Summary
Um die Pathophysiologie des Schlaganfalls zu verstehen, ist es wichtig, zuverlässige Modelle zu verwenden. Dieses Papier wird eine der am häufigsten verwendeten Taktmodelle bei Mäusen beschreiben, die Arteria cerebri media Okklusion (MCAo) Modell genannt (auch bezeichnet als die intraluminale Faden oder Naht Modell) mit Reperfusion.
Abstract
Der Schlaganfall ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit und ist weiterhin einer der wichtigsten Ursachen der langfristigen Erwachsenen Behinderungen zu sein. Über 87% aller Schlaganfälle sind ischämischer Ursprungs und kommen in das Gebiet der Arteria cerebri media (MCA). Derzeit ist die einzige Food and Drug Administration (FDA) zugelassene Medikament zur Behandlung dieser verheerenden Krankheit ist Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA). Jedoch hat tPA ein kleines therapeutisches Fenster für die Verabreichung (3 bis 6 h) und ist nur wirksam, in 4% der Patienten, die sie tatsächlich empfangen. Aktuelle Forschungsschwerpunkte sind die Pathophysiologie des Schlaganfalls um potentielle therapeutische Targets auf das Verständnis zu finden. Somit sind zuverlässige Modelle von entscheidender Bedeutung, und die MCA-Okklusion (MCAo) Modell (auch bezeichnet als die intraluminale Faden oder Nahtmodell) gilt als die meisten klinisch relevanten chirurgischen Modell des ischämischen Schlaganfalls zu sein, und ist ziemlich nicht-invasive und leicht reproduzierbar. Typischerweise wird das MCAo Modell mit Nagetieren eingesetzt, vor allem bei Mäusen durchauf alle genetischen für diese Art verfügbaren Varianten. Hier beschreiben wir (und in dem Video), wie man erfolgreich das MCAo Modell durchführen (mit Reperfusion) in Mäusen zuverlässige und reproduzierbare Daten zu generieren.
Introduction
Der Schlaganfall ist die fünfthäufigste Todesursache weltweit, mit einer Person, alle 4 Minuten von der Krankheit sterben. Über 800.000 Amerikaner erleiden einen Schlaganfall jedes Jahr, was für den Patienten nicht nur verheerend, sondern auch für ihre Familien. Der Schlaganfall ist die Hauptursache für die Erwachsenen Behinderung und die jährlichen Ausgaben geschätzt wird , in der Größenordnung von $ 36500000000 1 trotz nur sehr wenige Behandlungsmöglichkeiten werden zur Verfügung stehen.
Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA) ist die einzige Food and Drug Administration (FDA) Medikament für einen ischämischen Schlaganfall lizenziert. Es ist jedoch nur wirksam , wenn sie innerhalb von 3-6 Stunden nach Beginn des Hubes an Patienten verabreicht, und in diesen Fällen ist es profitiert nur 4% der Patienten 2. Daher ist es zwingend notwendig, dass reproduzierbare, klinisch relevanten Tiermodellen von Schlaganfall eingesetzt werden bei der Entwicklung von potentiellen therapeutischen Strategien und Behandlungsmöglichkeiten für diese Krankheit zu unterstützen. Es ist wichtig , dass in vitro zu beachten in - vivo - Modellen wesentlich.
Die häufigste Form des Schlaganfalls ist ischämischen Ursprungs, für 87% der gesamten Hübe ausmacht. Andere Hübe sind intrazerebrale Blutung (9%) und Subarachnoidalblutung (4%), und veranlasst werden am häufigsten durch einen Emboli in die Arteria cerebri media (MCA). Zurückzuführen ist dies auf die prominente Kurve an der Wurzel des MCA, die laminare Blutfluss führt in das Gehirn gestört zu werden. Der MCA ergibt sich aus der Arteria carotis interna (ICA) und Routen entlang der lateralen Sulcus, wo es Äste und Projekte zu den Basalganglien und die Seitenflächen des frontalen, parietalen und Temporallappen, einschließlich der primären motorischen und sensorischen Kortex. Der Kreis von Willis durch hinteren Hirnarterien geschaffen wirdzu den Hirnarterien und den hinteren kommuniziere Arterien verbunden.
