Abstract
La insuficiencia cardíaca y arritmias cardíacas son las principales causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo. Sin embargo, el mecanismo de la patogénesis y el mal funcionamiento del miocardio en el corazón enfermo aún no ha sido aclarado. Evidencia convincente reciente demuestra que los cambios en la sensibilidad a la myofilament Ca 2+ afectan Ca intracelular 2+ actividades homeostasis y de los canales iónicos en los miocitos cardiacos, los mecanismos esenciales responsables de potencial de acción cardíaco y la contracción en corazones sanos y enfermos. De hecho, las actividades de los canales iónicos y transportadores subyacentes potenciales de acción cardiacos (por ejemplo, Na +, Ca2 + y canales de K + y el intercambiador de Na + -Ca 2+) y Ca 2 + manejo proteínas intracelulares (por ejemplo., Receptores de rianodina y Ca 2 + -ATPasa en retículo sarcoplásmico (SERCA2a) o fosfolamban y su fosforilación) se miden convencionalmente para Evalucomieron los mecanismos fundamentales de acoplamiento excitación-contracción cardiaca (CE). Ambas actividades eléctricas en la membrana y cambios intracelulares de Ca 2+ son las señales de disparo de acoplamiento CE, mientras que los miofilamentos es la unidad funcional de la contracción y la relajación, y la sensibilidad de los miofilamentos de Ca2 + es imprescindible en la aplicación de los resultados de las miofibrillas. Sin embargo, pocos estudios incorporan sensibilidad myofilament Ca 2+ en el análisis funcional del miocardio a menos que sea el foco del estudio. A continuación, se describe un protocolo que mide el acortamiento del sarcómero / re-alargamiento y el nivel intracelular de Ca2 + con Fura-2 de AM (detección radiométrica) y evaluar los cambios en la sensibilidad de los miofilamentos de Ca2 + en los miocitos cardíacos de corazones de ratas. El objetivo principal es hacer hincapié en que myofilament Ca 2 + sensibilidad debe ser tomado en consideración en el acoplamiento CE para el análisis mecanicista. investigación exhaustiva de ien los canales iónicos, transportadores, manejo intracelular de Ca2 +, y la sensibilidad de los miofilamentos de Ca2 + que subyacen en la contractilidad de los miocitos en corazones sanos y enfermos proporcionará información valiosa para el diseño de estrategias más eficaces de traslación y de valor terapéutico.
Introduction
Acoplamiento excitación-contracción cardiaca (CE) es el esquema fundamental para el análisis de las propiedades mecánicas del miocardio, es decir, la función contráctil del corazón 1,2. Acoplamiento CE se inicia por despolarización de la membrana secundaria a las actividades de los canales de iones sarcolema (por ejemplo, el canal de Na + dependiente de voltaje, que se puede medir a través de técnicas de patch-clamp). La posterior activación de voltaje de tipo L de Ca 2 + canales (LTCCs) y Ca 2 + afluencia través LTCCs desencadenar la mayor parte de la liberación de Ca2 + a través de receptores de rianodina (RyRs), el aumento de la concentración citosólica de Ca2 + desde el nanomolar (nM ) a nivel micromolar (M). Este aumento en Ca 2+ citosólico promueve Ca 2+ unión a la troponina C (TnC) en filamentos delgados y provoca cambios conformacionales del complejo de filamentos para facilitar la interacción actina-miosina y alcanza myocardiAl contracción del 3. Por el contrario, la citosólica de Ca 2+ se re-especialmente captado de nuevo en el retículo sarcoplásmico (SR) a través de la Ca2 + -ATPasa en SR (SERCA2a) o se extruye fuera de la miocitos a través del intercambiador Na + 2 + / Ca y el plasmalemmal Ca 2 + ATPasa 1,2. En consecuencia, la disminución de Ca 2+ citosólico instiga a cambios conformacionales de filamentos delgados de nuevo a su estado original, lo que resulta en la disociación de actina-miosina y la relajación de los miocitos 1-3. En este esquema, la actividad de la SERCA2a se considera generalmente para determinar la velocidad de relajación del miocardio, ya que representa el 70 - 90% de eliminación citosólica de Ca2 + en la mayoría de las células del corazón de mamífero 1. Como tal, la manipulación anormal de Ca2 + por LTCC, RyR y SERCA2a, etc. ha sido considerado como los principales mecanismos de deterioro de la contractilidad y la relajación en el corazón enfermo 1-4.
