Summary
inme patofizyolojisini anlamak için, güvenilir modeller kullanmak önemlidir. Farelerde en sık kullanılan inme modellerinden birini anlatacağız Bu yazıda, orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) modeli olarak adlandırılan reperfüzyon ile (ayrıca lümen içi filament veya sütür modeli olarak adlandırılır).
Abstract
İnme, tüm dünyada ölüm önde gelen nedenidir ve uzun vadeli yetişkin engelli temel nedenlerinden biri olmaya devam etmektedir. vuruşları yaklaşık% 87 iskemik orijinlidir ve orta serebral arter (MCA) topraklarında meydana gelir. Şu anda sadece Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) bu yıkıcı hastalığın tedavisi için ilaç onayladı doku plazminojen aktivatörü (tPA) 'dir. Bununla birlikte, tPA uygulama için küçük bir terapötik penceresi olan (3-6 saat) ve aslında uygulanan hastaların% 4 etkilidir. Mevcut araştırma potansiyel terapötik hedefleri bulmak için inme patofizyolojisinin anlaşılmasında odaklanır. Böylece, güvenilir modeller çok önemlidir ve MCA oklüzyonu (MCAO) modeli iskemik inme klinik olarak en uygun cerrahi modeli olarak kabul edilir (ayrıca lümen Filament veya sütür modeli olarak adlandırılan) ve oldukça non-invaziv ve kolay tekrarlanabilir. Genellikle MCAO modeli nedeniyle özellikle fare ile, kemirgenler kullanılırBu türler için mevcut tüm genetik varyasyonları. Burada tarif (ve video mevcut) başarıyla güvenilir ve tekrarlanabilir verileri oluşturmak için farelerde (reperfüzyon) ile MCAO modelini nasıl gerçekleştirileceği.
Introduction
İnme bir kişi hastalıktan her 4 dakikada bir ölen ile, dünya çapında ölüm beşinci önde gelen nedenidir. 800.000 üzerinde Amerikalılar sadece hasta için yıkıcı olmayan bir felç, her yıl, acı, ama aynı zamanda aileleri için. İnme yetişkin sakatlık ana nedenidir ve yıllık harcama mevcut olan çok az tedavi seçenekleri olmasına rağmen 36500000000 $ 1 düzeyinde olduğu tahmin edilmektedir.
Doku plazminojen aktivatörü (tPA) Sadece Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) iskemik inme için ilaç lisanslı. Inme 3-6 saat içinde hastaya uygulandığı ve bu gibi durumlarda bu hastaların 2% 4 yarar Ancak, bu geçerlidir. Nedenle, inme, tekrar üretilebilir, klinik olarak hayvan modelleri, bu hastalık için potansiyel bir terapötik strateji ve tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olmak için kullanılır zorunludur. In vitro dikkat etmek önemlidir in vivo modeller gereklidir.
inme en yaygın türü, toplam inmelerin% 87 için muhasebe, menşe iskemik olduğunu. Diğer vuruş intraserebral kanama (% 9) ve subaraknoid kanama (% 4), ve orta serebral arter (MCA) bir emboli en sık neden olur. Bu kesintiye hale beyin giren laminer kan akımının neden MCA kökünde belirgin eğri, atfedilebilir. MCA yanal sulkus boyunca internal karotis arter (ICA) ve yolları, doğar nerede dalları ve projeler bazal ganglionlar ve frontal, parietal ve primer motor ve duyusal korteks olmak üzere temporal lob, yanal yüzeyler. Willis Çember olma posterior serebral arterlerin tarafından oluşturulanserebral arter ve posterior iletişim arterlere bağlı.
MCAO intraluminal filament veya dikiş modeli en yaygın inme araştırmalarında kullanılan biridir. Ancak, bu modele farklı varyasyonlar bir çift vardır ve bu microfilament dış karotid arter içine takılı olup olmadığını dayalı 3 (ECA, Longa yöntemi olarak adlandırılır), ya da (ICA takılı olup olmadığını Koizumi olarak adlandırılır yöntemi) 4. Filament CCA içinde kesi kanamayı önlemek için kaldırılırsa Longa yönteminde kalıcı 5 bağlanmalıdır ECA ise Koizumi yöntemde, ameliyat tarafındaki karotis arter (CCA) kalıcı olarak bağlanmalıdır . Bu çok daha üstün ve iskemik inme bir daha klinik olarak cerrahi model hissediyorum burada Longa yöntemi kullanılacaktır. Bundan başka, özellikle Longa yöntemi ile bir silikon uçlu monofilin kullanımı, çok üretirgenellikle eksik tıkanıklığı ve / veya subaraknoid kanama 6 üretmek alev körelmiş monoipliklerin, aksine tekrarlanabilir MCAO.
