Abstract
Сердечная недостаточность и нарушения ритма сердца являются основными причинами смертности и заболеваемости во всем мире. Тем не менее, механизм патогенеза и миокардиальной неисправностью в больном сердце остается полностью выяснены. Последние убедительные данные свидетельствуют о том, что изменения в myofilament Ca 2+ чувствительности влияет на внутриклеточный Ca 2+ гомеостаз и ионных каналов деятельность в кардиомиоциты, основные механизмы , ответственные за потенциала действия сердца и сжатия у здоровых и больных сердец. Действительно, деятельность ионных каналов и транспортеров , лежащие в основе потенциалов действия сердца (например, Na +, Ca 2+ и K + каналов и Na + -Ca 2+ обменника) и внутриклеточного Са 2+ обработки белки (например., Рианодин рецепторы и Ca 2+ -АТФазы в саркоплазматического ретикулума (SERCA2a) или phospholamban и его фосфорилирования) традиционно измеряется в оценели фундаментальных механизмов сердечного возбуждения-сжатия (EC) муфты. Обе электрические действия в мембране и внутриклеточных изменений Са 2+ являются синхросигналы сцепления ЕС, в то время как myofilament является функциональной единицей сокращения и расслабления, и myofilament Ca 2+ чувствительности является обязательным при осуществлении миофибрилл производительности. Тем не менее, несколько исследований включают myofilament Ca 2+ чувствительности в функциональном анализе миокарда , если он не находится в центре внимания исследования. Здесь мы опишем протокол , который измеряет саркомер сокращения / повторного удлинения и внутриклеточный уровень Са 2+ с использованием Фура-2 AM (ратиометрический обнаружения) и оценить изменения myofilament Ca 2+ чувствительности в кардиомиоцитов из сердца крысы. Основная цель состоит в том, чтобы подчеркнуть , что myofilament Ca 2+ чувствительности следует принимать во внимание в муфте EC для механистического анализа. Комплексное исследование Iна каналах, ионные транспортеры, внутриклеточная обработки Ca 2+ и Ca 2+ myofilament чувствительности, лежащих в основе миоцитов сократимость у здоровых и больных сердца предоставит ценную информацию для разработки более эффективных стратегий поступательной и терапевтическую ценность.
Introduction
Сердечный возбуждения-сжатия (EC) связи является основной схемой для анализа механических свойств миокарда, т.е. сократительной функции сердца 1,2. Муфта EC инициируется деполяризации мембраны вторичным по отношению к деятельности сарколемных ионных каналов (например, напряжения закрытого Na + канал, который можно измерить с помощью методов патч-зажим). После активации напряжения закрытого L-типа Ca 2+ каналы (LTCCs) и Са 2+ приток через LTCCs вызывают большую часть Ca 2+ через выпуск рианодиновых рецепторов (RyRs), увеличение концентрации цитозольного Са 2+ из наномолярной (Nm ) до микромолярные (мкМ) уровень. Такое увеличение цитозольного Ca 2+ способствует Са 2+ связывания с тропонина С (TNC) в тонких нитях и вызывает конформационные изменения комплекса синтетических нитей , чтобы облегчить взаимодействие актина-миозина и достигает myocardiАль контракции 3. С другой стороны , цитозольного Ca 2+ повторно uptaken обратно в саркоплазматического ретикулума (СР) через Ca 2+ -АТФазы в SR (SERCA2a) или выдавливают из миоцита через Na + / Ca 2+ обменника и plasmalemmal Ca 2+ АТФазы 1,2. Следовательно, снижение цитозольного Ca 2+ подстрекает конформационные изменения тонких нитей обратно в исходное состояние, что приводит к диссоциации актин-миозин и миоцитов релаксации 1-3. В этой схеме, активность SERCA2a , как правило , считается , чтобы определить скорость релаксации миокарда , поскольку она составляет 70 - 90% от цитозольной удаления Ca 2+ в большинстве млекопитающих клеток сердца 1. В качестве такого, ненормального обработка Ca 2+ LTCC, RyR и SERCA2a и т.д. были рассмотрены основные механизмы нарушенной сократимости и релаксации в сердце больном 1-4.