2+ libre que funciona como el mensajero en cuentas de acoplamiento de la CE de alrededor del 1% del total de Ca 2+ intracelular y la mayoría de Ca2 + está obligado a Ca2 + intracelular tampones 5,6. Esto es debido al hecho de que varios de Ca 2 + tampones son abundantes en los miocitos cardíacos, por ejemplo, los fosfolípidos de membrana, ATP, fosfocreatina, calmodulina, parvalbúmina, miofibrilla TnC, miosina, SERCA2a, y calsecuestrina en la SR. 5,6,7. Entre ellos, la SERCA2a y TNC son los predominantes Ca 2+ tampones 5,6,7. Además, Ca 2 + vinculante a sus buffers es un proceso dinámico durante contracción (por ejemplo, 30-50% de Ca 2 + se une a TnC y se disocian de ella durante Ca 2 + transitorios 7) y el cambio en el Ca 2+ causa adicional de unión "liberar" de Ca2 + libre en el citosol, los resultados en las alteraciones del Ca2 + intracelular concentration. En consecuencia, la perturbación del nivel intracelular de Ca2 + induce movimientos anormales myofilament, que son los precursores de la disfunción contráctil y arritmias 8,9. Muchos factores (tanto fisiológicas como patológicas) pueden ser las fuentes de modificaciones post-transcripcional de proteínas myofilament, que influyen en myofilament Ca 2+ búfer y myofilament Ca 2 + sensibilidad 8-10. Recientemente, se informó de que las mutaciones en las proteínas myofilament aumentan el Ca2 + intracelular y la afinidad de unión de manipulación de Ca2 +, lo que provocó la potenciación dependiente de pausa de Ca 2 + transitorios, la liberación anormal de Ca2 +, y arritmias 8. De acuerdo con este concepto, también hemos demostrado que los miofilamentos de Ca2 + desensibilización en corazones de ratas con hipertensión secundaria a la regulación de la óxido nítrico sintasa neuronal se asocia con diastólica elevada y sistólica niveles de Ca2 +11, que a su vez, aumenta la vulnerabilidad de la LTCC a Ca 2 + -dependiente de inactivación 12. Por lo tanto, la sensibilidad de los miofilamentos de Ca2 + es un regulador "activa" de la homeostasis intracelular y la función contráctil de los miocitos Ca 2+. Se ha hecho necesario para analizar las interacciones entre los miofilamentos y Ca 2+ manejo de proteínas para la investigación a fondo de los miocitos CE acoplamiento y la función cardiaca.
A continuación, se describe un protocolo que evalúa los cambios en la sensibilidad de los miofilamentos de Ca2 + en los miocitos cardíacos aislados. Análisis exhaustivo de perfil intracelular de Ca2 +, la sensibilidad y la contracción de los miofilamentos de Ca2 + se desvela los nuevos mecanismos de la mecánica miocárdica subyacente.
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Protocol
El protocolo está de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de la Salud de la ONU (NIH Publication No. 85-23, revisada en 1996). Fue aprobado por el Comité Institucional de animales Cuidado y Uso (IACUC) de la Universidad Nacional de Seúl (aprobación del IACUC no .: SNU-101213-1).
1. Preparación de búfer (Materiales y Equipo de mesa)
- Preparar 300 ml de solución de aislamiento fresco en el día del experimento (en mM: NaCl, 135; KCl, 5,4; MgCl 2, 3,5; glucosa, 5; HEPES, 5; Na 2 HPO 4, 0,4; taurina, 20; pH 7,4 con NaOH).
- Preparar 100 ml de solución de almacenamiento fresco en el día del experimento (en mM: NaCl 120; KCl 5,4; MgSO 4 5; CaCl 2 0,2; de sodio-piruvato 5; glucosa 5,5; taurina 20; HEPES 10; manitol 29; pH 7,4 con NaOH).
- Preparar 1 litro de solución de perfusión (en mM: NaCl, 141,4; KCl, 4; NaH 2 PO 4, 0,33; MgCl 2, 1; HEPES, 10; glucosa, 5,5; CaCl 2, 1,8; manitol, 14,5; pH 7,4 con NaOH).