Intraluminal filament yöntemi kalıcı veya geçici tıkanma 4,6 modeli olarak kullanılabilir. Geçici modeli gerçekleştirmek için, filament iskemi bir süre sonra çıkartılır (örneğin, 30 dakika, 60 dakika ya da 2 saat) ve reperfüzyon meydana bırakılır. Bu model, bir ölçüde, insanlarda bir tromboembolik pıhtı eritmek için kendiliğinden ya da terapötik müdahale (örneğin, tPA uygulama) sonrasında kan akımının restorasyon simüle eder. Sürekli modeller için, filament, sadece bir zaman süresi (örneğin, 24 saat) yerinde kalır, bu nedenle bir reperfüzyon oluşur. lümen içi filament yöntemin diğer bir avantajı, bir kranyotomi kafatası sağlam kalmasına olanak sağlayan ve intrakranyal basınç ve sıcaklık değişiklikleri önlemek gerçekleştirilebilir gerekmez gerçektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
video bildirilen Bu protokol ve deneyler LSUHSC-S Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve NIH kurallarına uygundur bulundu.
Not: Erkek C57BL / 25 ağırlığında 6 fareleri - 29 g Bu çalışmada kullanılmıştır. farenin tek havalandırılmış kafeslerde, 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü altında, suya serbest erişim ile standart bir yiyecek topağı diyet ile beslendi. Prosedür steril teknikler (örneğin, steril eldiven, steril aletleri) kullanılarak steril koşullar altında yapılacaktır.
1. Ön cerrahi Hazırlıklar
- Ketamin (150 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) bir kombinasyonu kullanılarak anestezi neden intraperitonal (ip) enjekte edilmiştir. anestezi sağlanır kez 5 dakika ve her 10 dakikada - başlangıçta ayak tutam her 3 ile anestezi derinliği izleyin. hayvan anestezi altında iken, kuruluğunu önlemek için steril göz merhem yönetmek. ketamin başlangıç dozu / xylazine genellikle ab sürer30-40 dakika dışarı. ayak tutam hayvanın tepki ile teyit edildiği, gerektiğinde ilave bir doz olarak uygulanabilir.
- sıcaklık ayarlı ısı mat bir yatar pozisyonda fareler yerleştirin ve bir rektal sonda kullanılarak doğrulanmış olan 36.5 ± 0.1 ° C, vücut ısısını korumak.
- boyun Tıraş ve% 70 etil alkol ile cilt dezenfekte edin.
MCA 2. Oklüzyon (Şekil 1)
- İris düz makas kullanarak bir orta hat boyun kesi yapmak ve damarları açığa çıkarmak için yumuşak dokuları (retraktörler kullanarak) geri çekin.
- vagus siniri zarar vermeden Dumont forseps kullanılarak çevreleyen dokudan CCA ve ECA teşrih.
- 6-0 ipek kullanılarak CCA etrafında gevşek bir düğüm atarak geçici bir dikiş yapın.
- ECA etrafında kalıcı bir dikiş ve sıkıca damarları (CCA çatallanma distal) bağlanarak kendisine uzanan küçük gemilere olun.
- Bir dikiş aro yapınCCA çatallanma ECA proksimal und.
- internal karotis arter (ICA) ve pterygopalatine arter (KİK) etrafında bir mikrovasküler klip yerleştirin.
- yaylı makas diseksiyon mikro kullanarak ECA küçük bir kesi yapmak ve 180 mikron silikon uçlu monofilament yerleştirin. filamanın kolay manipülasyon için mümkün olduğunca kalıcı sütür kesme yakın olun.
- takılı filament ile ECA etrafında geçici sütür sıkın ve mikrovasküler klibi çıkarın.
- Kalıcı, distal sütür ve yaylı makas diseksiyon mikro kullanarak filamanın giriş noktası arasındaki ECA kesti.
- MCA içinde - (CCA çatallanma ötesinde 10 mikron. Yaklaşık 9) direnç hissedene kadar ICA aracılığıyla filamanın Kılavuzu.
NOT: filamanın çoğunluğu hala görünür iken çok fazla direnç hissedilir durumunda, Filament PPA girmiş olabilir. Bu durumda, yavaşça irin, çatallanma geri filamanın çekmeileri ICA kullanarak Dumont forseps içine h ve ICA görüntülenebilir kadar filamanın ilerlemek.