2+ , который функционирует как посланному на счетах сцепных ЕС для около 1% от общего внутриклеточного Са 2+ и большинство Са 2+ связывается с внутриклеточными Ca 2+ буфера 5,6. Это связано с тем , что различные Са 2+ буферы в изобилии в кардиомиоциты, например, мембранные фосфолипиды, АТФ, креатинфосфата, кальмодулин, парвальбумина, миофибрилла TnC, миозин, SERCA2a и calsequestrin в СР. 5.6.7. Среди них, SERCA2a и TnC являются преобладающими Са 2+ буферов 5,6,7. Кроме того, связывание Са 2+ с его буферами представляет собой динамический процесс во время подергивания (например, 30-50% Са 2+ связывается с TnC и отмежеваться от него во время Са 2+ 7) и изменения в Ca 2+ связывания причиной дополнительного "освобождение" свободного Са 2+ в цитозоле, приводит к переделок внутриклеточного Са 2+ концentration. Следовательно, возмущение внутриклеточного уровня Са 2+ вызывает аномальные движения myofilament, которые являются предшественниками сократительной дисфункции и аритмий 8,9. Многие факторы (как физиологические и патологические) могут быть источниками посттранскрипционных модификаций myofilament белков, которые влияют на myofilament Са 2+ буферизация и myofilament Ca 2+ чувствительности 8-10. Недавно было сообщено о том, что мутации в myofilament белки увеличивают Са 2+ сродство связывания и внутриклеточного обработку Ca 2+, вызывая паузы зависящих от потенцирование Ca 2+, Ca 2+ ненормальным релиз и аритмий 8. В соответствии с этой концепцией, мы также показали , что myofilament Ca 2+ десенсибилизации в гипертоников сердцах крыс вторичным по отношению к регуляцию нейрональной синтазы оксида азота связан с повышенным уровнем диастолического и систолического Ca 2+ уровней11, который , в свою очередь, повышает уязвимость к LTCC Ca 2+ -зависимые инактивация 12. Следовательно, myofilament Ca 2+ чувствительность является "активным" регулятором внутриклеточного Ca 2+ гомеостаза и сократительной функции кардиомиоцитов. Стало необходимо проанализировать взаимодействие между myofilament и Ca 2+ обработка белков для тщательного изучения миоцитов сцепления EC и сердечной функции.
Здесь мы опишем протокол , который оценивает изменения myofilament Ca 2+ чувствительности в изолированных кардиомиоцитов. Комплексный анализ внутриклеточного Ca 2+ профиль, myofilament Ca 2+ чувствительность и сжатие будет раскопать романа механизмы , лежащие в миокарде механики.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованных Национальным институтом ООН здоровья (NIH Publication No. 85-23, пересмотренная 1996). Он был утвержден по уходу и использованию комитета Institutional животных (IACUC) Сеульского национального университета (утверждения IACUC № .: СНУ-101213-1) путем.
1. Буфер Подготовка (Таблица Материалы и оборудование)
- Готовят 300 мл свежего раствора изоляции на день эксперимента (в мМ: NaCl 135; KCl 5,4, MgCl 2, 3,5; глюкоза, 5; HEPES, 5; Na 2 HPO 4, 0,4; таурин, 20; рН 7,4 с помощью NaOH).
- Приготовьте 100 мл раствора свежего хранения на день эксперимента (в мМ: NaCl 120; KCl 5,4; MgSO 4 5; CaCl 2 0,2; натрий-пируват 5; глюкоза 5,5; таурин 20; HEPES , 10; маннитол 29; рН 7,4 с помощью NaOH).
- Готовят 1 л раствора перфузии (в мМ: NaCl, 141.4, KCl, 4, NaH 2 PO 4, 0,33; MGCл 2, 1; HEPES, 10; глюкоза, 5,5; CaCl 2, 1,8; маннита, 14,5; рН 7,4 с помощью NaOH).
- Приготовьте 30 мл раствора коллагеназы 1 путем добавления коллагеназы (1 мг / мл), протеазу (0,1 мг / мл), бычий сывороточный альбумин (БСА, 1.67mg / мл) и Са 2+ (0,05 мМ) в 25 мл изоляции решение.
- Приготовьте 20 мл раствора коллагеназы 2 путем добавления коллагеназы (1 мг / мл), бычий сывороточный альбумин (1,67 мг / мл) и Са 2+ (0,05 мМ) до 16,7 мл раствора изоляции.
- Приготовьте 40 мл раствора БСА добавлением 0,4 г бычьего сывороточного альбумина в 40 мл раствора изоляции. Раздельное 10 мл и 30 мл в двух стаканах. Добавить Ca 2+ до 30 мл раствора БСА таким образом, чтобы конечная концентрация Са 2+ в растворе БСА составляет 1 мм.
