Abstract
HIV-1, yapısal bir protein, Pr55 Gag (veya Gag) virüs montaj sırasında hücrelerin plazma zarına bağlanmaktadır. Gag bağlayıcı Membran viral parçacık üretimi ciddi bozulmaya Gag membran bağlama sonuçlarında bir kusur beri virüs parçacık oluşumu için önemli bir adımdır. Gag-lipid membran etkileşimlerin mekanik ayrıntıları elde etmek için, in vitro yöntemler, NMR protein ayak izi, yüzey plazmon rezonansı, lipozom flotasyon santrifüj veya floresan lipit boncuk göre, şimdiye kadar geliştirilmiş bağlanma. Bununla birlikte, bu, in vitro yöntemler, her birinin kısıtlamaları vardır. Bu sınırlamaların bazılarının üstesinden gelmek ve daha önce kurulmuş yöntemleri tamamlayıcı bir yaklaşım sağlamak için, biz HIV-1 Gag ve lipid membranların arasındaki etkileşimleri bir "hücre benzeri" bir ortamda gerçekleştiği in vitro testi geliştirdi. Bu testte, Gag lipid zarlar bağlanabilen görsel YFP tagge kullanılarak analiz edilird Gag buğday sentezlenen vitro çeviri sistemi ve bir electroformation tekniği ile hazırlanan GUVs içinde germ-merkezli. Burada arka plan açıklamak ve protokoller tahlil için gerekli miristoillenmiş tam uzunlukta Gag proteinleri ve GUV membranlar elde etmek ve mikroskopi ile bağlayıcı Gag-Şef algılamak için.
Introduction
İnsan bağışıklık yetersizliği virüsü tip 1 (HIV-1), çoğu hücre tiplerinde de toplanır ve plazma membranı (PM) ile ilgili tomurcukları zarflı bir virüstür. HİV-1 virüs parçacıklarının montajı Pr55 GAG (GAG) olarak adlandırılan 55 kDa viral çekirdek proteini ile tahrik edilir. Gag dört ana yapısal alana, yani, matris kapsid nükleokapsid ve P6, ve iki aralayıcı peptit SP1 ve SP2 arasında oluşan bir ön-madde poliprotein olarak sentezlenir. Montaj sırasında, matris (MA) etki montaj sitesine Gag hedeflenmesi sorumludur, kapsid (CA) etki Gag-Gag etkileşimlerini aracılık, nükleokapsid (NC) etki viral genomik RNA acemi ve p6 acemi ev sahibi faktörler yardım plazma membran virüs partikül kesme. Gag aynı zamanda, N-terminal ucunda bir 14-karbonlu yağlı asit ya da miristat parçasının ilave edilmesi ile bir ko-translasyonel modifikasyon maruz kalır.
Gag bağlayıcı Membran m beri viral montaj için temel bir gerekliliktirbağlama zarda arızalı utants virüs parçacıkları üretmek için başarısız olur. çift katlı lipid ve son derece temel bir bölge olarak adlandırılan MA etki alanı içinde temel kalıntıların bir küme (hidrofobik etkileşimler aracılık N-terminal miristat yarımı: Biz ve diğerleri MA etki alanı içinde ikili sinyaller aracılık Gag bağlanmasının o zarı göstermiştir PM 1-4 asidik lipidler ile etkileşime HBr). Polyphosphoinositide 5-fosfataz IV (5ptaseIV), AM-özel bir asidik fosfolipid phosphatidylinositol- hidrolizini katalize eden bir enzim, ektopik ekspresyonu ile Gag-membran etkileşim çalışmalar (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P2] fosfatidilinositol-4-fosfat, hücrelerde Gag-PM localisation PI (4,5) P2 3,5 aracılık ettiğini göstermiştir. Bununla birlikte, in vitro çalışmalar, gag-PI (4,5) P fazla mekanik detayları kavramaya yönelik 2 etkileşimlerinin bir takım nedenlerden için zor olduğu kanıtlanmıştır. İçinÖrnek biyokimyasal deneyler için tam boyda saflaştırılması miristoillenmiş HIV-1 Gag bağlı saflaştırma sırasında agregasyon GAG eğilimi en azından kısmen, teknik olarak zor olmuştur. Dolayısıyla, bu tür Myr-MA ya Myr-MS-CA, ya da olmayan miristoillenmiş form olarak, HIV-1 