3. reperfüzyon
- 30 dakikalık oklüzyon döneminden sonra, yavaşça geri çekerek Dumont forseps kullanarak filamanın kaldırmak ve ECA açık ucundan etrafında dikiş sabitleyin.
- dikkatle CCA ile sürdürülür Dumont forseps ve kan akışını kullanarak bitişik harfleri gevşeterek CCA etrafında geçici dikiş çıkarın.
- Sürekli cerrahi sütür ile kesi kapatın. cilt kapatılması ya sürekli veya kesintili dikiş ile gerçekleştirilebilir. Cilt zımba da kabul edilebilir bir yöntemdir.
- hacim ikmal olarak ve analjezik karprofen ile tuzlu subkutan 1 ml ile fareler enjekte (5 mg / Kg, sc) cerrahi prosedür, ek ağrı kesici geri hunched dahil gerekli işaret İşaretler, ungroomed ceket ağrı ve rahatsızlık giderilmesi için, azalmış aktivite anormalpostür ve iştah azalması.
- sıcaklık kontrolörü kullanarak düzenlenmiş bir ısı lambası kullanarak ısıtılmış 30 ° C kafeste anestezi kurtarma boyunca fareler gözlemlemek ve yeme teşvik etmek için kafesin katta bir petri püresi chow yerleştirin. fareler reperfüzyon döneminde kafes başına bir yer olacaktır.
4. Sham Cerrahisi
- monofilament ekleme olmadan aynı prosedüre tabi fareler.
5. Post-operatif nörolojik değerlere göre (Tablo 1, Şekil 2)
- Nörolojik Genel değerlendiren 18 maddelik skorlama sistemi kullanılarak uygun reperfüzyon döneminden sonra fareler değerlendirmek; Motor; Duyusal; Propriyosepsiyon. Daha yüksek nörolojik puan nörolojik fonksiyonu azalmış karşılık gelir.
NOT: yürümek tepkisiz ve yapamaz değerlendirilecektir Fareler ötenazi olacaktır. insani ötanazi için diğer kriterler% 20'den fazla bir ağırlık kaybı içerir, solunum diCerrahi alanı çevresinde stres ve enfeksiyon. Bir CO2 odası servikal dislokasyon ya torakotomi olacak ölüm onaylamak için ötanazi ve fiziksel yöntem için kullanılır.
Ölçüm Beyin Enfarktüs Hacminin 6. (Şekil 3)
- anestezi sağlandıktan sonra 5 dakika ve her 10 dakika - ketamin (150 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg), ilk ayak tutam her 3 ile anestezi ip monitör derinliği enjekte bir kombinasyonu kullanılarak anesteziye neden.
- Bir yatar pozisyonda fareler yerleştirin ve iris düz makas kullanarak periton ardından boyun karın cildi kesti.
- Dumont forseps kullanarak sternum yukarı kaldırın ve kalp maruz kaburga kesti.
- kalbi açığa sol ve hemostat iki çift kullanarak göğüs sağ tarafını açın.
- Sol ventrikül içine bir 5 ml şırıngaya bağlanmış bir 26 G iğne takın ve sağ atriyum kesilmiş. Oda sıcaklığı normal serum fizyolojik veya Phospa serpmekte tamponlu tuz (PBS) Sıvı berrak hale gelinceye kadar (çoğunlukla 3-5 dakika).
- iris düz makas ve Dumont forseps kullanarak dikkatli bir şekilde beyin uzak kafatası çıkarın.
- koku ampuller ve beyin matriks içinde uyacak şekilde bir jilet kullanarak beyincik kesti. Hatta segmentler halinde beyin dilim için bu matrisi kullanın. serin doku tutmak için kullanımdan önce matrisi Chill. matriks içine beyin yerleştirin ve buz üzerinde ayarlayın.
- İki Jilet kullanarak 2 mm koronal kesimleri içine beyin dilimleyin. üstten 2 mm başlayan bir jilet kullanarak ilk kesim olun ve yerine bu jilet bırakın. İlk arkasında kesilmiş başka bir 2 mm yapın. Ekli doku ile ilk jilet çıkarın. Tüm doku dilimlenmiş kadar bu işlemi tekrarlayın.
NOT: 4 olmalıdır - Bittiğinde 5 segmentleri. - Daha sonra sığ bir su banyosu içine yerleştirilir% 2 2,3,5-triphenyltetrazalium klorür (TTC) içeren 24 oyuklu plaka segmentleri yerleştirin20 dakika T 37 ° C. Tek bir kuyuya her kesimi yerleştirme onlar kesildi sırayla onları tutmaya yardımcı olur. TTC çözüm tamamen doku segmentlerini kapsayan emin olun. 10 dakika tüm dilimleri üzerinde açtıktan sonra.