2. Подготовка к изоляции левого желудочка (ЛЖ) миоцитов
- Передача 8-12-недельных, мужские Sprague-Dawley (SD) крыс в чистых транспортных клетках из вивария для подготовки и изоляции помещения.
- ЧАСесть два водяные бани до 37 о С.
Примечание: Используйте один водяной бане в воду - резервуар с рубашкой и перфузионных трубок системы перфузионного Лангендорфа. Используйте другую ванну воды для того чтобы агитировать стволы ткани миокарда, чтобы отделить единичные миоциты. - Добавляют 5 мл и 3,3 мл раствора БСА (без Са 2+) к 25 мл раствора коллагеназы 1 и 16,7 мл раствора коллагеназы 2 , чтобы компенсировать объем до 30 мл и 20 мл, соответственно.
- Добавить раствор изоляции (100 мл) и раствором коллагеназы 1 (30 мл) в колонку 1 (Кол 1) и колонки 2 (Кол 2) в системе Лангендорфа перфузионного, соответственно (Рис . 1А)
- Оксигенации раствора изоляции и раствором коллагеназы 1 в Кол.1 и Кол.2 через соединение кислорода трубки в перфузионной системе Лангендорфа (рис 1А). Точно так же, кислородсодержащих соединений раствор 2 коллагеназы и раствор БСА в встряхивании на водяной бане со 100% O 2 черезкислорода соединительной трубки.
3. Выделение миоцитов Л.В.
- Обезболить на SD крыс через внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала натрия (30 мг / кг) и подтвердить обезболивающий статус носком сдавливания и отсутствие абстинентного отражения.
- Перемещение крысы рассечение лотка. В положении лежа на спине, закрепите четыре ноги по бокам тела с лентой.
- Применить грудные середине осевые разрезы с хирургическими ножницами, чтобы открыть сундук, обеспечивая, чтобы не повредить сердце. Используйте другую пару чистых ножницами , чтобы рассекать сердце из сообщающихся сосудов (например, верхней и нижней полой вене, легочных сосудов и аорты) и перикарда мембраны 13.
- Оставьте часть аорты достаточной длины (5 - 8 мм), зажим аорты с тонким пинцетом, и быстро монтировать канюлю системы перфузионного Лангендорфа в течение 1 мин (фиг.1А). Tie шовная нить 4/0 плотно над аортой.
- Демонтировать переваренной сердце путем разрезания аорту и передать его, удерживая аорту с пинцетом в колбу , содержащую свежий раствор изоляции (рис 1Bi). Используйте тонкие ножницы и пинцет , чтобы вырезать большую часть свободной стенки левого желудочка ( в том числе перегородку) на более мелкие куски (~ 22 мм, рис 1Bii).
- Передача части в колбу , содержащую предварительно нагретым и насыщенным кислородом свежим раствором коллагеназы 2 (рис 1Biii). Встряхивают в течение 10 мин. Хранить доставки кислорода к миоцитов раствора, содержащего коллагеназы 2.
- Перемещение миоцит - суспензии в 10 мл центрифужные пробирки с помощью капельницы с всасывающим луковице и добавить Ca 2+ - раствор , содержащий БСА (1: 1 по объему). Центрифуга на 30 г в течение 2 мин и отбросить супернатант. Повторное приостановить миоцитов осадок в 5 мл раствора БСА. Центрифуга и отбросить супернатант.
- Дисперсные миоцита гранул и держать миоцитов в 10 мл раствора для хранения предварительно насыщенной кислородом при комнатной температуре (рис 1Biv-VI).
- Повторите процедуры (шаги 3.7 - 3.9) с оставшейся ткани ЛЖ в колбе.
Примечание: Продолжайте повторять процедуры (шаги 3.7 - 3.9), пока большая часть ткани левого желудочка не исчезает, чтобы получить хороший выход миоцитов. - Хранить миоциты в растворе для хранения в течение 6-8 ч при комнатной температуре до конца эксперимента.
4. Одновременные измерения внутриклеточного Са 2+ и миоцитов Относительное сужение
- Нагрузка LV миоциты с ацетоксиметил эфира фура-2 AM (2 мкМ).
Примечание: Выполните все процедуры загрузки и эксперименты с заряженными миоцитов в темной трубке (рис 1Bvii).- Centrifuge миоцитов суспензию (1 мл) при 2000 х г в течение 10 сек. Удалите супернатант и повторно приостанавливать миоцитов осадок в 1 мл раствора Тироде с низкой концентрацией Ca 2+ (250 мкМ, Таблица материалов и оборудования).