- Preparar 30 ml de solución de colagenasa 1 mediante la adición de colagenasa (1 mg / ml), la proteasa (0,1 mg / ml), albúmina de suero bovino (BSA, 1.67mg / ml), y Ca 2+ (0,05 mM) a 25 ml de aislamiento solución.
- Preparar 20 ml de solución de colagenasa 2 mediante la adición de colagenasa (1 mg / ml), BSA (1,67 mg / ml), y Ca 2+ (0,05 mM) a 16,7 ml de solución de aislamiento.
- Preparar 40 ml de solución de BSA mediante la adición de 0,4 g de BSA a 40 ml de solución de aislamiento. Separada 10 ml y 30 ml en dos vasos de precipitados. Añadir Ca 2 + a 30 ml de solución de BSA de modo que la concentración final de Ca2 + en la solución de BSA es de 1 mM.
2. Preparación para el aislamiento de miocitos ventriculares izquierda (LV)
- Transferir 8-12 ratas semanas de edad, macho Sprague-Dawley (SD) en jaulas de transporte no contaminantes de las instalaciones de animales a la sala de preparación y aislamiento.
- MARIDOcomer dos baños de agua a 37 ° C.
Nota: Utilice un baño de agua para el agua - depósito con camisa y los tubos de perfusión del sistema de perfusión Langendorff. Utilice el otro baño de agua para agitar troncos de tejido miocárdico con el fin de separar los miocitos individuales. - Añadir 5 ml y 3,3 ml de solución de BSA (sin Ca 2 +) a 25 ml de solución de colagenasa 1 y 16,7 ml de solución de colagenasa 2 para compensar el volumen a 30 ml y 20 ml, respectivamente.
- Añadir solución de aislamiento (100 ml) y solución de colagenasa 1 (30 ml) a la columna 1 (Col. 1) y la columna 2 (Col. 2) en el sistema de perfusión de Langendorff, respectivamente (Figura 1A).
- Oxigenar la solución de aislamiento y solución de colagenasa 1 en Col. 1 y Col. 2 a través del tubo de conexión de oxígeno en el sistema de perfusión Langendorff (Figura 1A). Del mismo modo, la solución de colagenasa de compuestos oxigenados 2 y la solución de BSA en el baño de agua en agitación con 100% de O 2 a través de latubo de conexión de oxígeno.
3. Aislamiento de miocitos LV
- Anestesiar una rata SD a través de inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (30 mg / kg) y confirmar el estado anestésico por toe pellizcos y la falta de retirada reflexión.
- Mover la rata a una bandeja de disección. En la posición de decúbito supino, asegurar las cuatro patas a los lados del cuerpo con cinta adhesiva.
- Aplicar incisiones axiales mediados de torácicos con tijeras quirúrgicas para abrir el pecho, asegurando de no dañar el corazón. Utilice otro par de tijeras limpias para diseccionar el corazón de los vasos de conexión (por ejemplo, superior e inferior vena cava, vasos pulmonares y aorta) y la membrana pericárdica 13.
- Dejar una porción de la aorta de una longitud suficiente (5-8 mm), sujetar la aorta con unas pinzas finas, y montar rápidamente la cánula del sistema de perfusión Langendorff dentro de 1 min (Figura 1A). Ate hilo de sutura 4/0 firmemente sobre la aorta.
- Desmontar el corazón digerido mediante la reducción de la aorta y la transfiere mediante la celebración de la aorta con una pinza en el matraz que contenía solución de aislamiento fresco (Figura 1Bi). Utilice unas tijeras finas y pinzas para cortar la mayor parte de la pared libre del VI (incluyendo el septo) en trozos más pequeños (~ 22 mm, la figura 1Bii).
- Transferir las piezas en un matraz que contenía colagenasa solución fresca caliente previamente oxigenada 2 (Figura 1Biii). Agitar durante 10 min. Mantenga la entrega de oxígeno a la solución de colagenasa que contiene miocitos-2.
- Mueva el miocito - suspensión a un tubo de centrífuga de 10 ml usando goteros con una pera de succión y añadir Ca 2+ - que contiene solución de BSA (1: 1 en volumen). Centrifugar a 30 g durante 2 min y descartar el sobrenadante. Vuelva a suspender el sedimento de los miocitos en 5 ml de solución de BSA. Centrífuga y desechar el sobrenadante.
- Dispersar los gránulos de miocitos y mantener miocitos en 10 ml de solución de almacenamiento de pre-oxigenada a TA (Figura 1Biv-vi).