- Yeni 24-kuyulu plakanın kuyularına% 10 formalin küçük bir miktar ve kesilmiş sırayla Bu plaka segmentleri aktarın.
- (NIH 1.57 Görüntü Yazılımı) 6 bilgisayara segmentleri tarayın ve ImageJ analiz yazılımı kullanılarak tüm beyin dilim 6 bir yüzdesi olarak infarkt analiz.
- Bir alan ölçümü oluşturmak için enfarkte alanı özetlemektedir. Sonraki alanı belirlemek için tüm taraf yarımküre ölçün. kontralateral yarımkürenin alanına göre infarkt alanını bölün ve enfarktüs hacmini belirlemek için 100 ile çarpın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fareler reperfüzyon süresi ardından 30 dakika MCAO-kaynaklı beyin iskemisi (Şekil 1) uygulandı (24 saat, 1 hafta, burada sunulan, ancak reperfüzyon uzunluğunun değiştirilmesi olabilir). MCAO sırasında ölüm (yaklaşık% 2) çok az oldu. Mesaj iskemi, (ilk 24 saat içinde) ölüm oranı yaklaşık% 26 idi.
Lazer Doppler flowmetre öncesi ve MCAO / reperfüzyon sonrası MCA topraklarında kan akımı perfüzyon teyit etmek için kullanıldı. 4 geçici CCA kravat iplik kaldırılması ve meydana gelmesi reperfüzyon için iskemi 30 dakika sonra serbest bırakıldığında, bir dalgalanma olduğunu açıkça göstermektedir Şekil <başlangıç perfüzyon (yani ameliyat öncesi) reperfüzyon içine 5 dakika% 100 ulaştı perfüzyon, içinde.
inme başlangıcından (önceki enfarktüs hacminin ölçümü) Neurol sonra 24 saatGenel, duyusal, motor ve proprioseptif açıklarına ilişkin ogical puanlar (Tablo 1) değerlendirildi. Bu skorlama sistemi objektif ( 'evet veya hayır') değerlendirmesinde uygulanacak kriterler sağlamak için tasarlanmıştır. Şekil 2 11.50 ± 1.5 (24 saatte fareler için puanı (n = 27) 12.56 ± 0.7 idi ve 1 hafta sonra yüksek kaldığını gösteriyor ). Daha yüksek nörolojik puan nörolojik fonksiyonu azalmış karşılık gelir.
Enfarktüs hacimleri sahte hayvanlardan daha fazla 24 saat, yani nörolojik skoru benzer desenler yansıtılmış. 1 hafta sonrası inme (28.5 ± 1.9%) artan edilmiştir: 24 saat MCAO sonra fareler büyük enfarktüs hacimleri (15.9 ± 2.6% Şekil 3) vardı.
Şekil 1: Orta Serebral Arter Tıkanıklığı Konumunu gösteriliyor şematik(MCAO) Cerrahi ve Serebral Dolaşım Büyük damar Damarlanma. A. Cerrahi MCAO dış karotid artere ve sonra proksimal orta karotid arter içine filamanın yerleştirilmesi ile elde edilir. BG. MCAO uyarılması için adımlar. Anterior iletişim arter (ACA); orta serebral arter (MCA); iletişim arter (PcomA) posterior; serebral arter (PCA) posterior; baziler arter (BA); internal karotis arter (ICA); Dış karotid arteri (ECA); Pterigopalatin arteri (PPA); internal karotis arter (ICA). (Smith ve ark. Izni ile Modifiye, referans içerisinde 5.). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. 18 noktalı İnme Puan Bu comprehensiA.Ş. inme skor genel ve duyusal, motor ve bir inme sonrası fare davranışının proprioseptif yönleriyle işlevsel iyileştirmeler değerlendirir. Veri ± SEM. * P <0.05. n = / grup 3 fare. veri ANOVA kullanılarak analiz artı bir Bonferroni post hoc testi yapıldı. (Smith ve ark. Izni ile Modifiye, referans içerisinde 5.). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3,.:. MCAO sonra fareler, C57BL / 6 fareleri 24 saat arasında infarkt hacmi kaldırılır kesit% 2 ile boyandı 30 dakika MCAO 24 saat ya da reperfüzyon A) Brain 1 wk tabi tutuldu 2,3,5 triphenyltetrazolium klorür (TTC). canlı doku olarak dehidrogenazlar enzimatik 1,3,5-gezi TTC azaltmakKırmızı renk, ancak iskemik dokuda enzim işlevsel değil, bu yüzden doku beyaz kalır. B) Grafik felç vardı sahip farelerde enfarktüs hacminde bir artış göstermektedir henylformazaon (TPF). Veri ± SEM. ** P <0.002, **** p <sahte karşı 0.0001; n = / grup 4 fare. veri ANOVA kullanılarak analiz artı bir Bonferroni post hoc testi yapıldı. Ölçek çubuğu = 1 cm (Smith ve ark. Izni ile Modifiye, referans içerisinde 5.). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Perfüzyon MCAO ve reperfüzyon Fareler boyunca MCA alanının 30 dakika MCAO tabi tutuldu ve <5 dakikalık reperfüzyon. Taban% 100'e normalize edilmiştir. deneyimlerini olarakdoku hiçbir perfüzyon oluştuğunda CTED, reperfüzyon dönemi içine perfüzyon 5 dk, yani MCAO, daha yüksek oldu. Veri ± SEM. * P <0.05. n = / grup 3 fare. veri ANOVA kullanılarak analiz artı bir Bonferroni post hoc testi yapıldı. (Smith ve ark. Izni ile Modifiye, referans içerisinde 5.). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1: Nörolojik Puanlama Sistemi testlerin her bir evet cevabı için verilen bir nokta.. 18 7,8 dışarı işaretler.