- Добавить фура-2АМ и полоксамер 407 (2 мкл), мягко рассеивать миоцитов суспензии, и держать смесь при комнатной температуре (20 - 24 ° С) в течение 15 мин (рис 1Bvii).
- Центрифуга смесь в течение 5 сек, отбросить супернатант и разогнать миоцитов осадок в 1 мл перфузионного раствора , содержащего 500 мкМ Са 2+. Через 10 мин, центрифугируют смесь в течение 5 сек и отбросить супернатант.
- Добавить свежий перфузионный раствор (500 мкМ Са2 +, 1 мл) и держать фура-2 утра - загруженную миоцитов осадок в этом растворе для записей.
- Измерение LV миоцитов сжатия и внутриклеточного Са 2+
- Перед записью, заполнить трубку перфузионного, которая проходит черезВодяная рубашка с раствором Тироде, который предварительно нагревают до 36 о С.
- Поместите несколько капель Fura 2 AM - загруженная LV миоцитов подвеска на камеру перевернутой флуоресцентного микроскопа для 5 - 8 мин. Медленно заливать раствор Тироде (2,2 мл / мин).
- Нажмите кнопку "Пуск" на передней панели цифрового стимулятора, чтобы начать стимуляцию поля (2 Гц).
Примечание: Выходное напряжение (10 В, 5 мсек) применяется к миоцитов в камере через платиновые провода, расположенные по обе стороны камеры.- Выберите миоциты, что контракт стабильно (не те, показывая гипер- или гипо- сжатия) для записи.
- Отрегулируйте миоцит выбора в горизонтальном положении системы обнаружения саркомера видеопрограмм и настроить фокус микроскопа для получения оптимальных изображений саркомеров. Поместите фиолетовый прямоугольник на область, в которой ясно саркомеры четко не наблюдается до среднегодлин саркомера (красный пик) отображает уникальный резкий пик (рис 2А, нижний рисунок).
- Запишите изменения длины саркомера в ответ на стимуляцию поля (рис 2А и В).
Примечание: Используйте загруженные миоцитов в течение 1 - 2 ч. - Отрегулируйте диафрагму камеры таким образом , чтобы поле в системе обнаружения саркомер видео на основе является размер миоцитов (рис 2А). Стимулируют миоцит с возбуждением на 360 нм / 380 нм и излучение на длине волны 510 нм (частота приобретения 1000 Гц). Запись саркомер укорочение и отношение фура2 АМ при стимуляции поля (рис 2В).
5. Оценка Myofilament Ca 2+ Чувствительность
- Среднее значение на основании длины саркомера и Ca 2+ в стационарном состоянии (10 - 20 следов) и участок контура фазовой плоскости соотношения Fura-2 против длины саркомера того же миоцита (оба с измеренным значениемс и дельта изменения; рис. 2в)
- В каждом участке, определяют соотношение Фура -2 при 50% релаксации (EC 50, Рис 2С). Сравните оба цикла и EC 50 каждого вмешательства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
миоциты LV изолированы от нормальных, так и с гипертонической болезнью сердца крысы. В форме стерженьков миоциты с четкими страт (представляющих саркомеры) и стабильных сокращений в ответ на стимуляцию поля считаются оптимальными миоциты и выбраны для записей (рис 2А). В примере , показанном на F igure 2А, А фура 2 утра -loaded Л.В. миоцитов расположен горизонтально , а апертура камеры регулируется таким образом, что миоцитов занимает большую часть области записи и минимальной площади засветки включена. В поле записи, отрегулируйте размеры фиолетовую коробку, нажав и перетащив эту опцию на экране компьютера (с помощью программы записи). Когда средняя длина саркомера показывает один острый красный пик, начните запись (рис 2A, ниже изображение).
И длина саркомера и внутриклеточного Ca 2+ transie NTS (фура-2 отношения) регистрируются одновременно с одних и тех же миоцитов (рис 3А). Средние следы длины саркомера и Са 2+ показаны на рисунке 3B. Индивидуально, длина диастолического / систолического саркомера, время до пика (PT), и саркомер укорочение измеряются исследовать амплитуду и динамику миоцитов сократимость. Время до 50% релаксации (TR 50) анализируется для оценки релаксации миоцитов. Точно так же, диастолическое и систолическое отношения Фура-2 (Ca 2+), время пика (PT) Са 2+ и постоянная времени Са 2+ переходных процессов распада (тау) анализируются для оценки миоцит сокращения и расслабления (табл 1). В этом примере, амплитуды Са 2+ умеренно увеличена в миоцитах ЛЖ от гипертензивных крыс и сокращение умеренно снижена (Рисунок 3B и Таблица 1).