Der intraluminale Faden oder Nahtmodell MCAo ist eines der am weitesten in der Schlaganfall-Forschung eingesetzt. Allerdings gibt es ein paar verschiedene Variationen dieses Modells sind, und diese sind abhängig davon , ob die microfilament in die A. carotis externa eingeführt wird (ECA, bezeichnet die Longa Methode) 3, oder ob sie in die ICA eingeführt wird ( der so genannten Koizumi Verfahren) 4. In Koizumi Methode, die Arteria carotis communis (CCA) an der Seite der Operation verbunden werden müssen dauerhaft , wenn der Faden in der CCA zu verhindern , entfernt wird , aus dem Einschnitt Blutungen, während in Longa Methode es das ECA ist , die permanent 5 gebunden werden müssen . Hier ist die Longa Verfahren verwendet werden, wie wir denken, dass dies ein weit überlegen ist und eine klinisch relevante chirurgische Modell des ischämischen Schlaganfalls. Weiterhin ist die Verwendung eines Silizium-tipped Monofilament, insbesondere mit dem Longa Verfahren erzeugt sehrreproduzierbare MCAo zu den flamm abgestumpft Monofilamente gegenüber , die oft unvollständig Okklusion und / oder Subarachnoidalblutung 6 erzeugen.
Der intraluminale Filament - Methode kann als ein Modell der permanenten oder vorübergehenden Okklusion 4,6 verwendet werden. Um die transiente Modell durchzuführen, der Faden nach einer Periode der Ischämie entfernt wird (beispielsweise 30 min, 60 min oder 2 h) und Reperfusion erlaubt zu passieren. Dieses Modell, das zu einem gewissen Grad, simuliert die Wiederherstellung des Blutflusses nach dem spontanen oder therapeutischen Intervention (zB tPA Verabreichung) einer thromboembolischen Gerinnsel in Menschen zu lysieren. Für den Dauermodell wird das Filament nur für einen bestimmten Zeitraum an Ort und Stelle gelassen (zB 24 h), so kommt es zu keiner Reperfusion. Ein weiterer Vorteil der intraluminalen Filaments Verfahrens ist die Tatsache, dass eine Kraniotomie nicht durchgeführt werden muss, so dass der Schädel intakt gelassen werden und Änderungen des intrakranialen Drucks und der Temperatur zu vermeiden.
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Protocol
Dieses Protokoll und die im Video gezeigten Experimenten wurden von der LSUHSC-S Institutional Animal Care und Use Committee und sind in Übereinstimmung mit den Richtlinien der NIH genehmigt.
HINWEIS: Männliche C57BL / 6-Mäuse mit einem Gewicht von 25 bis 29 g wurden in dieser Studie verwendet. Die Mäuse wurden auf einem Standardfutter Pellet Ernährung mit freiem Zugang zu Wasser gehalten wird, unter einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus in einzeln belüfteten Käfigen. Das Verfahren wird unter sterilen Bedingungen mit sterilen Techniken durchgeführt werden (zB sterile Handschuhe, sterile Instrumente).
1. Präoperative Vorbereitungen
- Induzieren Anästhesie unter Verwendung einer Kombination von Ketamin (150 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) intraperitoneal injiziert (ip). Überwachung der Narkosetiefe zu Fuß Prise zunächst alle 3 - 5 Minuten und alle 10 Minuten einmal Anästhesie erreicht wird. Während das Tier unter Narkose ist, verabreichen eine sterile Augensalbe Trockenheit zu verhindern. Die Anfangsdosis von Ketamin / Xylazin dauert in der Regel about 30-40 Minuten. Eine zusätzliche Dosis kann verabreicht werden, falls erforderlich, die durch das Tier als Reaktion auf einen Fuß pinch prüft wird.
- Legen Mäuse in Rückenlage auf einer Temperatur Heizmatte geregelt und halten die Körpertemperatur bei 36,5 ± 0,1 ° C, die eine rektale Sonde verified verwendet.
- Rasieren Sie den Hals und desinfizieren die Haut mit 70% igem Alkohol.
2. Occlusion der MCA (Abbildung 1)
- Machen Sie eine Mittellinie Halsschnitt mit Iris gerade Schere und einfahren (mit Retraktoren) die Weichteile der Gefäße zu belichten.
- Präparieren Sie die CCA und die ECA vom umgebenden Gewebe Dumont Pinzette, ohne den Vagusnerv zu beschädigen.
- Machen Sie eine temporäre Naht durch einen losen Knoten um die CCA binden mit 6-0 Seide.