Gag kesilmiş biçimleri sık sık, Gag saflaştırmayı gerektirmektedir çalışmalarda kullanılmıştır (örneğin, nükleer manyetik rezonans, bir protein ayak izi ve yüzey plazmon rezonans 6-9). Seçenek olarak ise, in vitro transkripsiyon için reaksiyonlarda bağlanmış diğer biyokimyasal çalışmalar 1,2 tam uzunluktaki miristoillenmiş HIV-1 Gag üretilmesi için kullanılmıştır. Tipik haliyle, bu sistemde, bir GAG kodlayan plazmid transkripsiyonu ve herhangi bir hücresel membranlar ve haberci RNA yoksun transkripsiyon ve çeviri için makine içeren ökaryotik hücre lizatları (örneğin, tavşan retikülosit lizatları) ile çevrilmiştir. Tepkimeden sonra, Gag içeren hücre lizatları bana karıştırılırlipidler ile Gag etkileşimlerin analizine mbranes. Gag miristoillenmiş tam uzunluktaki hazırlama kolaylığı ile birlikte, in vitro transkripsiyon için sistemi kullanan yöntemler Gag sentezi ve takip eden membran bağlanma reaksiyonları daha fizyolojik koşulları temsil edebilir bir "ökaryotik sitosol benzeri 'ortamda meydana gelen bir avantaja sahiptir. Bu özellik MA etki bağlı RNA molekülleri Gag rekabetçi bir şekilde 1,2,10-12 asidik lipidler bağlanmasını düzenleyen olduğunu gösterdi çalışmalara katkıda bulunmuştur. Bu hücre lizatları elde Gag proteinleri toplam miktarı, yüksek değildir Ancak, radyo-etiketli amino asitler protein metabolik etiketleme bunların saptanması için gereklidir.
yöntemine bağlı olarak gag-lipit etkileşimi ölçmek için, membran preparatları çeşitli kullanılmıştır. Bu yöntemlerin her biri kendi güçlü ve sınırlamaları vardır. En NMR bazlı deneyler, kısa asil lipidlerin kullanımını gerektirirsuda çözünen (örneğin, C4 ve C8-PI (4,5) P2) 6,8 olan zincirler. NMR yöntemler geliştirilmektedir hücrelerde bulunan uzun bir asil zincirine sahip lipidler GAG bağlanma test ederken, şu ana kadar 8,13 yalnızca miristoillenmiş veya nonmyristoylated MA kullanılmıştır. Seçenek olarak ise, yerel uzunlukta açil zincirlerine sahiptir lipidlerden hazırlanan lipozomlar, örneğin lipozom yüzdürme veya floresan lipozom boncuk bağlama analizleri 2,3,10,14-16 biyokimyasal yöntemler kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu deneylerde kullanılan lipozomlar, küçük çaplı, ve böylece de bunların membranlar, dik ve pozitif eğriliğe sahiptir. Bunun aksine, HIV-1 ile enfekte olmuş hücrelerde partikül tertibatının erken aşamasında, Gag yaklaşık GAG ölçekte düzlemsel PM, bağlanan ve daha sonra filizlenen sırasında negatif bir eğrilik indükler. Bu nedenle, dik ve pozitif eğrilik ile lipozom membranlar Gag-lipit etkileşimleri çalışmak için ideal bir lipit bilayers olmayabilir. Lipozom flot gelinceation deneyleri, başka potansiyel ihtar deneysel sonucunu etkileyebilecek santrifüj sırasında hipertonik sakaroz degrade Gag-lipit komplekslerinin olduğu maruz kalmasıdır. Bu sınırlamaları azaltmak ve tamamlayıcı bir deneysel sistem sağlamak için, Gag dev tek lamelli vesiküller (GUVs) bağlanma için deneyler, son yıllarda geliştirilmiştir. GUVs çapları onlarca mikrometre büyüklüğünde uzanır, tek iki tabakalı vesiküllerin husule bulunmaktadır. Böylece, bu membranların eğrilik Gag ölçeğinde PM benzer. Üstelik, optik mikroskoplar altında görsel denetim sağlayan büyük boyutu, membran kolayca Gag-lipit komplekslerinin sonraki işlem olmadan tespit edilebilir karıştırma üzerine bu veziküller floresan etiketli veya etiketli Gag bağlayıcı proteinlerin.