Содержание "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 "> Кроме того, отношения между фура - 2 и отношение длины саркомера ( с указанием myofilament Ca 2+ чувствительность миоцитов ЛЖ) приведены в обоих бутафорских и гипертензивных крыс ( . Рисунок 3 в ) Фура 2 - саркомер длина траектории во время фазы релаксации миоцита определяет квазиравновесная цитозольных Са 2+, Са 2+ myofilament связывания, а длина 14 саркомера, поэтому фаза релаксации сравнивается между двумя группам. сдвиг вправо траектории в миоциты от гипертонической группы указывает на снижение реакции myofilament по отношению к Са 2+ (рис 3C). Соответственно, внутриклеточный Ca 2+ концентрация необходима для половины релаксации (EC 50) увеличивается (рис 3C) , ссылаясь на myofilament Ca 2+ -desensitization при гипертонии.Рисунок 1. Процедуры выделения миоциты LV из сердца крысы. (А) Система перфузионного Лангендорфа используется заливать раствор изоляции в сердце канюлированной через аорту (вставка, увеличенное изображение , смонтированного сердца на перфузионной системы) (В) I - III:. Сердце после расщепления раствором коллагеназы 1 и рассеченные ЛЖ ткани в чашке и колбу (B) , IV - VI:.. миоцитов суспензии после добавления раствора коллагеназы 2, миоцитов осадку после центрифугирования и ресуспендировали миоцитов осадок в растворе для хранения (B) , VII: инкубационный, инкубировать Л.В. миоциты в Фура 2AM - раствор , содержащий изоляции (2 мкМ Fura 2 А.М., 250 мкМ Са 2+ и 2 мкл полоксамер 407); вымывания, моют миоциты LV раствором изоляции с 500 мкМ Са 2+; хранения, держать Fura-2 AM - нагруженные LV миоцитовсвежий раствор , содержащий изолированность 500 мкМ Ca 2+. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Измерение саркомера укорочение и отношение фура-2 (показатель внутриклеточного уровня Са 2+). (А) Схема саркомера, образ Fura-2 -loaded Л.В. миоцита и усредненная длина саркомера (красный пик) отображаются на компьютере. В нижней панели, черная линия представляет собой среднее значение каждого пикселя горизонтальной линии в пределах фиолетовой области, представляющей интерес. Синяя линия одни и те же данные Обнуляемые на каждом конце. Красная линия является быстрое преобразование Фурье (FFT), спектр мощности, которая представляет собой число сигналов БПФ подсчитал. Один резкий реак означает чистую запись саркомера. (B) Одновременные записи длины саркомера и соотношению Фура -2 в ответ на стимуляцию поля (2 Гц). (C) Постепенная плоскости график отношения Fura 2 против длины саркомера того же Л.В. миоцитов (обратите внимание, что как фактическая длина / 2 соотношение Фура и дельта изменения этих параметров анализируются). EC 50 (соотношение Fura 2 при 50% релаксации, круг показано стрелкой) является качественное сравнение myofilament Ca 2+ чувствительности между группами. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Типичные результаты анализа миоцитов сокращения ЛЖ в притворство и гипертензивных крыс. (A) Сырые следы саркомера сhortening и фура - 2 Измерение коэффициента в миоциты ЛЖ от поддельного и гипертензивных крыс (Б) Средние следы длины саркомера и Фура -. 2 сигналов. Параметры , анализируемые в усредненных трасс приведены в таблице 1. (C) Фаза-плоскости графики зависимости Fura - 2 Отношение против длины саркомера (как фактическую длину и Fura - 2 и соотношение дельта изменения этих параметров) в обеих группах , Петля траектория смещается вправо и ЕС 50 , как правило, выше , при артериальной гипертензии, предлагая myofilament Ca 2+ десенсибилизации. PT, время до пика (сек); Tau, постоянная времени Са 2+ переходного распада (сек) (полученный путем установки фазы упадка Fura - соотношение 2 с экспоненциальной функцией) .tr 50: время до 50% релаксации (сек). 
Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версиюэтой фигуры.
| параметры | фиктивный | повышенное кровяное давление | |
| Внутриклеточного Са 2+ | Диастолическое Ca 2+ | 1,189 | 1,124 |
| Систолическое Ca 2+ | 1,71 | 1,691 | |
| Амплитуда (Δ отношение) | 0.521 | 0.567 | |
| Время до пика (PT, s) | 0.021 | 0.031 | |
| Tau (ы) | 0.079 | 0.076 | |
| саркомера | диастолический | 1,758 | 1,78 |
| длина саркомера (мкм) | |||
| саркомера | 0,122 | 0.115 | |
| Укорачивание (16; Длина, мм) | |||
| Время до пика (PT, s) | 0.064 | 0.055 | |
| Время до 50% | 0.032 | 0.03 | |
| Расслабление (TR 50, s) | |||
| EC50 | [Са 2+] (фура-2 соотношение) для 50% саркомера relengthening | 0,2382 | 0,3224 |
Таблица 1. Анализ Fura - 2 отношение (внутриклеточного Са 2+) и саркомера измерения длины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем протоколы для оценки изменений myofilament Ca 2+ чувствительности в одной изолированной сердечной миоцита и подчеркнуть важность измерения этого параметра наряду с электрофизиологических свойств, внутриклеточный Ca 2+, и динамику myofilament. Это происходит потому, что записи одного или двух из параметров не могут эксплицировать механизмы, лежащие в основе сердечного сокращения и расслабления. В отличие от традиционных методов , которые измеряют сокращение миоцитов и внутриклеточного Са 2+ профиль индивидуально 1, настоящий способ рассматривает оба параметра одновременно в одних и тех же кардиомиоцитов.
Ряд методов , как правило , используются для оценки myofilament Ca 2+ чувствительность мышц или миоцитов 15,16,17, например, изучения взаимодействий между экзогенного Ca 2+ и саркомера / длина ячейки / натяжения в кожурой миоцитов(Лечение с помощью моющих средств, таких как сапонин или бета-Esin к проницаемыми мембраны). Длины измеряются фотодиодом и методами дифракции лазерного пучка и напряжения с датчиков силы или углеродные волокна). Эти методы широко используются в мышечных исследований , так как они дают возможность количественной оценки myofilament Ca 2+ чувствительности. Тем не менее, эндогенные активность ионных каналов в плазматической мембране и внутриклеточной обработке Ca 2+, те , которые необходимы для инициирования механики myofilament, пренебрегают в этих методах. Кроме того, мышечные полоски или миоциты исследуемые предварительно растягивают до некоторой диастолической длины, и в этих условиях, начальная длина саркомера может отличаться от фактической диастолической длины миоцитов (особенно в условиях болезни и с вмешательствах). Это подчеркивает преимущество текущего измерения, где клеточные органеллы остаются относительно невозмущенной, тем самым, обеспечивая всеобъемлющую оценвания функции миоцитов сократительной.
Вполне понятно, что качество миоцитов (Ca 2+ -tolerating) и оптимальной загрузки Fura - 2am являются двумя ключевыми элементами для успешной оценки myofilament Ca 2+ чувствительности. Соответственно, некоторые модификации применяются к протоколу, чтобы получить жизнеспособные палочковидных миоцитов (60-80% от общего числа клеток, как описано ранее 18.19.20). Во- первых, низкая доза Ca 2+ добавляют к растворам в процессах пищеварения (например, концентрация Са 2+ составляет 50 мкМ в коллагеназы растворах и 200 мкМ в растворе для хранения). Во-вторых, во время процесса пищеварения, БСА добавляется к коллагеназы решений для повышения стабильности мембран. В-третьих, большинство решений являются окисленный в процессе выделения, что повышает процент функциональных миоцитов и продолжительность эксперимента (6-8 ч). В-четвертых, отдельные миоциты хранятся в памяти раствор Сontaining 200 мкМ Са 2+.