- Repita los procedimientos (pasos 3.7 a 3.9) con el tejido LV restante en el matraz.
Nota: Mantenga la repetición de los procedimientos (pasos 3.7 a 3.9) de nuevo hasta que la mayoría del tejido LV desaparece para obtener un buen rendimiento de los miocitos. - Mantener los miocitos en solución de almacenamiento para 6-8 horas a RT hasta que el final de los experimentos.
4. Las mediciones simultáneas de Ca2 + intracelular transitorios y miocitos Contracción
- miocitos carga de voltaje con el éster de acetoximetilo Fura-2 de AM (2 M).
Nota: Realizar todos los procedimientos de carga y experimentos con miocitos cargados en un tubo oscuro (Figura 1Bvii).- Centrifuge la suspensión de miocitos (1 ml) a 2000 xg durante 10 seg. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento de los miocitos en 1 ml de solución de Tyrode con una baja concentración de Ca2 + (250 mM, Materiales y Equipos de mesa).
- Añadir Fura-2AM y poloxámero 407 (2 l), se dispersan suavemente la suspensión de miocitos, y mantener la mezcla a temperatura ambiente de (20 - 24º C) durante 15 minutos (Figura 1Bvii).
- Se centrifuga la mezcla durante 5 seg, desechar el sobrenadante y dispersar el sedimento de los miocitos en 1 ml de solución de perfusión que contiene 500 mM de Ca2 +. Después de 10 min, se centrifuga la mezcla durante 5 seg y descartar el sobrenadante.
- Añadir solución de perfusión fresco (500 mM Ca 2 +, 1 ml) y mantener el Fura-2AM - pellet miocitos cargado en esta solución para grabaciones.
- Medición de la contracción de los miocitos LV y Ca2 + intracelular
- Antes de grabar, llenar el tubo de perfusión que se ejecuta a través de unacamisa de agua con la solución de Tyrode, que es pre-calienta a 36 ° C
- Coloque unas pocas gotas de la Fura 02 a.m. - cargado suspensión de miocitos LV en la cámara de un microscopio de fluorescencia invertido durante 5 - 8 minutos. perfundir lentamente la solución de Tyrode (2.2 ml / min).
- Presione el botón "Inicio" en el panel frontal del estimulador digital para iniciar la estimulación de campo (2 Hz).
Nota: El voltaje de salida (10 V, 5 ms de duración) se aplica a los miocitos en la cámara a través de hilos de platino colocados a cada lado de la cámara.- Seleccione los miocitos que se contraen de manera estable (no se presentan los hiper o hipo-contracción) para la grabación.
- Ajuste el miocitos de elección en la posición horizontal del sarcómero sistema de detección basado en vídeo y ajustar el enfoque del microscopio para obtener imágenes óptimas de sarcómeros. Coloque la caja rectangular de color púrpura en la zona en que sarcómeros claras están claramente observadas hasta que el promediode longitud del sarcómero (pico rojo) muestra un pico agudo singular (Figura 2A, la imagen inferior).
- Registrar los cambios en la longitud del sarcómero en respuesta a la estimulación de campo (Figura 2 A y B).
Nota: Utilice los miocitos cargados dentro de 1 - 2 horas. - Ajuste de la abertura de la cámara de manera que el campo en el sistema de detección de sarcómero basado en vídeo es el tamaño del miocito (Figura 2A). Estimular el miocito con excitación a 360 nm / 380 nm y emisión a 510 nm (frecuencia de adquisición 1000 Hz). Grabar el acortamiento del sarcómero y la relación Fura2 AM con la estimulación de campo (Figura 2B).
5. Evaluación de la sensibilidad de los miofilamentos de Ca2 +
- Se promedian las longitudes del sarcómero y Ca 2 + transitorios en estado estacionario (10 - 20 restos) y trazar el bucle de fase plana de la relación de Fura-2 frente a la longitud del sarcómero de la misma miocitos (ambos con valor medidos y delta cambios; Figura 2C).
- En cada parcela, definir la relación Fura -2 a 50% de relajación (CE 50, Figura 2C). Comparar tanto el bucle y CE 50 de cada intervención.