Burada, bir electroformation yöntemiyle elde GUVs kullanarak bağlama, HIV-1 Gag membran incelemek için bir protokol açıklar. Böyle nazik hidrasyon, jel destekli hidrasyon, mikrofon olarak çeşitli yöntemlerrofluidic püskürtme ve electroformation 17-22 GUVs elde edilmesi için kullanılmıştır. Burada tarif edilen protokol için, electroformation yöntemi asidik lipidler ve pahalı düzeneklerinin gerek kalmadan kullanılması da göreli kolaylıkla GUVs oluşturulmasında öncelikle kendi verimliliği kullanılır. GAG görselleştirme bir flüoresan raportör zorunlu kıldığı için, sarı floresan proteini (YFP) genetik GAG (gag-YFP) C-terminaline ilave edilmiştir. Gag-YFP proteinleri sürekli değişimi sürekli akışı (CECF) teknolojisine dayalı buğday tohumu lizatlarında in vitro transkripsiyon ve çeviri reaksiyonları ile elde edilir. Bu teknolojide, tepki ve reaksiyon, substrat ve enerji bileşenlerinin besleme önleyici yan her iki kaldırma, bir diyaliz tabanlı bir mekanizma elde edilir. Bu reaksiyonlar için, bir T7 promoterinin kontrolü altında gag-YFP kodlayan bir plazmid kullanılır. Daha önce gösterildiği gibi notun, buğday tohumu lizatları ek bileşenler 2 olmadan miristoillenmesi destek3,24. Bu yöntemi kullanarak, GUV zarları 24 Gag görselleştirilmesi için gag-YFP miristoillenmiş tam boy yeterli miktarlarda elde etmek mümkün olmuştur. Burada, HIV-1 Gag PI bağlanma hangi bir protokol açıklar (4,5) P2 GUV membranları ihtiva-eden bağlanma reaksiyonları, aşağıdaki ve bu yöntem, bağlanma tahlilleri, önceden var olan gag-membran tamamlar ve olabilir teklif uzun sonradan bir işleme tabi tutulmadan incelenebilir ek bağlanma HIV-1 Gag-membran anlamak için genişletilmiş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Gün: buğday tohumu Lizat tabanlı In Vitro Transkripsiyon-çeviri Sisteminin Kullanılması Gag Proteinlerin İfadesi
HIV-1 Gag hazırlanması 1.
- (-20 ºC diğer reaktifler buğday tohumu lizatları -80 ºC 'de saklanır) dondurucular ticari buğday tohumu CECF kiti tüm reaktifleri çıkarın. Buz üzerine çözülme ve Tablo 1 'de gösterildiği gibi, bileşenler karışımı.
| Mix-1 (Besleme mix) | |
| besleme çözümü | 900 ul |
| Amino asitler | 80 ul |
| metionin | 20 ul |
| Genel Toplam | 1000 ul |
| Karışım-2 (Lizat mix) | |
| wheatgerm lizatları | 15 ul |
| RNaz ücretsiz su | 7 ul |
| Amino asitler | 4 ul |
| metionin | 1 ul |
| TE tamponunda Plasmid DNA (1 ug / ul) ** | 4 ul |
| Reaksiyon tampon Maddesi | 15 ul |
| RNasin * | 4 ul |
| Genel Toplam | 50 ul |
Tablo 1: buğday tohumu reaksiyonları için gerekli olan karışımların bileşimler.
Not: Deney bağlayıcı Gag zar üzerinde RNaz RNA çıkarılması etkisini incelemek üzere tasarlanmış ise, RNaz içermeyen su ile ribonükleaz inhibitörleri değiştirin. Plazmid DNA, üretici talimatlarına uygun olarak yabancı maddelerden arındırılmış olmalıdır. Bununla birlikte, slasmids alışılmış kullanılarak hazırlandı, ancak endotoksin içermeyen plazmit izolasyonu teçhizatı başarılı bir şekilde kullanılmıştır değildir. Üreticinin talimat da nükleaz içermeyen suda çözünmüş DNA kullanılmasını önerir. TE [10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA ihtiva eden (pH 7.4)] içinde süspanse edilmiş DNA kullanılarak durumunda, TE içinde EDTA verim etkileyebilir, çünkü DNA daha düşük konsantrasyonlarını kullanmayın. 0.8-1 mg / ml bir konsantrasyon aralığında TE tamponu içinde çözülmüştür plazmid başarıyla kullanılmıştır.
- İlk reaksiyon kaset (saydam odacık) içine Besleme karışımı (Mix-1) ekleyin. Sonra diğer odasının (kırmızı) için lizat karışımı (mix-2) ekleyin. kendi odalarına karışımları eklerken bu çözüm bileşenlerinin verimsiz alışverişi yol ve bu nedenle reaksiyon etkinliğini azaltabilecek herhangi bir kabarcıkları tanıtmak etmeyin.
- kiti ile sağlanan yapışkan film ile odaları kaplayın.
