
- Ashley, E. A., et al. Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes. Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).
- Zhang, Y. H., et al. Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice. Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Grynkiewicz, G., et al. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