Для того, чтобы получить оптимальную загрузку фура 2AM, две различные концентрации Са 2+ (250 и 500 мкм) используются и полоксамер 407 (2 мкл, 20% в диметилсульфоксиде) добавляют для повышения проницаемости фура-2AM через мембрану и его стабильность в миоциты. Следует отметить , что все Ca 2+ индикаторные красители Ca 2+ буферы 21. Поэтому, исследователи должны избегать использования высокой концентрации фура-2 AM или более длительный инкубации, чтобы избежать чрезмерного буферизацию и уменьшенную миоцитов сократимость. Рекомендуется, чтобы миоцит сокращение без Фура - 2 загрузка регулярно проверяется, что является важным шагом для оценки качества миоцита и состояния загрузки. Изменчивость загрузка неизбежна. Поэтому важно, чтобы проверить изменчивость миоцитов сокращения, в частности, является ли число заражения миоцитов в камере подобное раньше иосле загрузки. Анализ гипер- или гипо- договаривающаяся миоцитов следует избегать, поскольку они не представляют средний статус миоцитов и может привести к необъективные результаты и оценки.
Следует отметить , что измеренные изменения в соотношении фура 2 являются отражениями внутриклеточного уровня Са 2+, а не фактическая химическая концентрация Ca 2+. Таким образом, описанный здесь метод оценивает качественные изменения myofilament Ca 2+ чувствительности, а не фактическую чувствительность миофиламентов по отношению к Са 2+. Калибровка Fura - 2 сигнала к внутриклеточной концентрации Са 2+ является решением для получения надежных концентрации Ca 2+ в отдельных миоцитов. Процедура калибровки требует загрузки миоцитов с различными концентрациями Са 2+ -conjugated Fura - 2 AM (Ca 2+ концентрации в диапазоне от 0 до 39 мкМ) и полученный Fura - 2 коэффициенты вычисляются с гое следующая формула: [Са 2+] = Kd * (R - Rmin) / (Rmax - R) * F380max / F380min 21. Можно вывести Отстоявшийся средние значения концентрации Са 2+ с помощью такой процедуры калибровки. Тем не менее, так как нагрузка Ca 2+ показателей является переменным среди миоцитов и калибровка не выполняется в отдельной ячейке, концентрации Са 2+ , может не получаться точно. Кроме того, если F360 / F380 измеряется , а не F340 / F380 (как в данном исследовании), соотношение фура 2 является менее точным (так как F360 является изобестических длина волны фура-2 флуоресценции 22). Тем не менее, он по - прежнему действует метод оценки качественных изменений в myofilament Ca 2+ чувствительности в физиологических экспериментах, особенно в пораженных человеческих сердцах, где миофиламентов могут быть одновременно изменены после того, как изменения в внутриклеточной среде. Рекомендуется, чтобы этот метод в сочетании с альтернативными способами (как деописано выше в разделе обсуждения) , чтобы точно проанализировать истинную чувствительность миофиламентов по отношению к Са 2+.
Другое ограничение метода в изучении миоцитов стягивания нерабочем состоянии. Это может привести к недооценке или переоценивать изменения в myofilament Ca 2+ чувствительности. Поэтому, чтобы точно оценить myofilament Ca 2+ чувствительности, анализ следует проводить с альтернативными измерениями как для качественной и количественной оценки.
Методика применима для оценки функции миокарда у здоровых и больных сердца, в том числе сердца образцов человека, в которых происходит смена клеточного окислительно-восстановительной среды и пост-транскрипционные модификации, в результате сопутствующих изменений в функциях myofilament. В частности, ионные каналы, внутриклеточный ионный гомеостаз и регуляторные белки в миофиламентов интерактивны; Таким образом, все эти компоненты функционируют в concerт для определения производительности сердца в естественных условиях (например, как измерено в эхокардиографии).