- Kaset tutucu ve doğmuş iyileşmesini içine reaksiyon kaset takınte bir Eppendorf Termomikserin R. 900 rpm sabit sallayarak hızında 24 ° C'de 24 saat süreyle montaj
2. Gün: Electroformation ve Hasat buğday tohumu Lisatlardan hazırlayın GUVs
GUVs 2. hazırlanması
- Böyle teflon gömlekleri ile kaplı ve Parafilm ile sarılmış, vidalı kapakları cam şişelere kloroform veya kloroform karışımları ve metanol gibi inorganik çözücüler içinde çözünmüş Kısım lipidler. Hamilton-tipi cam şırınga ile lipidler Kulp, ya da varsa, kloroform dayanıklı plastik ipuçları. -20 ºC dondurucu GUV hazırlanması için kullanılacak lipit içeren cam şişeleri dışarı atın.
- Şişeler oda sıcaklığına dengelenir sonra, lipid süspansiyonlar açık görsel inceleme ile emin olun. Bu palmitoil-oleoil fosfatidilserin (POP) ve PI (4,5) P2 gibi lipitler, özellikle asidik lipidler, kalitesi, başarılı bir şekilde deneyler için önemlidir. olan lipidler kullanmayındaha uzun bir süre, 2 ay boyunca parçalar halinde.
- istenen sıcaklığa ısı bloğu önceden ısıtmak. Bu sıcaklık en Tm lipid (ler) in erime sıcaklığı (Tm) en az 5 ° C daha yüksek olmalıdır.
- İstenilen molar lipit oranlarına göre ihtiyaç duyulan lipid hacimleri hesaplayın. Tablo 2'de gösterildiği gibi, burada bağlama HIV-1 Gag eğitim için aşağıdaki molar oranları kullanın.
| lipid karışımı | Molar oran | Hacim (ul içinde) | stok konsantrasyonu |
| POPC + kol POPS | 46,6 + 23,3 + 30 | 19,74 + 10,18 + 6,57 | POPC, POPS, Kol: 10 mg / ml |
| POPC + POPS + Chol + Beyin-PI (4,5) P2 | 16,11 + 8,3 + 6,25 + 58,19 | POPC, POPS, Kol: 10 mg / ml | |
| Beyin-PI (4,5) P2: 1 mg / ml |
Tablo 2: Farklı lipit Birimleri GUVs elde etmek için kullanılır.
- Temiz vidalı kapaklı bir cam viyal içine lipidlerin, istenen miktarlar ekleyin.
- Kullanım (katalogda tarif edildiği gibi) boyutlarında 25 x 50 x 1,1 mm 3 ve direnç 70-100 omega slaytlarını ITO kaplı. Temiz bir bankta iki ITO kaplı slaytlar yerleştirin. Her electroformation bölmesi iki indiyum-kalay-oksit (İTO) kaplı cam slaytlar gerektirir. cam slayt iletken yan bir multimetre kullanarak direnç kontrol ederek yukarı baktığından emin olun. Yaklaşık 200 Ω değeri göstermesi gerekir. slaytlar yüzeyi hafifçe havsız mendil kullanarak% 70 etanol ile silerek temiz olduğundan emin olun.
- ri ile şırınganın iğne dış yüzeyi temizlemekloroform ile nsing ve ısı bloğu üzerine şırınga yerleştirin.
- yukarı bakacak şekilde iletken tarafı ısı bloğu üzerinde yeni bir ITO-kaplı cam slayt yerleştirin ve genellikle istenilen sıcaklığa yaklaşık 2-3 dk gelmesini sağlayınız. cam slaytlar İTO kaplama prosedürleri temizlik esnasında hasar görmüş olabilir o potansiyel bir risk için ITO-kaplı cam slaytlar tekrar kullanmayın.
- üniforma ve cam slayt lipitlerin yayılması henüz hızlı için her slayt için lipit karışımı 40-50 ul hacmi kullanın. kloroform gibi uygun bir organik çözücü ile toplam hacmi ayarlayın.
- Cam slayt lipid karışımın toplam hacminin yarısına yerleştirin ve hemen (slaytta iğne 2-3 kez hareketli) muntazam bir lipid filmi terk etmek için temizlenir şırınga (aşama 2.6) kullanarak lipid yayıldı. İnce İTO kaplama zarar görmemesi için yavaşça (ama hızlı bir şekilde) lipit sürün. Düzgün olmayan yayma ya da sub-optimal yol açabilir yayılan kabaverimleri veya GUVs hesaplama heterojen.
- Bu nedenle, sonraki adıma geçmeden önce yayılmış lipit filmi inceleyerek üniforma yayılmasını sağlamak. Filmin donukluk aşırı olmayan üniforma belirirse, yeni bir slayt kullanarak işlemini tekrarlamanız.
- kaplanmış yüzü yukarı bakacak şekilde bir Petri kabı içine kaplı slayt yerleştirin.
- Tekrarlayın başka ITO kaplı slayt kullanarak karışımın geri kalanı için 2.6-2.9 adımları tekrarlayın.