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Representative Results
miocitos LV están aisladas de corazones normales e hipertensos de rata. Miocitos en forma de varilla con estrías claros (que representa sarcómeros) y contracciones estables en respuesta a la estimulación de campo se consideran ser los miocitos óptimas y se seleccionan para las grabaciones (Figura 2A). En el ejemplo mostrado en la FIGURA 2A, un Fura 2 a.m. RESORTE LV miocitos se coloca horizontalmente y la abertura de la cámara se ajusta para que el miocito ocupa la mayor parte del campo de la grabación y el área de fondo mínimo incluido. En el campo de la grabación, ajustar las dimensiones de la caja púrpura haciendo clic y arrastrando este cuadro en la pantalla del ordenador (a través del programa de grabación). Cuando la longitud media del sarcómero muestra un pico rojo sostenido, inicie la grabación (Figura 2A, la imagen inferior).
Tanto la longitud del sarcómero y Ca2 + intracelular transie nts (Fura-2 ratios) se registran simultáneamente del mismo miocitos (Figura 3A). Las huellas promedio de la longitud del sarcómero y transitorios de Ca 2 + se muestran en la Figura 3B. Individualmente, longitudes diastólica / sistólica del sarcómero, tiempo hasta el pico (PT), y el acortamiento del sarcómero se miden para investigar la amplitud y la dinámica de la contractilidad de los miocitos. Tiempo para 50% de relajación (TR 50) se analiza para evaluar la relajación del miocito. Del mismo modo, la presión sistólica y diastólica Fura-2 ratios (Ca 2 + transitorios), tiempo hasta el pico (PT) de Ca 2 + transitorios y constante de tiempo de decaimiento de Ca2 + transitorio (tau) se analizan para evaluar la contracción y la relajación de los miocitos (Tabla 1). En este ejemplo, las amplitudes de Ca 2 + transitorios se incrementan moderadamente en miocitos LV de una rata hipertensiva y la contracción se reduce moderadamente (Figura 3B y Tabla 1).
contenido "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Por otra parte, las relaciones entre la Fura - 2 y relación de la longitud del sarcómero (que indican el myofilament Ca 2 + sensibilidad de los miocitos LV) se representan en ambos simulados e hipertensos ratas ( . Figura 3C) el 2 Fura - trayectoria longitud del sarcómero durante la fase de relajación del miocito define un cuasi-equilibrio de citosol Ca 2 +, myofilament Ca 2 + vinculante, y la longitud del sarcómero 14, por lo tanto, la fase de relajación se compara entre los dos grupos. el desplazamiento hacia la derecha de la trayectoria en los miocitos del grupo hipertenso indica una respuesta myofilament reducido a Ca 2 + (Figura 3C). en consecuencia, el Ca2 + intracelular concentración requerida para un medio de relajación (CE 50) se incrementa (Figura 3C) , en referencia a los miofilamentos Ca 2+ -desensitization en la hipertensión.Figura 1. Procedimientos para el aislamiento de miocitos LV de corazón de rata. (A) El sistema de perfusión Langendorff utilizado para perfundir la solución de aislamiento en el corazón canulado a través de la aorta (inserción, imagen ampliada del corazón montado en el sistema de perfusión) (B) i - iii:. El corazón después de la digestión con una solución de colagenasa 1 y diseccionado tejido LV en un plato y el frasco (B) IV - VI:.. miocitos suspensión después de la adición de solución de colagenasa 2, pellet miocitos después de la centrifugación, y se resuspendieron pellets de miocitos en solución de almacenamiento (B) vii: incubación, incubar LV miocitos en Fura - 02 a.m. solución que contiene el aislamiento (2 M Fura 2 de la mañana, 250 mM de Ca2 + y con 2 l poloxámero 407); lavado, lavar miocitos LV con solución de aislamiento con 500 mM de Ca2 +; almacenamiento, mantener Fura-2 PM - miocitos cargados en LVsolución de aislamiento fresco que contenía 500 mM de Ca2 +. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Medición de acortamiento del sarcómero y la relación de Fura-2 (indicativo del nivel intracelular de Ca2 +). (A) Un diagrama del sarcómero, una imagen de un Fura-2 RESORTE LV miocitos y la longitud del sarcómero promedio (el pico de color rojo) se muestran en el equipo. En el panel inferior, la línea de negro es el promedio de cada línea horizontal de píxeles dentro de la región púrpura de interés. La línea azul son los mismos datos reducidos a cero en cada extremo. La línea roja es la transformada rápida de Fourier (FFT) espectro de potencia, que representa el número de señales de la FFT ha calculado. Una aguda peak