- Machen Sie eine permanente Naht um den Rechnungshof und die kleineren Schiffe von ihm erstreckt, durch dicht die Gefäße Ligatur (distal der Bifurkation der CCA).
- Machen Sie eine Naht around die ECA proximal der CCA Gabelung.
- Legen Sie eine microvessel Clip um die Arteria carotis interna (ICA) und pterygopalatinum Arterie (PPA).
- Machen Sie einen kleinen Schnitt in der ECA mit Mikro Sezieren Frühjahr Schere und legen Sie eine 180 um Silizium-bestückte Monofilament. Machen der Schnitt möglichst nahe an der Naht permanent wie möglich für eine einfachere Manipulation des Filaments.
- Ziehen Sie die temporären Naht um die ECA mit dem Faden eingeführt und die microvessel Clip zu entfernen.
- Schneiden Sie die ECA zwischen dem Permanent, distalen Naht und dem Eintrittspunkt des Filaments Mikro Sezieren Frühjahr Schere.
- Führen Sie den Faden durch die ICA, bis Widerstand zu spüren ist (ca. 9 -. 10 & mgr; m über der Gabelung der CCA) in der MCA.
HINWEIS: Bei zu viel Widerstand zu spüren ist, während die Mehrheit des Filaments noch sichtbar ist, haben das Filament kann die PPA eingetragen. Wenn dies der Fall ist, ziehen Sie an der Gabelung den Faden zurück, sanft Eiterh vorwärts in die ICA mit Dumont Pinzetten, und den Faden vor, bis es in der ICA sichtbar gemacht werden kann.
3. Reperfusion
- Nach einer 30-minütigen Okklusion Zeit, entfernen Sie den Faden durch sanft wieder mit Dumont Pinzette ziehen und den Faden um das offene Ende des ECA sichern.
- Entfernen Sie die temporären Naht um die CCA durch sorgfältig die Ligatur Lockerung mit Dumont Pinzette und den Blutfluss durch die CCA wieder aufgenommen.
- Schließen der Inzision mit einer kontinuierlichen chirurgisches Naht. Schließung der Haut kann durch entweder kontinuierlich oder unterbrochen Nähte erreicht werden. Hautklammern sind auch eine akzeptable Methode.
- Injizieren Mäuse mit 1 ml Kochsalzlösung subkutan als Volumen Nachschub und mit den analgetischen Carprofen (5 mg / kg, sc) zur Linderung von Schmerzen und Beschwerden aus dem chirurgischen Eingriff, Zeichen, die zusätzliche Schmerzlinderung anzuzeigen, umfassen krumm erforderlich zurück, unpräparierten Mantel, verminderte Aktivität, abnormePosieren und verminderter Appetit.
- Beachten Sie Mäuse in der gesamten Erholung von der Anästhesie in einem beheizten 30 ° C Käfig eine Wärmelampe geregelt einen Temperaturregler mit und legen püriert Chow in einer Petrischale auf dem Boden des Käfigs zu essen zu fördern. Die Mäuse wird ein pro Käfig während der Reperfusionszeitraums untergebracht werden.
4. Sham Surgery
- Gegenstand Mäuse dem gleichen Verfahren ohne die Monofilament-Insertion.
5. Postoperative Neurologische Ergebnisse (Tabelle 1; Abbildung 2)
- Neurologisch bewerten Mäuse nach der entsprechenden Reperfusionszeitraums einen 18-Punkte-Scoring-System unter Verwendung der allgemeinen Beurteilung; Motor; Sensorische; Propriozeption. Eine höhere neurologische Punktzahl entspricht neurologische Funktion verringert.
HINWEIS: Die Mäuse, die nicht mehr reagiert und nicht in der Lage beurteilt werden, werden zu Fuß eingeschläfert werden. Weitere Kriterien für die humane Sterbehilfe beinhaltet einen Gewichtsverlust von mehr als 20%, Atmungs diStress und Infektionen rund um den OP-Bereich. Eine CO 2 Kammer wird für die Euthanasie und die physikalische Methode verwendet werden , den Tod zu bestätigen Genickbruch oder Thorakotomie sein.
6. Messung der Gehirninfarktvolumen (Abbildung 3)
- Induce Anästhesie eine Kombination von Ketamin mit (150 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) ip-Monitor Narkosetiefe zu Fuß Prise injiziert zunächst alle 3 - 5 Minuten und alle 10 Minuten einmal Anästhesie erreicht wird.