- Organik çözücülerin arındırıldı 60-90 dakika boyunca geleneksel bir vakumlu kurutma bölmesi içinde kayar her ikisini ihtiva eden bir petri tabağına yerleştirin.
- Bu işlem sırasında, ısıtma bloğu (çoğu durumda 65 ° C) ve önceden sıcak 300 mM inkübatör sukroz çözeltisi ile aynı sıcaklığa inkübatör ayarlayın.
- Kuruduktan sonra, tezgah petri getirmek ve temiz bir yüzeye cam slayt yerleştirin.
- Yavaşça% 70 etanol ve kuru o Comple kullanarak bir PDMS conta (Şekil 1) temizlemektely.
- Şekil 1 'de gösterilen ve yavaşça ve sıkıca conta şekilleri bir su geçirmez sızdırmazlık böylece pres lipid kaplı cam slayt üzerine yerleştirin. PDMS conta ve slayt arasındaki boşlukların olmaması onaylayın. Bu sakroz çözeltisi sahip sığ bir bölme oluşumu ile sonuçlanır.
Şekil 1:. Electroformation için kullanılan ITO kaplı cam slayt düzeni bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- herhangi kabarcığı olmadan önceden ısıtılmış sakaroz çözeltisi ile odasına doldurun.
- sıkı bir mühür yapmak için üstüne başka kaplı slayt yerleştirin. hava kabarcığı olmadığından emin olun. Son montaj Şekil 2'de gösterildiği gibi. Görünür bölmesi usin sabitleyin olmalıdırg bağlayıcı klipleri.
Şekil 2:. Electroformation odasının (yandan görünüm) şematik gösterimi bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Aspirasyon ile aşırı sukroz çıkarın ve tüy bırakmayan bir mendil kullanarak slaytları temizleyin. iletken taraf bar üniforma temas böylece bakır bara slaytlar sabitleyin. cam slayt sadece bir iletken tarafı bir bakır çubuk ile temas halinde olduğundan emin olun.
- timsah klipleri kullanarak fonksiyon jeneratörü çıkışına bakır çubuğu bağlayın. Montaj istenen sıcaklığa gelmesini sağlamak için inkübatör içinde grubunu yerleştirin.
- 10 Hz, sinüs dalga frekansı ve 90 dakika için 1 V'lik bir potansiyel farkı uygulanması. ensurŞekil 3 'de gösterildiği gibi gerilim multimetre 1 V e. 90 dakika süreyle işleme devam edin.
Şekil 3:. Multimetre gelen elektrotlar sıklığını ve akımı ölçmek için yerleştirilir hangi pozisyonları bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- 90 dakika sonra, yavaşça 2 Hz azaltılması ve başka bir 10 dakika daha electroformation devam edin. Bu süre boyunca, nitro için reaksiyonlarda hasat (3.1-3.2 adım).
- fonksiyon jeneratörü kapatın ve montaj (inkübatör kapatarak ve biraz açılmış inkübatör kapı bırakarak) yavaş yavaş oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
- Soğuduktan sonra, jeneratör kabloları çıkarınslayt meclisleri. GUVs çok kırılgan olması ve bu nedenle de çok yavaşça ele alınması gerekir. Dikkatle tezgah derleme getirmek.
- yavaşça forseps kullanarak üst slayt kaldırarak odasına sökün. temiz bir tüpe bir kesim 1,000 ul ucu ve transfer kullanarak sükroz süspansiyon içeren GUVs hasat. GUVs aksamaması için tüp hafifçe tutun.
- Hemen GUVs kullanın. Oda sıcaklığında depolandığında GUVs hasattan sonra en az 90 dakika boyunca stabildir.
3. Hasat İn Vitro Çeviri Reaksiyonları
- Bir tüp içine mikropipet kullanarak kırmızı odasından istenilen proteinleri içeren in vitro çeviri reaksiyonlar hasat.
- , Toplu proteinler kaldırmak bir masaüstü santrifüj üzerinde 15 dakika süreyle 16,200 xg'de lizatları dönmeye ve dikkatli bir tüp içine süpernatant aktarmak için.
4. GUV Bağlanma Tahlili
- bir kesim ucu kullanarak, 5 mix1 'dir; çevrilmiş proteinlerin bir tüp içinde GUVs 5 ul ihtiva eden in vitro çeviri reaksiyonlar, L ve 2-3 dakika için oda sıcaklığında inkübe edin.
- Temiz bir kapak kayma küçük bir delik (3-4 mm çapında) bir PDMS levha takın ve hafifçe ve sıkıca lamel karşı basarak sıkı sızdırmazlık sağlamak.
- küçük deliğe adım 4.1 10 ul karışımı yerleştirin.