| Test | Kısa açıklama | Ne test ediyor? | Referanslar |
| Morris su labirenti | kemirgenler gizli bir platform üzerine sudan kaçmak için öğrenmek Açık alan su labirent prosedürü | Mekansal hafıza, hareket kontrolü ve bilişsel haritalama | 19 |
| rotarod | kemirgenler ileri yürümek gerekir yatay dönen çubuk kadar düşmek değil | Motor koordinasyon, denge ve kavrama gücü | 20 |
| Kutup | Kemirgenler bir kafese aşağı onların önünü açmak olarak kayma veya düşme bir kutup üzerine yerleştirilir ve gözlenen | kortikal hasar nedeniyle hareket bozuklukları | 21, 22 |
| yürüme analizi | kemirgenler bir cam levha çapraz olarak kendi pençe baskılar onların hareketlerini incelemek üzere yakalanır | Yürüyüş desenleri (pençe basıncı, adım uzunluğu, genişliği ve frekans, ayak yayılması, yürüyüş açı ve vücut döndürme)ve motor koordinasyon | 23, 24 |
| Yapışkan etiket testi | kemirgenler forepaw saçsız kısmına uygulanan bant şeritler kaldırılması her pençe, temas sırasını, kaldırma zamanı ve düzeni temas süresini kaydetmek için | Forepaw duyarlılık ve sensorimotor açıkları | 25, 26 |
| Köşe | 30 ° açı oluşturan iki kurulları arasına yerleştirilen Kemirgenler; burun kılı her iki tarafı da uyarılır köşe ve kemirgen rears derinliklerine girerek ve geri döndüğünde açık ucu yüz | Nörogelişimsel bozukluklar ve tekrarlayan davranışlar (izleme ters yönde karşı tek yönde döner) | 27, 28 |
| silindir | duvarın karşı yetiştirme kaydedilirken Kemirgenler ön ayakları etkinliği olan bir cam silindir içine yerleştirilir | Lokomotor asimetri ve Poststr değerlendirmekoke ekstremite kullanımı | 28 |
| Merdiven | Bir baited çift merdiven ile bir kutu içinde bir platform üzerine yerleştirilen Kemirgenler; kemirgenler yiyecek merdiven yem toplamak için hareket tanıtmak için kısıtlanır | bağımsız duyusal kapasiteleri gerektiren her ön ayakları için yeteneklerini ulaşan maharet ve motor koordinasyon | 25, 29 |
| Merdiven | Kemirgenler kendi kafesini ulaşmak için yatay bir merdiven üzerinde yürümek; kaydedilir merdiveni karşısında yürürken ayak fişleri | hareket sırasında ayak hataları; ön ayakları ve hindlimb fonksiyonu ve koordinasyon | 30 |
Tablo 2: Fare Davranış Testleri örnekleri.