В заключение, мы опишем метод для оценки изменений myofilament Ca 2+ чувствительности и подчеркнуть важность анализа этого параметра в сочетании с сердечной электрофизиологии, внутриклеточной обработке Ca 2+ и миоцитов сжатия , чтобы получить полный профиль функции кардиомиоцитов. Myofilament Ca 2+ чувствительность должна измеряться на регулярной основе в механистических исследованиях с использованием модели больное сердце, где изменения этих параметров, а также различные внутриклеточные сигнальные пути взаимосвязаны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Основном программой исследования науки через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемой Министерством образования, науки и техники (2013068067); выпускница программы Brain Korea 21 Министерства образования, науки и техники, Сеульский национальный госпиталь университета, Корейского общества гипертонии (2013 г.), исследовательского фонда SK Telecom корейской (нет. 3420130290), а также из Национального фонда естественных наук Китая (NSFC 31460265; NSFC 81260035).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dawley rat | Koatech | 8-12 weeks | |
| Pentobarbital Sodium | Hanlim Pharmaceutical (Korea) | AHN901 | Insurance code:645301220 |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | |
| Mannitol | Sigma | M4125 | |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Taurine | Merck | 8.08616.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | |
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | |
| Protease | Sigma | P6911 | |
| Fura-2 (AM) | Molecular Probes | F1221 | |
| Pluronic F127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Shaking Water Bath | Chang Shin Scientific | Model: C-108 | |
| IonWizard Softwae Suite | IonOptix Ltd | Experimental Builder | Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes |
| Myocyte Calcium & Contractility Recording System | IonOptix Ltd | ||
| Circulating Water Bath | BS-Tech | BW2-8 | |
| Myocyte Fluorescence Microscope | Nikon | DIATPHOTO 200 | |
| MyoCam-S Power | IonOptix | ||
| Fluorescence & Video Detection | IonOptix | MyoCam-S | |
| CFA300 | |||
| PMT400 | |||
| Fluorescence & System Interface | IonOptix | FSI700 | |
| Excitation Light Source | IonOptix | mSTEP | |
| High intensity ARC Lamp Power supply | Cairn Reseach | ||
| Filter wheel controller | IonOptix | GB/MUS200 | |
| Digital Stimulator | Medical Systems Corportion | S-98 Mutimode | |
| Compositions of Experimental Solutions | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 135 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 5 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5 |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 3.5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | Concentration (mmol) 0.4 |
| Storage Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 120 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.2 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 29 |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | Concentration (mmol) 5 |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | Concentration (mmol) 5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 141.4 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 4 |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Concentration (mmol) 0.33 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1.8 For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 1 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 14.5 |
| Collangenase Solution 1 | |||
| Isolation Solution (30mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| Protease | Sigma | P6911 | Concentration (mmol) 0.1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| Collangenase Solution 2 | |||
| Isolation Solution (20mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| BSA solution | |||
| Isolation Solution (40mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | Concentration (mmol) 400 mg |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1mM |
References
- Bers, D. M., et al.
- Eisner, D. A., et al. Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle. Circ Res. 87 (12), 1087-1094 (2000).
- Palmiter, K. A., et al. Molecular mechanisms regulating the myofilament response to Ca2+: implications of mutations causal for familial hypertrophic cardiomyopathy. Basic Res Cardiol. 92 (S1), 63-74 (1997).
- Missiaen, L., et al. Abnormal intracellular Ca2+ homeostasis and disease. Cell Calcium. 28 (1), 1-21 (2000).
- Trafford, A. W., et al. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437 (3), 501-503 (1999).
- Berlin, J. R., et al. Intrinsic cytosolic calcium buffering properties of single rat cardiac myocytes. Biophys J. 67 (4), 1775-1787 (1994).
- Robertson, S. P., et al. The time-course of Ca2+ exchange with calmodulin, troponin, parvalbumin, and myosin in response to transient increases in Ca2+. Biophys J. 34 (3), 559-569 (1981).
- Schober, T., et al. Myofilament Ca2+ sensitization increases cytosolic Ca2+ binding affinity, alters intracellular Ca2+ homeostasis, and causes pause-dependent Ca2+-triggered arrhythmia. Circ Res. 112 (2), 170-179 (2012).
- Briston, S. J., et al. Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during β-adrenergic stimulation in cardiac myocytes. Cardiovasc Res. 104 (2), 347-354 (2014).
- Patel, B. G., Wilder, T., John Solaro, R. J., et al. Novel control of cardiac myofilament response to calcium by S-glutathionylation at specific sites of myosin binding protein C. Front Physiol. 4, 336 (2013).
- Jin, C. Z., et al. Myofilament Ca2+ desensitization mediates positive lusitropic effect of neuronal nitric oxide synthase in left ventricular myocytes from murine hypertensive heart. J Mol Cell Cardiol. 60, 107-115 (2013).
- Wang, Y., et al. Modulation of L-type Ca2+ channel activity by neuronal nitric oxide synthase and myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from hypertensive rat. Cell Calcium. 58 (3), 264-274 (2015).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M., et al. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).
- Spurgeon, H. A., et al. Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation. J Physiol. 447, 83-102 (1992).
- Preston, L. C., et al. Functional effects of the DCM mutant Gly159Asp troponin C in skinned muscle fibres. Pflugers Arch. 453 (6), 771-776 (2007).
- Willott, R. H., et al. Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function? J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).
- Yasuda, S. I., et al. A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).
- Sears, C. E., et al. Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling. Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).
- Ashley, E. A., et al. Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes. Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).
- Zhang, Y. H., et al. Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice. Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Grynkiewicz, G., et al. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