- Legen Mäuse in Rückenlage und schneiden Sie die Haut vom Bauch bis zum Hals durch das Peritoneum gefolgt Iris gerade Schere.
- Heben Sie das Brustbein mit Dumont Pinzette und schneiden Sie die Rippen, um das Herz aussetzen.
- Öffnen der linken und der rechten Seite der Brust unter Verwendung von zwei Paaren von Hämostatika, Belichten des Herzens.
- Legen Sie eine 26 G-Nadel in einen 5-ml-Spritze in den linken Ventrikel und schneiden Sie den rechten Vorhof angebracht. Perfuse mit Raumtemperatur normaler Kochsalzlösung oder Phosphate Kochsalzlösung (PBS), bis die Flüssigkeit klar wird (in der Regel 3 bis 5 min).
- Entfernen Sie den Schädel vorsichtig aus dem Gehirn entfernt Iris gerade Schere und Pinzette Dumont.
- Schneiden Sie die Riechkolben und das Kleinhirn mit einer Rasierklinge aus, so dass das Gehirn in der Matrix passen. Verwenden Sie diese Matrix das Gehirn in sogar Segmente zu schneiden. Kühlen Sie die Matrix vor dem Gebrauch zu halten das Gewebe cool. Legen Sie das Gehirn in die Matrix und legen Sie es auf Eis.
- Schneiden Sie das Gehirn in 2 mm koronalen Segmente mit zwei Rasierklingen. Machen Sie den ersten Schnitt mit einer Rasierklinge beginnend 2 mm von der Spitze mit und lassen Sie dieses Rasierklinge an Ort und Stelle. Machen Sie noch 2 mm hinter dem ersten Schnitt. Entfernen Sie die erste Rasierklinge mit dem Gewebe angebracht. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Gewebe geschnitten worden ist.
HINWEIS: Es sollte 4 - 5 Segmente, wenn Sie fertig. - Platzieren Sie die Segmente in 24-Well-Platte mit 2% 2,3,5-triphenyltetrazalium chlorid (TTC), die dann in einem flachen Wasserbad a platziertt 37 ° C für 20 min. Platzieren jedes Segment zu einem individuellen und hilft ihnen in der Reihenfolge zu halten, in der sie geschnitten wurden. Stellen Sie sicher, dass die TTC-Lösung die Gewebesegmente vollständig bedeckt. Nach 10 min drehen alle Scheiben auf.
- Legen Sie eine kleine Menge von 10% Formalin in die Vertiefungen einer neuen Platte mit 24 Vertiefungen und übertragen Sie die Segmente auf diese Platte in der Reihenfolge, in der sie geschnitten wurden.
- Scannen der Segmente in den Computer und analysieren die Infarktgröße als Prozentsatz des gesamten Gehirns Scheibe 6 mit ImageJ Analyse - Software (NIH 1.57 Bild Software) 6.
- Skizzieren Sie die Infarktbereich einen Bereich Messung zu erzeugen. messen Nächstes die gesamte kontralateralen Hemisphäre um den Bereich zu bestimmen. Unterteilen den Infarktbereich durch den Bereich der kontralateralen Hemisphäre und mit 100 multipliziert das Infarktvolumen zu bestimmen.
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Representative Results
Mäuse unterzog 30 min MCAo induzierte Hirnischämie (Abbildung 1) , gefolgt von einem Zeitraum der Reperfusion (24 h und 1 wk werden hier dargestellt, aber die Länge der Reperfusion kann variiert werden). Die Sterblichkeit bei MCAo war minimal (ca. 2%). Beitrag Ischämie, die Mortalitätsrate (innerhalb der ersten 24 Stunden) wurde um 26%.
Laser - Doppler - Flußmessung wurde verwendet , um den Blutfluss Perfusion in dem MCA Gebiet vor und nach MCAo / Reperfusion bestätigen. Abbildung 4 zeigt deutlich , dass , wenn die temporäre CCA Bindung nach 30 min - Ischämie für Filaments Entnahme freigegeben wird und Reperfusion stattfindet, gibt es eine Stromstoßes in Perfusion, die <100% des Ausgangswertes Perfusion erreicht (dh vor der Operation) 5 min in der Reperfusion.
