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मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा और चूहे में Reperfusion प्रेरित स्ट्रोक के लिए शल्य दृष्टिकोण

Published: October 20, 2016 doi: 10.3791/54302
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular & Cellular Physiology, Health Sciences Center Shreveport, Louisiana State University

Summary

आदेश स्ट्रोक के pathophysiology समझने के लिए, यह विश्वसनीय मॉडल का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस पत्र चूहों में सबसे अक्सर इस्तेमाल किया स्ट्रोक मॉडलों में से एक का वर्णन करेंगे, मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (MCAO) मॉडल करार दिया reperfusion के साथ (भी intraluminal रेशा या सिवनी मॉडल कहा जाता है)।

Abstract

स्ट्रोक दुनिया भर में मौत का एक प्रमुख कारण है और लंबी अवधि वयस्क विकलांग के प्रमुख कारणों में से एक बना हुआ है। स्ट्रोक के बारे में 87% मूल में इस्कीमिक कर रहे हैं और मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) के क्षेत्र में होते हैं। वर्तमान में केवल खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) ने इस घातक बीमारी के इलाज के लिए दवा को मंजूरी दी ऊतक plasminogen उत्प्रेरक (टीपीए) है। हालांकि, टीपीए प्रशासन के लिए एक छोटी सी खिड़की है चिकित्सीय (3 - 6 घंटा), और रोगियों को जो वास्तव में इसे प्राप्त करने के 4% में ही प्रभावी है। वर्तमान अनुसंधान के क्रम में संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों को खोजने के लिए स्ट्रोक के pathophysiology को समझने पर केंद्रित है। इस प्रकार, विश्वसनीय मॉडल महत्वपूर्ण हैं, और एमसीए रोड़ा (MCAO) मॉडल (भी intraluminal रेशा या सिवनी मॉडल कहा जाता है) सबसे नैदानिक ​​प्रासंगिक इस्कीमिक स्ट्रोक की शल्य चिकित्सा मॉडल माना जाता है, और काफी गैर-आक्रामक और आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। आमतौर पर MCAO मॉडल मूषक के साथ प्रयोग किया जाता है, विशेष रूप से की वजह से चूहों के साथसभी आनुवंशिक इस प्रजाति के लिए उपलब्ध बदलाव के लिए। यहाँ हम वर्णन (और वीडियो में मौजूद) कैसे सफलतापूर्वक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा उत्पन्न करने के लिए MCAO मॉडल (reperfusion) के साथ चूहों में प्रदर्शन करने के लिए।

Introduction

स्ट्रोक एक व्यक्ति रोग से मरने हर 4 मिनट के साथ दुनिया भर में मौत का पांचवां प्रमुख कारण है। 800,000 से अधिक अमेरिकियों के एक ही झटके में हर साल है, जो केवल रोगी के लिए घातक नहीं है पीड़ित हैं, लेकिन यह भी उनके परिवारों के लिए। स्ट्रोक वयस्क विकलांगता का मुख्य कारण है और वार्षिक व्यय बहुत कुछ उपचार के विकल्प उपलब्ध होने के बावजूद 36.5 $ 1 अरब के क्रम में होने का अनुमान है।

ऊतक plasminogen उत्प्रेरक (टीपीए) केवल खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) इस्कीमिक स्ट्रोक के लिए दवा लाइसेंस प्राप्त है। हालांकि, यह केवल प्रभावी अगर स्ट्रोक के शुरू होने से 3-6 घंटे के भीतर रोगियों को दिलाई, और इन मामलों में यह रोगियों 2 के केवल 4% लाभ है। इसलिए, यह जरूरी है कि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, स्ट्रोक का चिकित्सकीय प्रासंगिक पशु मॉडल संभावित चिकित्सीय रणनीतियों और इस रोग के लिए उपचार के विकास में सहायता करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। यह ध्यान रखें कि इन विट्रो में महत्वपूर्ण है इन विवो मॉडल जरूरी है।