| Aşağıdaki gibi GLP için öneri: |
| - Inme modeli seçildi olan özel ayrıntıları (örneğin, Koizumi vs Longa) ve açıkça bildirilen zorlanma, yaş, cinsiyet, ağırlık. |
| - Bir çift-kör bir şekilde yapılan çalışmalar. |
| - Güç analizi bildirdi. |
| - Çalışmaya dahil olan ve olmayan kriterler önce çalışmaya karar verdi ve rapor. |
| - Sıkıntı, ağrı veya hastalık herhangi bir belirti günlük (temel görünüş, vücut ağırlığı ve davranış) izlenen Hayvanlar. |
| - Çalışmanın dışında hayvanların Raporlama. |
| - Gruba hayvanların Randomizasyon. |
| - & #160; Negatif ve pozitif sonuçların raporlanması. |
| - Cerrahi, anestezi, vücut ısısı ve kan gazları uzunluğu Raporlama. |
| - Varsa, kullanılan çevre zenginleştirme Raporlama. |
Tablo 3: İyi Laboratuar uygulamaları için öneriler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
20 yıl önce anlayışı bu yana, bir filamanın sokulmasını kapsayan insan inme için MCAO modeli çalışmaları çok sayıda kullanılmıştır. Bunun nedeni o inme (yani, iskemik inme) en sık görülen klinik ne taklit gerçeği esas olarak. striatum serebral korteks daha iskemi karşı daha duyarlıdır ve bu nedenle, iskemik sürenin uzunluğu striatum ve dorsolateral korteks hem de etkilenmiş, ya da sadece striatum olup olmayacağı çevirmek olacaktır. Hem enfarktüs ve reperfüzyon süreleri buna göre değiştirilebilir ve bu araştırmacı çok daha büyük infarktlara geçici iskemik atak (GİA) ile ilişkili patolojik etkilerini incelemek mümkün olanağı sunar.
Yıllar boyunca modifikasyonları ve MCAO filament yöntemi sorun prosedürü önemi enfeksiyonu 9 riskini önlemek için, steril şartlarda gerçekleştirilen göstermiştir. Sonuçlar değişebilirkemirgen türleri arasında, gerilme 10,11, ağırlık ve anestezikler kullanılır (anatomik varyasyonlar gösterilmiştir), ama burada sunulan sonuçlar eğilimler MCAO yapılır diğer laboratuarlarda yansıyan olması muhtemeldir. dikkate almak, diğer kritik adımlar vücut ısısı, kan basıncı ve kan gazları bulunmaktadır. İyi hipotermi 12 ve daha şiddetli açıkları ile ilişkili küçük lezyonlar hipertermi 13 gösterilmek ile vücut ısısı, nörolojik hasar etkilediği tespit edilmiştir. 36.5 ° C vücut sıcaklığı muhafaza etmek için bu gibi, ısı, bir ısı pedi hayvan sıcaklık kontrol kullanımı ile, örneğin, ölçülen ve kontrol edilmelidir. Cilt ikmal ve kafesin dibinde yumuşatmak yemi koyarak yeme teşvik de gözlemlemek için ek faktörlerdir. Kan basıncı ve kan gazları 6,14 hem kolay ölçülebilir ve Commerc hali hazırda mevcut ekipman kullanılarak takipial tedarikçileri.
MCAO tekniğinin Sınırlamalar düzgün zarar vermeden arterlerden vagus siniri diseksiyon ve etkili inme neden yeteneği, aynı zamanda fare hayatta kalma oranını sadece etkileyebilir PPA, içine filamanın ilerleyen kaçınarak içerir. Burada anlatılan Longa yöntemi kullanılarak in vivo MCAO yöntemlerde alternatif açısından en önemli, hayatta kalma oranı. Ayrıca, bu modeli, bir kez hakim, inme tedavisi için potansiyel terapötik hedefler incelemek için mükemmel bir araç yapmak lökosit-endoteliyal hücre etkileşimleri ve artan infarkt hacmi, karşılık gelen bulmuşlardır.
Biz herhangi burada rapor olmasına rağmen, davranışsal testler sayısı da (Tabloya bakınız örneğin Morris su labirenti, rotarod, kutup testi, yürüme analizi, yapışkan etiket testi, köşe testi, silindir testi, merdiven testi ve merdiven testi olarak yapılabilirDetaylar ve referanslar) 2. Sham hayvanlar bu davranış testleri tamamladıktan ile sorunumuz yok; Ancak, inme hayvanlar daha az başarıyla bu testleri. Bunun ardından, tartışmanın bir alanda çevresel zenginleştirme sadece MCAO modelinin tekrarlanabilirlik etkileyip etkilemediğini, aynı zamanda davranış testlerinden 15 sonucunu etkileyecek olup olmadığıdır. Bu belli değil, ancak laboratuvarda içinde bu standardize değer ve çalışma boyunca.