significa una grabación sarcómero limpio. (B) registros simultáneos de la longitud del sarcómero y la relación de la Fura -2 en respuesta a la estimulación de campo (2 Hz). parcela (C) Eliminación plano de la relación de Fura 2 vs. longitud del sarcómero del mismo LV miocitos (tenga en cuenta que se analizan tanto la relación de la longitud real / Fura 2 y delta cambios en estos parámetros). CE 50 (relación Fura 2 a 50% de relajación, círculo indica la flecha) es la comparación cualitativa de la sensibilidad de los miofilamentos Ca 2+ entre los grupos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Los resultados representativos de los análisis de LV contracción de los miocitos en farsa y ratas hipertensas. (A) en bruto, de rastros sarcómero shortening y Fura - 2 Medición de la relación en los miocitos LV de farsa y ratas hipertensas (B) Promedio de los rastros de la longitud del sarcómero y Fura -. 2 señales. Parámetros analizados en las huellas promediados se muestran en la Tabla 1. (C) Fase parcelas de plano de la Fura - relación de 2 vs. longitud del sarcómero (tanto la longitud real y Fura - 2 de relación y delta cambios en estos parámetros) en los dos grupos . El bucle de trayectoria se desplaza a la derecha y CE 50 tiende a ser mayor en la hipertensión, lo que sugiere myofilament Ca 2+ desensibilización. PT, tiempo hasta el pico (s); Tau, constante de tiempo de decaimiento de Ca2 + transitorio (seg) (obtenido mediante el ajuste de la fase de decadencia del Fura - 2 relación con una función exponencial) .TR 50: la hora de 50% de relajación (seg). 
Haga clic aquí para ver una versión más grandede esta cifra.
| parámetros | Impostor | Hipertensión | |
| Ca2 + intracelular | Diastólica Ca 2+ | 1.189 | 1.124 |
| Sistólica Ca 2+ | 1.71 | 1.691 | |
| Amplitud (Δ ratio) | 0,521 | 0,567 | |
| Tiempo a pico (PT, s) | 0,021 | 0,031 | |
| Tau (s) | 0,079 | 0,076 | |
| sarcómero | diastólica | 1.758 | 1.78 |
| longitud del sarcómero (m) | |||
| sarcómero | 0,122 | 0,115 | |
| Acortamiento (dieciséis; longitud, mm) | |||
| Tiempo a pico (PT, s) | 0,064 | 0,055 | |
| Tiempo a 50% | 0,032 | 0.03 | |
| Relajación (TR 50, s) | |||
| CE50 | [Ca2 +] i (relación Fura-2) para el 50% relengthening sarcómero | 0.2382 | 0.3224 |
Tabla 1. Análisis de la Fura - 2 de relación de (Ca2 + intracelular) y mediciones de la longitud del sarcómero.
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Discussion
A continuación, describimos los protocolos para evaluar los cambios de la sensibilidad de los miofilamentos de Ca2 + en los miocitos cardíacos aislados única y hacemos hincapié en la importancia de medir este parámetro junto con las propiedades electrofisiológicas, intracelular de Ca 2 + transitorios, y la dinámica de los miofilamentos. Esto se debe a las grabaciones de uno o dos de los parámetros no pueden explicar los mecanismos subyacentes de la contracción cardíaca y la relajación. A diferencia de los métodos convencionales que miden la contracción de los miocitos y la intracelular perfil Ca 2+ individual 1, el presente método examina ambos parámetros simultáneamente en el mismo los miocitos cardíacos.
Una serie de métodos se utilizan generalmente para evaluar la sensibilidad de los músculos o miocitos 15,16,17, por ejemplo, el examen de las interacciones entre exógeno Ca2 + y sarcómero / longitud de la célula / tensión en los miocitos piel del myofilament Ca2 +(Tratado con detergentes tales como saponina o β-esin para permeabilizar la membrana). Las longitudes se miden con técnicas de difracción de rayos láser de fotodiodos y, y la tensión con transductores de fuerza o fibras de carbono). Estas técnicas son ampliamente utilizados en estudios musculares, ya que permiten la evaluación cuantitativa de la sensibilidad myofilament Ca 2 +. Sin embargo, las actividades de canales iónicos endógenos en la membrana plasmática y el manejo intracelular de Ca2 +, aquellos son necesarios para iniciar la mecánica de los miofilamentos, se descuidan en estas técnicas. Además, las tiras musculares o miocitos en estudio son pre-estirado a una cierta longitud diastólica, y en estas condiciones, la longitud inicial del sarcómero pueden diferir de la longitud diastólica real de los miocitos (especialmente en condiciones de la enfermedad y con intervenciones). Esto pone de relieve la ventaja de la medición actual, donde los orgánulos celulares se mantienen relativamente sin perturbar, por lo tanto, lo que permite la eva integralación de la función de los miocitos contráctil.