24 Stunden nach Beginn des Schlaganfalls (vor der Messung des Infarktvolumens) neurollogischen Noten auf allgemeine, sensorische, motorische und propriozeptive Defizite im Zusammenhang beurteilt wurden (Tabelle 1). Dieses Punktesystem , das angestrebte Ziel zu schaffen ( "ja oder nein") Kriterien für die Beurteilung. Abbildung 2 zeigt , dass die Punktzahl für Mäuse (n = 27) bei 24 Stunden 12,56 ± 0,7 war und blieb hoch 1 Woche später (11.50 ± 1,5 ). Eine höhere neurologische Punktzahl entspricht neurologische Funktion verringert.
Das Infarktvolumen spiegelte ähnliche Muster auf die neurologische Score bei 24 Stunden, dh größer als Schein Tiere. 24 Stunden nach der MCAo, Mäuse hatten großen Infarktvolumen (Abbildung 3: 15,9 ± 2,6%), die 1 Woche nach Schlaganfall erhöhte wurden (28,5 ± 1,9%).
Abbildung 1: Schematische zeigt den Standort der Arteria cerebri media Occlusion(MCAo) Chirurgie und Großbehälter Vaskulatur des Cerebral Circulation. A. Surgical MCAo durch Insertion eines Filaments in die Arteria carotis externa erreicht wird und dann in die proximale Mitte Arteria carotis. BG. Schritte zum MCAo induzieren. Anterior Kommunikation Arterie (ACA); A. cerebri media (MCA); posterior Kommunikation Arterie (PcomA); A. cerebri posterior (PCA); Basilaris (BA); A. carotis interna (ICA); A. carotis externa (ECA); pterygopalatinum Arterie (PPA); A. carotis interna (ICA). (Mit Genehmigung von Smith et al., Referenz # 5.) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. Der 18-Punkt - Strich Score Diese Verständlichkeitve Schlaganfall-Score beurteilt funktionale Verbesserungen im Allgemeinen und sensorische, motorische und propriozeptive Aspekte des Mausverhaltens nach einem Schlaganfall. Daten sind Mittelwerte ± SEM. * P <0,05. n = 3 Mäuse / Gruppe. Die Daten wurden unter Verwendung von ANOVA analysiert sowie eine Bonferroni post hoc Test. (Mit Genehmigung von Smith et al., Referenz # 5.) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Fig . 3: Die Infarktvolumina C57BL / 6 - Mäusen 24 Stunden nach MCAo Die Mäuse wurden auf 30-min MCAo unterworfen und 24 Stunden oder 1 wk Reperfusion A) Die Gehirne wurden entfernt, geschnitten und gefärbt mit 2% 2,3,5-. Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC). Im lebenden Gewebe, reduzieren Dehydrogenasen enzymatisch TTC 1,3,5-Reisehenylformazaon (TPF), die eine rote Farbe, aber in ischämischem Gewebe das Enzym ist nicht funktionsfähig, so dass das Gewebe bleibt weiß. B) Die graphische Darstellung zeigt eine Steigerung der Infarktvolumen in Mäusen einen Schlaganfall erlitten haben. Daten sind Mittelwerte ± SEM. ** P <0,002, **** p <0,0001 im Vergleich zu Schein; n = 4 Mäuse / Gruppe. Die Daten wurden unter Verwendung von ANOVA analysiert sowie eine Bonferroni post hoc Test. Maßstabsbalken = 1 cm (mit Genehmigung von Smith et al., Referenz # 5.) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4:. Perfusions von MCA - Territorium Während MCAo und Reperfusion Die Mäuse wurden auf 30-min MCAo unterworfen und <5 min Reperfusion. Basislinien wurden auf 100% normalisiert. als Erfahcted war Perfusion 5 min in die Reperfusionsperiode höher als MCAo, dh, wenn keine Perfusion des Gewebes auftrat. Daten sind Mittelwerte ± SEM. * P <0,05. n = 3 Mäuse / Gruppe. Die Daten wurden unter Verwendung von ANOVA analysiert sowie eine Bonferroni post hoc Test. (Mit Genehmigung von Smith et al., Referenz # 5.) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1: Neurologische Scoring System Ein Punkt für eine Ja - Antwort auf jede der Tests gegeben.. Marks von 18 7,8.