स्ट्रोक का सबसे आम प्रकार कुल स्ट्रोक के 87% के लिए लेखांकन मूल में इस्कीमिक है। अन्य स्ट्रोक इन्ट्रासेरेब्रल नकसीर (9%) और subarachnoid नकसीर (4%) कर रहे हैं, और मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) के लिए एक एम्बोली द्वारा सबसे अधिक बार वजह से हैं। इस एमसीए की जड़ में प्रमुख अवस्था है, जो बाधित बनने के लिए मस्तिष्क में प्रवेश लामिना रक्त के प्रवाह का कारण बनता है के कारण है। एमसीए आंतरिक मन्या धमनी (आईसीए) और मार्गों पार्श्व परिखा साथ, से उत्पन्न होती है, जहां यह शाखाओं और बेसल गैन्ग्लिया के लिए परियोजनाओं और ललाट, पार्श्विका और प्राथमिक मोटर और संवेदी कोर्टेक्स सहित अस्थायी पालियों, के पार्श्व सतहों। विलिस के सर्किल पीछे मस्तिष्क धमनियों जा रहा द्वारा बनाई गई हैमस्तिष्क धमनियों और पीछे से संवाद स्थापित करने धमनियों से जुड़ा है।

MCAO के intraluminal रेशा या सिवनी मॉडल सबसे व्यापक रूप से स्ट्रोक अनुसंधान में इस्तेमाल में से एक है। हालांकि, इस मॉडल के लिए अलग अलग रूपों के एक जोड़े हैं, और इन microfilament बाहरी मन्या धमनी में डाला जाता है, चाहे के आधार पर कर रहे हैं (ईसीए, करार दिया Longa विधि) 3, या यह (आईसीए में डाला जाता है कि क्या कोइज़ुमी करार दिया विधि) 4। कोइज़ुमी विधि में, आम मन्या धमनी (सीसीए) सर्जरी के पक्ष में स्थायी रूप से यदि रेशा सीसीए में चीरा से खून बह रहा रोकने के लिए निकाल दिया जाता है, जबकि Longa की विधि में यह ईसीए कि स्थायी रूप से 5 बंधे होने चाहिए जुड़ा होना चाहिए । यहाँ Longa पद्धति के रूप में हमें लगता है यह एक दूर बेहतर और एक अधिक चिकित्सकीय प्रासंगिक इस्कीमिक स्ट्रोक के सर्जिकल मॉडल है इस्तेमाल किया जाएगा। इसके अलावा, एक सिलिकॉन इत्तला दे दी monofilament का उपयोग करते हैं, विशेष रूप से Longa विधि के साथ, बहुत ही पैदा करता हैप्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य MCAO के रूप में लौ पा monofilaments, जो अक्सर अधूरी रोड़ा और / या subarachnoid नकसीर 6 का उत्पादन करने का विरोध किया।

Intraluminal रेशा विधि स्थायी या क्षणिक रोड़ा 4,6 की एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। क्षणिक मॉडल करने के लिए, रेशा ischemia की अवधि के बाद हटा दिया जाता है (उदाहरण के लिए, 30 मिनट, 60 मिनट, या 2 घंटा), और reperfusion होने की अनुमति दी है। यह मॉडल, कुछ हद तक, सहज या चिकित्सीय हस्तक्षेप (जैसे, टीपीए प्रशासन) मानव में एक thromboembolic थक्का lyse करने के बाद रक्त के प्रवाह की बहाली simulates। स्थायी मॉडल के लिए, रेशा बस समय की अवधि (जैसे, 24 घंटे) के लिए जगह में छोड़ दिया जाता है, तो कोई reperfusion होता है। intraluminal रेशा पद्धति का एक और लाभ यह है कि एक craniotomy की इजाजत दी खोपड़ी बरकरार नहीं छोड़ा जा सकता और intracranial दबाव और तापमान में कोई परिवर्तन से बचने के प्रदर्शन करने की आवश्यकता नहीं है, है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल और प्रयोगों वीडियो में सूचना दी LSUHSC-एस संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति ने मंजूरी दे दी है और एनआईएच के दिशा निर्देशों के अनुपालन में हो रहे थे।