Comprensiblemente, la calidad de los miocitos (Ca 2+ -tolerating) y la carga óptima de Fura - 2AM son dos elementos clave para el éxito de la evaluación de la sensibilidad de los miofilamentos de Ca2 +. En consecuencia, varias modificaciones se aplican al protocolo con el fin de obtener los miocitos viables con forma de varilla (60 a 80% del total de células, como se describió previamente 18,19,20). En primer lugar, se añade una dosis baja de Ca 2 + a las soluciones durante los procesos de digestión (por ejemplo, la concentración de Ca2 + es de 50 M en las soluciones de colagenasa y 200 mM en la solución de almacenamiento). En segundo lugar, durante el proceso de la digestión, la BSA se añade a las soluciones de colagenasa para mejorar la estabilidad de la membrana. En tercer lugar, la mayoría de las soluciones se oxigenada durante el aislamiento, lo que mejora el porcentaje de miocitos funcionales y la duración de los experimentos (6-8 h). En cuarto lugar, los miocitos aislados se mantienen en almacenamiento de la solución containing 200 mM de Ca2 +.
Para obtener la carga óptima con Fura 2 a.m., dos Ca 2+ concentraciones diferentes (250 y 500 mM) se utilizan y poloxámero 407 (2 l, 20% preparada en sulfóxido de dimetilo) se añade para mejorar la permeabilidad de Fura-2AM través de la membrana y su estabilidad en los miocitos. Cabe señalar que todos Ca 2+ colorantes indicadores son Ca 2 + buffers 21. Por lo tanto, los investigadores deben evitar el uso de una alta concentración de Fura-2 AM o de una incubación más largo para evitar el almacenamiento excesivo y la reducción de la contractilidad de los miocitos. Se recomienda que la contracción de los miocitos sin Fura - 2 de carga se comprueba rutinariamente, que es un paso esencial para estimar la calidad de los miocitos y el estado de carga. La variabilidad en la carga es inevitable. Por lo tanto, es importante comprobar la variabilidad de la contracción de los miocitos, específicamente, si el número de contraer miocitos en la cámara es similar antes y unaespués de carga. Análisis de los miocitos hiper o hipo-contratante debe evitarse, ya que no representan el estado promedio de los miocitos y pueden causar resultados sesgados y evaluaciones.
Cabe señalar que los cambios medidos en la relación de Fura 2 son reflejos de la intracelular nivel de Ca2 +, en lugar de la concentración química real de Ca2 +. Por lo tanto, el método descrito aquí evalúa los cambios cualitativos de sensibilidad myofilament Ca 2 +, en lugar de la sensibilidad real de los miofilamentos al Ca 2+. Calibración de Fura - 2 de señal a la concentración intracelular de Ca2 + es la solución a adquirir fiables concentraciones de Ca2 + en miocitos individuales. El procedimiento de calibración requiere miocitos de carga con varias concentraciones de Ca 2+ conjugada Fura - 02 a.m. (Ca 2+ concentración que varía desde 0 hasta 39 mM), y el Fura obtenido - 2 relaciones se calculan con THe siguiente fórmula: [Ca2 +] i = Kd * (R - Rmin) / (Rmax - R) * F380max / F380min 21. Es posible derivar los valores medios combinados de Ca 2 + concentraciones a través de un procedimiento de este tipo de calibración. Sin embargo, debido a que la carga de los indicadores de Ca 2 + es variable entre los miocitos y la calibración no se realiza en una célula individual, Ca 2+ concentraciones pueden no ser adquiridos con precisión. Además, si F360 / F380 se mide en lugar de F340 / F380 (como en el presente estudio), la relación de Fura 2 es menos precisa (porque F360 es la longitud de onda isobéstica de Fura-2 fluorescencia 22). Sin embargo, todavía es un método válido para evaluar los cambios cualitativos en la sensibilidad myofilament Ca 2 + en experimentos fisiológicos, especialmente en los corazones humanos enfermos, donde miofilamentos pueden alterarse de forma concomitante después de los cambios en el medio ambiente intracelular. Se recomienda que este método se combina con métodos alternativos (como dedescrito anteriormente en la sección de Discusión) para analizar con precisión la verdadera sensibilidad de los miofilamentos al Ca 2+.