inme sonucu ölçmek için kullanılabilir farklı testler bir bolluk vardır. Biz kan akışı ölçümlerinde, derinlemesine bir 18-noktalı nörolojik değerlendirme puanı için lazer doppler istihdam sunulan ve aynı zamanda hacim ölçümleri infarkt var. Bununla birlikte, ek seçenekler gibi görüntüleme gibi, aynı zamanda faydalıdır. Biz rutin cere içinde (inflamatuar yanıtın karakteristik) hücresel etkileşimleri çalışmak için intravital floresan mikroskopi kullanımını 6 istihdamanestezi altındaki hayvanlara 5,6,16 gerçek zamanlı olarak Bral mikrodolaşım. MCAO ve reperfüzyon, SHAM hayvanlarına 5,6,16 karşı yüksek bir serebral inflamatuar yanıtı oluşturur. Klinik olarak alakalı uzunlamasına çalışmalar için fırsat sağlamak gibi manyetik rezonans görüntüleme 17 ve pozitron emisyon tomografisi 18 gibi diğer görüntüleme yöntemleri de kullanılabilir.
Beyin dokusu histolojik analiz, plazma ve serum numuneleri rutin olarak felç patofizyolojik yanıtların daha karakterizasyonu izin verdiği gerçekleştirilen ve mekanizmalar dahil, fakat aynı zamanda ve belki de daha önemlisi, araştırmacılar sonuç üzerine bileşiklerin etkilerini incelemek için izin alınmalıdır inme, böylece bu zayıflatıcı ve yıkıcı hastalık için potansiyel terapötik hedefler için önemli veriler sağlar. Son olarak, araştırmacıların sadece en uygun inme modeli ba dikkate için son derece tavsiye edilir inanıyorumonların çalışma için gereksinimleri sed, ama aynı zamanda GLP ( "İyi Laboratuar uygulaması") zorunlu yapılır. GLP önerileri için Tablo 3'e bakın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | #000664 | |
| Ketamine Hydrochloride | Morris & Dickson, Shreveport, LA | 67457-108-10 | |
| Xylazine | Akorn, Inc, Lake Forest, IL | NADA# 139-236 | |
| DC temperature control system | FHC, Bowdoin, ME | 40-90-8D | |
| Mini rectal thermistor probe | FHC, Bowdoin, ME | 40-80-5D-02 | |
| Heating pad | FHC, Bowdoin, ME | 40-90-2-06 | |
| Clippers | Amazon, Bellevue, WA | #64800 | |
| 70% ethanol | Worldwide Medical Products, Bristol, PA | #51011023 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Center Valley, PA | SZ40 | |
| Iris scissors (straight) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 11251-20 | |
| Dumont forceps (45° bent tip) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 11297-00 | |
| Micro vessel clip | Fine Science Tools, Foster City, CA | 18055-05 | |
| Micro dissecting spring scissors (straight) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 14088-10 | |
| Retractors (blunt) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 18200-11 (Helen used 17022-13) | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific, Waltham, MA | 23-400-100 | |
| Gauze sponges | Covidien, Mansfield, MA | #9023 | |
| 7-0 silk braided surgical suture | Braintree Scientific, Braintree, MA | SUT-S103 | |
| 0.9% sodium chloride | Morris & Dickson, Lake Forest, IL | 0409-4888-20 | |
| 6-0 medium MCAO suture (silicon rubber coated monofilament) | Doccol Corporation, Sharon, MA | 6023PKRe | |
| Sofsilk 6-0 silicone coated braided silk | Covidien, Mansfield, MA | SUT-14-1 | |
| Carprofen | Pfizer, New York, NY | NADA# 141-199 | |
| Puralube | Dechra, Norwich, UK | NDC 17033-211-38 | |
| Physitemp temperature controller | Harvard Apparatus, Holliston, MA | TCAT-2AC | |
| Heat lamp | Harvard Apparatus, Holliston, MA | HL-1 | |
| Laser doppler probe | AD Instruments, Colorado Springs, CO | MSP100XP | |
| 24-well plates | Fisher Scientific, Waltham, MA | #353226 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies, Carlsbad, CA | 20012-050 | |
| Single edge razor blades | Fisher Scientific, Waltham, MA | 12-640 | |
| 2,3,5-triphenyltetrazalium chloride (TTC) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | T8877-50G | |
| Mouse brain matrix slicer | Braintree Scientific, Braintree, MA | BS-A 5000C | |
| Water bath | VWR, Radnor, PA | #182 | |
| 10% formalin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | HT501128-4L | |
| ImageJ analysis software | NIH, Bethesda, MD | free download | |
| Retractor | Medical Device Purchase, Newcastle, CA | MP-740 |
References
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Marks, M. P., et al. Patients with acute stroke trated with intravenous tPS 3-6 hours after stroke onset: correlations between MR angiography findings and perfusion- and diffusion-weighted imaging in the DEFUSE study. Radiology. 249 (2), 614-623 (2008).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimnetal model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. (8), 1-8 (1986).