- Resim oda sıcaklığında ters epi veya konfokal floresan mikroskobu altında karışımı ile gerçekleştirilmektedir.
Not: buharlaşmasını önlemek için, görüntüleme odası, bir lamel ile kaplı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıdaki protokolü kullanarak, POPC + POPS + Chol oluşan GUVs hazırlanan (: 4.66: 2.33: mol oranında 3). Bu bileşim, yaklaşık PM PS ve kolesterol konsantrasyonları yansıtacak şekilde seçildi. Beyin-PI (4,5) P2 POPC + POPS + Kol karışımın içine dahil edildiğinde Sağlam ve Gag bağlayıcı verimli yalnızca gözlendi (POPC + POPS + Chol + beyin-PI (4,5) P2 [molar oran 4: 2: 3: 1] örnekte) (Şekil 4, A ve C) panel B ve D karşılaştırın. POPC + oluşan GUVs bağlanma gag-YFP + Chol + beyin PI (4,5) P2, membran yüzeyinde flüoresan yoğunluğundaki artışı belirgindir çıkar. Bu artış, aynı zamanda GUV sınır (Şekil 4C, D XX ') geçen bir çizgi boyunca floresans yoğunluğu bulunmaktadır (Şekil 4, alt) görülebilir.
yük / 54293 / 54293fig4.jpg "/>
Şekil 4:. Gag beyin PI (4,5) P2 GUVs -contianing POPC + Pops + Chol (A ve C) ve POPC + Pops + Kol + PI Konfokal kesiti (4,5) P2 bağlanan GUVs (B ve D). Gag-YFP dağılımı yeşil gösterilir. Seçilen GUVs (sarı kutu) büyütülmüş görüntüler panelleri C gösterilir ve D. Floresan yoğunluğu görüntüleri aşağıda gösterilmiştir GUVs ( 'X X) karşıt tarafları çapraz çizilmiş rastgele seçilmiş hatları boyunca profilleri. Bar = 5 um. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda açıklandığı gibi GUV bağlama deneyi diğer protein-lipid etkileşim deneyleri kendi sınırlamaları vardır senaryolarda iyi bir alternatif sunuyor. Bu tahlil bize çift katlı lipid bağlamında yerli uzunlukta açil zincirleri ile miristoillenmiş tam uzunlukta Gag ve asidik lipidler arasındaki etkileşimi incelemek ve Gag-lipit yüksek yoğunluklu sakaroz geçişlerini veya diğer post-bağlayıcı işleme yoluyla uzun yüzdürme santrifüj olmadan bunu sağlar kompleksleri. Bir başka avantaj Gag davranışı kolaylıkla gibi yüzey plazmon rezonansı bazlı tahliller gibi gerçek zamanlı tekniklerin elde edilmez, (sitozolik bileşenlerin mevcudiyetinde, örneğin) bir karışım incelenebilir olmasıdır. Bu nedenle, burada açıklanan deney alanında kullanılan diğer deneylerden daha doğal bağlamda gag-asidik lipit etkileşimlerin gerçek zamanlı bir değerlendirme sağlar söylenebilir.
Bununla birlikte, yöntem olarak ilişkili sınırlamaları vardıriyi. Belirli bir hazırlık GUVs birbirine benzer bir bileşime sahip ve orijinal karışıma electroformation de karışıma 25,26 bulunan yüksek geçiş sıcaklığına sahip lipidler geçiş sıcaklığının üzerinde gerçekleştirilmelidir sağlamak. Bununla birlikte, daha uzun bir süre için yüksek sıcaklıklara lipidlerin maruz lipit arıza 25,27 yol açması mümkündür. Bu nedenle, Floresan bir lipid boyalar (ör yaptı), [örneğin, PI (4,5) P2 ilgi lipid işlevselliğini sınamak için arzu edilir dahil olarak etkin bir görsel muayene ilave olarak GUVs kalitesini kontrol etmek için ] lipit özgü prob kullanılarak. Buna ek olarak, belirli bir sıcaklıkta, faz ayrışmasına neden GUV bileşimleri ile, bakım protein GUV etkileşim ölçümü sırasında tam olarak arzu edilen bir sıcaklığı korumak için özen gösterilmelidir. Başka bir sınırlama daha yüksek iyonik kuvvet çözümleri elektro ile uyumlu olmasıdırformasyonu protokolü, burada açıklanan ve bu nedenle GUVs büyütüldü ve 300 mM sukroz çözeltisi 26 içinde muhafaza edilir. Özellikle, ancak bazı çalışmalar başarıyla değiştirilmiş electroformation protokolleri 28 fizyolojik iyonik güçlü de tamponlar kullandık.