| Test | Kurze Beschreibung | Was bedeutet es testen? | Referenzen |
| Morris - Wasserlabyrinth | Ein Open-Feld Wasser-Labyrinth Verfahren, wo Nagetiere von Wasser auf eine versteckte Plattform zu entkommen lernen | Räumliches Gedächtnis, Bewegungssteuerung und cognitive mapping | 19 |
| Rotarod | Eine horizontale Drehstange, wo Nagetiere gehen müssen nach vorn, um nicht zu fallen | Motor Koordination, Balance und Griffstärke | 20 |
| Pole | Nagetiere auf einer Stange gelegt und beobachtet für Schiebe- oder fallen, wie sie ihren Weg nach unten in einen Käfig machen | Bewegungsstörungen durch Rindenschäden | 21, 22 |
| Ganganalyse | Da Nager eine Glasplatte ihre Pfotenabdrücke überqueren erfasst ihre Bewegungen zu untersuchen | Gehen Muster (paw Druck, Schrittlänge, Breite und Frequenz, Zeh Ausbreitung, Gangwinkel und Körperdrehung)und die motorische Koordination | 23, 24 |
| Klebrige Label - Test | Streifen des Bandes an den unbehaarten Teil forepaw der Nagetiere angewendet aufzeichnen Zeit, um jede Pfote, um Berührung Zeitpunkt der Entfernung zu kontaktieren, und die Reihenfolge der Entfernung | Forepaw Empfindlichkeit und sensomotorischen Defiziten | 25, 26 |
| Ecke | Nagetiere zwischen zwei Brettern platziert einen Winkel von 30 ° bildet; wenn tief in die Ecke eintreten, werden beide Seiten des vibrissae stimuliert und den Nagetieren bäumt sich auf und dreht sich um das offene Ende zu Gesicht zurück | Störungen der neurologischen Entwicklung und sich wiederholende Verhaltensweisen (Überwachung dreht sich in einer Richtung im Vergleich zu der entgegengesetzten Richtung) | 27, 28 |
| Zylinder | Nagetiere sind in einem Glaszylinder mit dem forelimb Aktivität gelegt, während der Aufzucht an der Wand aufgezeichnet wird, | Locomotor Asymmetrie und bewerten Poststroke Glied Einsatz | 28 |
| Treppe | Nagetiere platziert auf einer Plattform in einer Box mit einem Köder versehen Doppeltreppe; Nagetiere sind Lebensmittel beschränkt die Bewegung fördern die Treppe hinauf, den Köder zu sammeln | Das Erreichen Fähigkeiten für jede forelimb unabhängig sensorischen Kapazitäten erfordern, Geschicklichkeit und die motorische Koordination | 25, 29 |
| Leiter | Nagetiere zu Fuß über einen horizontalen Leiter ihrem Käfig zu erreichen; Fuß rutscht, während über die Leiter zu Fuß aufgezeichnet | Fussfehler während der Fortbewegung; forelimb und hindlimb Funktion und Koordination | 30 |
Tabelle 2: Beispiele für Murine Verhaltenstests.
| Vorschlag für GLP ist wie folgt: |
| - Konkrete Angaben zu dem Modell eines Schlaganfalls gewählt wurde (zB Longa vs. Koizumi), und der Stamm, Alter, Geschlecht, Gewicht deutlich ausgewiesen. |
| - Untersuchungen in einer doppelt verblindete Weise durchgeführt. |
| - Leistungsanalyse berichtet. |
| - Kriterien für die Aufnahme und Ausschluss in der Studie entschieden, vor der Studie und berichtet. |
| - Überwacht Tiere täglich (grundlegende Aussehen, Körpergewicht und Verhalten) für irgendwelche Anzeichen von Leiden, Schmerzen oder Krankheit. |
| - Berichterstattung von Tieren aus der Studie ausgeschlossen. |
| - Randomisierung von Tieren in Gruppen. |
| - & #160; Berichterstattung über die negativen und positiven Ergebnissen. |
| - Berichterstattung über die Länge der Chirurgie, Anästhesie, Körpertemperatur und Blutgase. |
| - Berichterstattung von Umwelt Anreicherung verwendet, falls vorhanden. |
Tabelle 3: Vorschläge für gute Laborpraxis.