- Smith, H. K., Russell, J. M., Granger, D. N., Gavins, F. N. E. Critical differences between two classical surgical approaches for middle cerebral artery occlusion-induced stroke in mice. J Neurosci Meth. 249, 99-105 (2015).
- Gavins, F. N., Dalli, J., Flower, R. J., Granger, D. N., Perretti, M. Activation of the annexin 1 counter-regulatory circuit affords protection in the mouse brain microcirculation. FASEB J. 21 (8), 1751-1758 (2007).
- Chen, J., et al. Atorvastain induction of VEGF and BDNF promotes brain plasticity after stroke in mice. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 281-290 (2005).
- Li, Y., et al. Intrastriatal transplantation of bone marrow nonhematopoietic cells improves functional recovery after stroke in adult mice. J Cereb Blood Flow Metab. 20 (9), 1311-1319 (2000).
- Liesz, A., et al. The spectrum of systemic immune alterations after murine focal ischemia; the immunodepression versus immunomodulation. Stroke. 40 (8), 2849-2858 (2009).
- Beckmann, N. High resolution magnetic resonance angiography non-invasively reveals mouse strain differences in the cerebrovascular anatomy in vivo. Magn Reson Med. 44 (2), 252-258 (2000).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
- Burk, J., Burggraf, D., Vosko, M., Dichgans, M., Hamann, G. F. Protection of cerebral microvasculature after moderate hypothermia following experimental focal cerebral ischemia in mice. Brain Res. (1226), 248-255 (2008).
- Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthemia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
- Shin, H. K., et al. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39 (5), 1548-1555 (2008).
- Richter, S. H., Garner, J. P., Würbel, H. Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments? Nat Methods. 6 (4), 257-261 (2009).
- Holloway, P. M., et al. Both MC1 and MC3 receptors provide protection from cerebral ischemia-reperfusion-induced neutrophil recruitment. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, (2015).
- Vandeputte, C., et al. Characterization of the inflammatory response in a photothrombotic stroke model by MRI: implications for stem cell transplantation. Mol Imaging Biol. 13 (4), 663-671 (2010).
- Iwae, Y., et al. Glial cell-mediated deterioration and repair of the nervous system after traumatic brain injury in a rat model as assessed by positron emission tomography. J Neurotrauma. 27 (8), 1463-1475 (2010).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci Methods. 11 (1), 47-60 (1984).
- Mouzon, B., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in a mouse model produces learning and memory deficits accompanied by histological changes. J Neurotrauma. 29 (18), 2761-2773 (2012).
- Fleming, S., et al. Early and progressive sensorimotor anomalies in mice overexpressing wild-type human α-synuclein. J Neurosci. 24 (42), 9434-9440 (2004).
- Sedelis, M., Schwarting, R. K. W., Huston, J. P. Behavioral phenotyping of the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 125 (1-2), 109-125 (2001).
- Toon, L., Silva, M., D'Hooge, R., Aerts, J. M., Berckmans, D. Automated gait analysis in the open-field test for laboratory mice. Behav Res Methods. 41 (1), 148-153 (2009).
- Lubjuhn, J., et al. Functional testing in a mouse stroke model induced by occlusion of the distal middle cerebral artery. J Neurosci Methods. 184 (1), 95-103 (2009).
- Bouët, V., Freret, T., Toutain, J., Divoux, D., Boulouard, M., Schumann-Bard, P. Sensorimotor and cognitive deficits after transient middle cerebral artery occlusion in the mouse. Exp Neurol. 203 (2), 555-567 (2007).
- Freret, T., et al. Behavioral deficits after distal focal cerebral ischemia in mice: usefulness of adhesive removal test. Behav Neurosci. 123 (1), 224-230 (2009).
- Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature Neurosci. 17, 400-406 (2013).
- Balkaya, M., Kröber, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow. 33, 330-338 (2012).
- Wiessner, C., et al. Anti-nogo-a antibody infusion 24 hours after experimental stroke imporved behavioral outcome and corticospinal plasticity in normotensive and spontaneously hypertensive rats. J Cereb Blood Flow Metab. 23, 154-165 (2003).
- Schaar, K. L., Brenneman, M. M., Savitz, S. I. Functional assessments in the rodent stroke model. Exp Transl Stroke Med. 2 (13), (2010).