Bir kritik yönü Gag miktardır. Bir tavşan retikülosit lisatı dayalı sistem genellikle lipozom flotasyon deneylerinde tam uzunluktaki HIV-1 Gag hazırlanması için kullanılır. Bununla birlikte, bu sistemde elde YFP etiketli tam uzunluk Gag miktarı GUVs bağlanabilen Gag görüntülenmesi için yetersizdi. Bu sorunu çözmek için, yaklaşık 8-10 GAG daha yüksek miktarda katı verir buğday germ hücresi bazlı hücresiz transkripsiyon-translasyon sistemi, mevcut deneyde kullanıldı. GUV bağlanma deneyleri ökaryotik hücre lisatı bileşenlerinin yokluğunda gerçekleştirilebilir gerekiyorsa en son yapılmıştır Ancak, tek bir bir florofor ile işaretlenmiş saflaştırılmış proteinler de kullanılır (aşağıda açıklanmıştır).
Bu spesifik ve membranlara GAG bağlanma etkin gibi miristat gibi çeşitli faktörler tarafından düzenlenen bir işbirliğine dayalı bir süreç olduğu gösterilmiştir, RNA, lipid ana grupları ve asil zincirleri ve gag-Gag etkileşimler (referans 29 gözden). In vitro bir sistem burada tarif GAG bağlanma zar kooperatif sürecinde olayların sırası anlamak için tek başına veya kombinasyon halinde faktörlerin rolü ele uzatılabilir. Bugüne kadar açıklanan tahlil sistemi kanonik memeli hücre kökenli PI o Gag bağlanmasını değil doymamış PI (4,5) P2 asil zincirlerinin beklenmedik bir rolü aydınlatılamamıştır (4,5) P2 (domain -bağlayıcı fosfolipaz C delta 1) 24, lipozom yüzdürme deneyleri ile ortaya olmasaydı bir bulgunun pleckstrin homoloji alanı. GUV dayalı tahlil sistemleri, aynı zamanda Gag biyoloji diğer yönleri anlamak için kullanılmıştır. yapay uyanlabilir Multim ihtiva eden bir Gag türevi kullanılaraketki gibi sal gibi ve non-salı, Keller ve ark. 'sal gibi' etki ve multimerizasyon 30 Gag bölümleme arasındaki ilişki incelenmiş ile erization motifi ve GUVs. Carlson ve ark tarafından yapılan bir çalışma. Zara bağlı Gag 31 tarafından çeşitli endozomal sıralama taşıma için gerekli olan kompleksleri (ESCRT) proteinlerin işe ardışık düzeni anlamak için GUV sistemi ve saflaştırılmış ve floresan etiketli Gag kullandı. Son zamanlarda, başka bir çalışmada, bir fluorofor 32 ile konjuge Gag kullanarak GUV üzerinde Gag kaynaklı vezikül tomurcuklanan sürecinin sulandırılması bildirdi. HIV-1 Gag multimerizasyon montaj esnasında eğrisine zarları düşünülmektedir submembrane Gag kafesin oluşmasına yol açar. Bu nedenle, gag-GUV deney sistemlerinde daha da geliştirilmesi ile, muhtemelen HIV tertibatının en iyi anlaşılmış yönü bağlayıcı membran eğrilik değişiklikler ve gag membran ilişkisi, FO yapıldığı gibi analiz edilebilirdiğer hücresel eğrilik duyarlı proteinler 33 r.
Özetle, bu protokolü kullanarak, bir miristoillenmiş tam uzunluktaki Gag yeterli miktarda almak ve Gag GUV zarlarına bağlanmasını oluşturulabiliyor. Bu protokol fazla HIV-1 montaj ve tomurcuklanan süreçlerin çeşitli aşamalarında incelemek için geliştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz yararlı tartışmalar için Mohammad Saleem, Jing Wu ve Krishnan Raghunathan teşekkür etmek istiyorum. Biz de çekimler sırasında yardım için Priya Begani teşekkür ederiz. Bu eser (AO) R01 AI071727 ve (SLV için) R01 GM110052 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından hibe desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Multimeter | Meterman | 30XR | A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose. |
| Function Generator | Instek | GFG-8216A | A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10 Hz and 1 V is sufficient. |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO | CG-90IN | |
| Incubator | Hoefer | Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient | |
| Vacuum chamber | Nalgene | ||
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Syringe | Hamilton | 80400 | Gauge 22S, Syringe number 702 |
| PDMS | Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning | Sylgard, 184 | |
| RTS 100 Wheat Germ CECF Kit | BiotechRabbit, Berlin, Germany |
BR1401001 | |
| DiD | Life Technologies, Carlsbad, CA | D7757 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850457C | |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034C | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700041P | |
| Brain-PI(4,5)P2 | Avanti Polar Lipids | 840046X |
References
- Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).
- Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A. Opposing mechanisms involving RNA and lipids regulate HIV-1 Gag membrane binding through the highly basic region of the matrix domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1600-1605 (2010).
- Chukkapalli, V., Hogue, I. B., Boyko, V., Hu, W. S., Ono, A. Interaction between the human immunodeficiency virus type 1 Gag matrix domain and phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate is essential for efficient gag membrane binding. J Virol. 82 (5), 2405-2417 (2008).
- Zhou, W., Parent, L. J., Wills, J. W., Resh, M. D. Identification of a membrane-binding domain within the amino-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 Gag protein which interacts with acidic phospholipids. J Virol. 68 (4), 2556-2569 (1994).
- Ono, A., Ablan, S. D., Lockett, S. J., Nagashima, K., Freed, E. O. Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate regulates HIV-1 Gag targeting to the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14889-14894 (2004).
- Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
- Shkriabai, N., et al. Interactions of HIV-1 Gag with assembly cofactors. Biochemistry. 45 (13), 4077-4083 (2006).
- Vlach, J., Saad, J. S. Trio engagement via plasma membrane phospholipids and the myristoyl moiety governs HIV-1 matrix binding to bilayers. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3525-3530 (2013).
- Anraku, K., et al. Highly sensitive analysis of the interaction between HIV-1 Gag and phosphoinositide derivatives based on surface plasmon resonance. Biochemistry. 49 (25), 5109-5116 (2010).
- Llewellyn, G. N., Grover, J. R., Olety, B., Ono, A. HIV-1 Gag associates with specific uropod-directed microdomains in a manner dependent on its MA highly basic region. J Virol. 87 (11), 6441-6454 (2013).
- Inlora, J., Chukkapalli, V., Derse, D., Ono, A. Gag localization and virus-like particle release mediated by the matrix domain of human T-lymphotropic virus type 1 Gag are less dependent on phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate than those mediated by the matrix domain of HIV-1 Gag. J Virol. 85 (8), 3802-3810 (2011).
- Inlora, J., Collins, D. R., Trubin, M. E., Chung, J. Y., Ono, A. Membrane binding and subcellular localization of retroviral Gag proteins are differentially regulated by MA interactions with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate and RNA. MBio. 5 (6), e02202 (2014).
- Valentine, K. G., et al. Reverse micelle encapsulation of membrane-anchored proteins for solution NMR studies. Structure. 18 (1), 9-16 (2010).
- Dick, R. A., Goh, S. L., Feigenson, G. W., Vogt, V. M. HIV-1 Gag protein can sense the cholesterol and acyl chain environment in model membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), 18761-18766 (2012).
- Dick, R. A., Kamynina, E., Vogt, V. M. Effect of multimerization on membrane association of Rous sarcoma virus and HIV-1 MA proteins. J Virol. 87 (24), 13598-13608 (2013).
- Alfadhli, A., Still, A., Barklis, E. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 matrix binding to membranes and nucleic acids. J Virol. 83 (23), 12196-12203 (2009).
- Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
- Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers. Biochemistry. 27 (13), 4668-4673 (1988).
- Darszon, A., et al. Reassembly of protein-lipid complexes into large bilayer vesicles: perspectives for membrane reconstitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (1), 239-243 (1980).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S.
- Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P. h, Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Progr Colloid Polymer Sci. 89, 127-131 (1992).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Yamauchi, S., et al. The consensus motif for N-myristoylation of plant proteins in a wheat germ cell-free translation system. FEBS J. 277 (17), 3596-3607 (2010).
- Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate Acyl Chains Differentiate Membrane Binding of HIV-1 Gag from That of the Phospholipase Cdelta1 Pleckstrin Homology Domain. J Virol. 89 (15), 7861-7873 (2015).
- Morales-Penningston, N. F., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
- Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Methods Mol Biol. 398, 59-72 (2007).
- Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid peroxides promote large rafts: effects of excitation of probes in fluorescence microscopy and electrochemical reactions during vesicle formation. Biophys J. 91 (6), 2172-2183 (2006).
- Montes, L. R., et al. Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions. Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).
- Olety, B., Ono, A. Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding. Virus Res. 193, 108-115 (2014).
- Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes. Cell Microbiol. 15 (2), 237-247 (2013).
- Carlson, L. A., Hurley, J. H. In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (42), 16928-16933 (2012).
- Gui, D., et al. A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding. J Biol Phys. 41 (2), 135-149 (2015).
- Prevost, C., et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nat Commun. 6, 8529 (2015).