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Discussion
Seit der Gründung vor 20 Jahren, Einfügung eines Filaments der MCAo Modell für den menschlichen Schlaganfall beteiligt hat in einer großen Anzahl von Studien verwendet worden. Dies ist hauptsächlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass es nachahmt , was klinisch in der häufigsten Form von Schlaganfall geschieht ( das heißt, ischämischer Schlaganfall). Das Striatum ist empfindlicher gegenüber Ischämie als der Großhirnrinde und als solches wird die Länge von ischämischen Zeit übersetzen in ob sowohl das Striatum und der dorsolateralen Kortex betroffen sein werden, oder einfach nur das Striatum. Beide Infarkt und Reperfusion Zeiten können entsprechend variiert werden, und dies bietet der Forscher die Fähigkeit pathologischen Effekte mit transienten ischämischen Attacken zu studieren zu können (TIAs) zu viel größeren Infarkten.
Im Laufe der Jahre Änderungen und Fehlersuche des Filaments Verfahren MCAo hat die Bedeutung des Verfahrens gezeigt , unter sterilen Bedingungen durchgeführt wird , das Risiko einer Infektion 9 zu vermeiden. Die Ergebnisse können variierenzwischen Nagetieren, Stamm (anatomische Variationen gezeigt wurden) 10,11, Gewicht und Anästhetika verwendet, aber die Trends in den hier vorgestellten Ergebnisse sind wahrscheinlich in anderen Laboratorien reflektiert werden , wo MCAo durchgeführt wird. Weitere wichtige Schritte zu berücksichtigen sind Körpertemperatur, Blutdruck und Blutgase zu nehmen. Es ist bekannt, dass die Körpertemperatur neurologische Schäden betroffen sind , mit kleineren assoziierten Läsionen mit Hypothermie 12 und mehr schwere Defizite in 13 Hyperthermie präsentiert. Als solche sollten Temperatur gemessen und gesteuert werden, beispielsweise über die Verwendung von tierischem Temperiergeräte mit einem Heizkissen, um die Körpertemperatur bei 36,5 ° C erhalten. Volume Nachschub und die Förderung des Essens, indem erweichen Futter am Boden des Käfigs sind auch weitere Faktoren zu beachten. Der Blutdruck und Blutgase 6,14 können beide leicht gemessen und überwacht werden unter Verwendung von leicht verfügbaren Ausrüstung von commercial Lieferanten.
Einschränkungen der MCAo Technik sind richtig den Vagusnerv von den Arterien ohne Schaden zu sezieren und die Vermeidung des Fadens in die PPA voran, die nicht nur die Fähigkeit, Schlaganfall wirksam zu induzieren beeinflussen können, sondern auch die Überlebensrate der Maus. Die wichtigste Bedeutung in Bezug auf alternative in vivo MCAo Methoden ist die Überlebensrate , wenn die Longa hier beschriebene Methode verwenden. Wir haben auch festgestellt, dass dies zu einer erhöhten Leukozyten-Endothel entspricht Zell-Interaktionen und erhöhte Infarktvolumen, die dieses Modell machen, einmal gemeistert, ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Behandlung von Schlaganfall potentielle therapeutische Targets zu studieren.
Obwohl wir nicht hier berichtet haben, können eine Reihe von Verhaltenstests auch wie Morris - Wasserlabyrinth durchgeführt werden, Rotarod, pole Test, Ganganalyse, Klebeetikett Test, Ecke Test, Zylinder - Test, Treppentest und Leiter Test (siehe Tabelle2 für Details und Referenzen). Sham Tiere haben keine Probleme mit diesen Verhaltenstests abgeschlossen; jedoch führen Schlaganfall Tiere diese Tests viel weniger erfolgreich. Im Anschluss daran ist ein Bereich der Debatte , ob Anreicherung der Umwelt nicht nur die Reproduzierbarkeit des MCAo Modell betrifft, sondern auch , ob es wird das Ergebnis der Verhaltenstests 15 beeinflussen. Dies ist nicht klar, aber es lohnt sich dies im Labor und während der Studie zu standardisieren.