La otra limitación del método en el estudio de contracción de los miocitos es la condición sin carga. Puede subestimar o sobreestimar los cambios en la sensibilidad de los miofilamentos de Ca2 +. Por lo tanto, para evaluar con precisión la sensibilidad de los miofilamentos de Ca2 +, el análisis debe realizarse con medidas alternativas para la evaluación tanto cualitativa como cuantitativa.
La técnica es aplicable para evaluar la función miocárdica en corazones sanos y enfermos, incluyendo muestras cardíacas humanas, donde se cambian el medio ambiente redox celular y modificaciones post-transcripcional, lo que resulta en alteraciones concomitantes en las funciones de los miofilamentos. En particular, los canales iónicos, la homeostasis iónica intracelular y proteínas reguladoras en miofilamentos son interactivos; Por lo tanto, todos estos componentes funcionan de concert para determinar el rendimiento del corazón in vivo (por ejemplo, como se mide en la ecocardiografía).
En conclusión, se describe un método para evaluar los cambios en la sensibilidad de los miofilamentos de Ca2 + y hacemos hincapié en la importancia de analizar este parámetro junto con la electrofisiología cardiaca, el manejo intracelular de Ca2 +, y la contracción de los miocitos para obtener un perfil completo de la función de los miocitos. Sensibilidad myofilament Ca 2 + se debe medir de manera rutinaria en estudios mecanísticos utilizando modelos corazón enfermo, donde los cambios en estos parámetros, así como diversas vías de señalización intracelular son relacionados entre sí.
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Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el Programa Básico de Investigación de Ciencias a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (2013068067); por el Programa de Graduados Cerebro Corea 21 del Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología, el Hospital de la Universidad Nacional de Seúl, la Sociedad Coreana de Hipertensión (2013), el Fondo de Investigación de SK Telecom de Corea (n. ° 3420130290) y de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (SNCF 31460265; SNCF 81260035).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dawley rat | Koatech | 8-12 weeks | |
| Pentobarbital Sodium | Hanlim Pharmaceutical (Korea) | AHN901 | Insurance code:645301220 |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | |
| Mannitol | Sigma | M4125 | |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Taurine | Merck | 8.08616.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | |
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | |
| Protease | Sigma | P6911 | |
| Fura-2 (AM) | Molecular Probes | F1221 | |
| Pluronic F127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Shaking Water Bath | Chang Shin Scientific | Model: C-108 | |
| IonWizard Softwae Suite | IonOptix Ltd | Experimental Builder | Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes |
| Myocyte Calcium & Contractility Recording System | IonOptix Ltd | ||
| Circulating Water Bath | BS-Tech | BW2-8 | |
| Myocyte Fluorescence Microscope | Nikon | DIATPHOTO 200 | |
| MyoCam-S Power | IonOptix | ||
| Fluorescence & Video Detection | IonOptix | MyoCam-S | |
| CFA300 | |||
| PMT400 | |||
| Fluorescence & System Interface | IonOptix | FSI700 | |
| Excitation Light Source | IonOptix | mSTEP | |
| High intensity ARC Lamp Power supply | Cairn Reseach | ||
| Filter wheel controller | IonOptix | GB/MUS200 | |
| Digital Stimulator | Medical Systems Corportion | S-98 Mutimode | |
| Compositions of Experimental Solutions | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 135 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 5 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5 |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 3.5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | Concentration (mmol) 0.4 |
| Storage Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 120 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.2 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 29 |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | Concentration (mmol) 5 |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | Concentration (mmol) 5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 141.4 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 4 |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Concentration (mmol) 0.33 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1.8 For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 1 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 14.5 |
| Collangenase Solution 1 | |||
| Isolation Solution (30mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| Protease | Sigma | P6911 | Concentration (mmol) 0.1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| Collangenase Solution 2 | |||
| Isolation Solution (20mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| BSA solution | |||
| Isolation Solution (40mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | Concentration (mmol) 400 mg |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1mM |
References
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