Es gibt eine Fülle von verschiedenen Tests zur Verfügung Schlaganfall Ergebnis zu messen. Wir haben den Einsatz von Laser-Doppler-Blutflussmessungen vorgestellt, eine eingehende 18-Punkte neurologische Assessment-Score, und auch Volumenmessungen Infarkt. Allerdings sind zusätzliche Optionen auch nützlich, wie Bildgebung. Wir beschäftigen routinemäßig die Verwendung von intravital Fluoreszenzmikroskopie zellulären Interaktionen (Merkmal einer Entzündungsreaktion) 6 innerhalb des Cere zu studierenbral Mikrozirkulation in Echtzeit, in betäubten Tieren 5,6,16. MCAo und Reperfusion erzeugt eine erhöhte zerebrale Entzündungsreaktion im Vergleich zu Schein - Tiere 5,6,16. Andere Bildgebungsmodalitäten , wie beispielsweise Magnetresonanztomographie 17 und Positronen - Emissions - Tomographie - 18 kann auch verwendet werden, da sie die Möglichkeit für Langzeitstudien liefern , die klinisch relevant sind.
Die histologische Analyse von Hirngewebe, Plasma und Serumproben werden routinemäßig durchgeführt, da sie die weitere Charakterisierung der pathophysiologischen Reaktionen auf Schlaganfall ermöglichen und die Mechanismen beteiligt sind, sondern auch, und vielleicht noch wichtiger ist, sie es den Forschern ermöglichen, die Wirkungen von Verbindungen auf das Ergebnis zu studieren also von Schlaganfall, sofern diese wichtige Daten für potenzielle therapeutische Ziele für diese schwächende und verheerende Krankheit. Schließlich halten wir es für sehr ratsam ist für die Forscher nur zu prüfen, nicht die am besten geeigneten Hubmodell based auf die Anforderungen für ihre Studie, sondern auch, dass GLP ( "Good Laboratory Practice") ist obligatorisch. Siehe Tabelle 3 für GLP Vorschläge.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | #000664 | |
| Ketamine Hydrochloride | Morris & Dickson, Shreveport, LA | 67457-108-10 | |
| Xylazine | Akorn, Inc, Lake Forest, IL | NADA# 139-236 | |
| DC temperature control system | FHC, Bowdoin, ME | 40-90-8D | |
| Mini rectal thermistor probe | FHC, Bowdoin, ME | 40-80-5D-02 | |
| Heating pad | FHC, Bowdoin, ME | 40-90-2-06 | |
| Clippers | Amazon, Bellevue, WA | #64800 | |
| 70% ethanol | Worldwide Medical Products, Bristol, PA | #51011023 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Center Valley, PA | SZ40 | |
| Iris scissors (straight) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 11251-20 | |
| Dumont forceps (45° bent tip) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 11297-00 | |
| Micro vessel clip | Fine Science Tools, Foster City, CA | 18055-05 | |
| Micro dissecting spring scissors (straight) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 14088-10 | |
| Retractors (blunt) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 18200-11 (Helen used 17022-13) | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific, Waltham, MA | 23-400-100 | |
| Gauze sponges | Covidien, Mansfield, MA | #9023 | |
| 7-0 silk braided surgical suture | Braintree Scientific, Braintree, MA | SUT-S103 | |
| 0.9% sodium chloride | Morris & Dickson, Lake Forest, IL | 0409-4888-20 | |
| 6-0 medium MCAO suture (silicon rubber coated monofilament) | Doccol Corporation, Sharon, MA | 6023PKRe | |
| Sofsilk 6-0 silicone coated braided silk | Covidien, Mansfield, MA | SUT-14-1 | |
| Carprofen | Pfizer, New York, NY | NADA# 141-199 | |
| Puralube | Dechra, Norwich, UK | NDC 17033-211-38 | |
| Physitemp temperature controller | Harvard Apparatus, Holliston, MA | TCAT-2AC | |
| Heat lamp | Harvard Apparatus, Holliston, MA | HL-1 | |
| Laser doppler probe | AD Instruments, Colorado Springs, CO | MSP100XP | |
| 24-well plates | Fisher Scientific, Waltham, MA | #353226 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies, Carlsbad, CA | 20012-050 | |
| Single edge razor blades | Fisher Scientific, Waltham, MA | 12-640 | |
| 2,3,5-triphenyltetrazalium chloride (TTC) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | T8877-50G | |
| Mouse brain matrix slicer | Braintree Scientific, Braintree, MA | BS-A 5000C | |
| Water bath | VWR, Radnor, PA | #182 | |
| 10% formalin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | HT501128-4L | |
| ImageJ analysis software | NIH, Bethesda, MD | free download | |
| Retractor | Medical Device Purchase, Newcastle, CA | MP-740 |
References
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