नोट: नर C57BL / 6 वजन 25 चूहों - 29 ग्राम के इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया। चूहों को व्यक्तिगत रूप से हवादार पिंजरों में एक 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र के तहत, पानी के लिए स्वतंत्र पहुँच के साथ एक मानक चाउ गोली आहार पर बनाए रखा गया। प्रक्रिया बाँझ तकनीक (जैसे, बाँझ दस्ताने, बाँझ उपकरणों) का उपयोग कर बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन किया जाएगा।

1. पूर्व शल्य तैयारी

  1. ketamine (150 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) के संयोजन का उपयोग संज्ञाहरण प्रेरित intraperitoneally (आईपी) इंजेक्शन। पैर चुटकी शुरू में हर 3 से संज्ञाहरण की गहराई मॉनिटर - 5 मिनट और हर 10 मिनट में एक बार संज्ञाहरण हासिल की है। पशु संज्ञाहरण के तहत है, सूखापन को रोकने के लिए एक बाँझ नेत्र मरहम प्रशासन। ketamine के प्रारंभिक खुराक / xylazine आमतौर पर एबी रहता हैबाहर 30-40 मिनट। एक अतिरिक्त खुराक, अगर जरूरत है जो एक पैर चुटकी करने के लिए पशु की प्रतिक्रिया द्वारा सत्यापित है दिलाई जा सकती है।
  2. एक तापमान नियंत्रित गर्मी चटाई पर एक लापरवाह स्थिति में चूहों प्लेस और 36.5 ± 0.1 डिग्री सेल्सियस है, जो एक गुदा जांच का उपयोग कर सत्यापित है पर शरीर का तापमान बनाए।
  3. गर्दन दाढ़ी और 70% एथिल शराब के साथ त्वचा कीटाणुरहित।

2. एमसीए का रोड़ा (चित्रा 1)

  1. आइरिस सीधे कैंची का उपयोग कर एक midline गर्दन चीरा और जहाजों को बेनकाब करने के लिए (retractors का उपयोग) कोमल ऊतकों वापस लेना।
  2. वेगस तंत्रिका को नुकसान पहुँचाए बिना Dumont संदंश का उपयोग आसपास के ऊतकों से सीसीए और ईसीए काटना।
  3. सीसीए के चारों ओर एक ढीली गाँठ बांधने 6-0 रेशम का उपयोग करके एक अस्थायी सिवनी बनाओ।
  4. ईसीए के चारों ओर एक स्थायी सिवनी और छोटे जहाजों कसकर वाहिकाओं (सीसीए के विभाजन के लिए बाहर) ligating द्वारा इसे से देने बनाओ।
  5. एक सिवनी एआरओ बनाओसीसीए विभाजन को ईसीए समीपस्थ und।
  6. आंतरिक मन्या धमनी (आईसीए) और pterygopalatine धमनी (पीपीए) के चारों ओर एक microvessel क्लिप रखें।
  7. वसंत कैंची विदारक सूक्ष्म का उपयोग कर ईसीए में एक छोटा सा चीरा और एक 180 माइक्रोन सिलिकॉन इत्तला दे दी monofilament डालें। कटौती के रूप में फिलामेंट की आसान हेरफेर के लिए संभव के रूप में स्थायी सीवन के करीब बना।
  8. रेशा डाला साथ ईसीए के आसपास अस्थायी सीवन कसो और microvessel क्लिप को हटा दें।
  9. स्थायी, बाहर का सिवनी और फिलामेंट वसंत कैंची विदारक सूक्ष्म का उपयोग कर के प्रवेश बिंदु के बीच ईसीए कट।
  10. आईसीए के माध्यम से रेशा गाइड जब तक प्रतिरोध महसूस किया है - एमसीए में (लगभग 9 सीसीए के विभाजन से परे 10 माइक्रोन।)।
    नोट: इस घटना में बहुत अधिक प्रतिरोध जबकि फिलामेंट का बहुमत अभी भी दिखाई दे रहा है महसूस किया है, रेशा पीपीए में प्रवेश हो सकता है। यदि ऐसा होता है, बंटवारे के लिए वापस खींच रेशा धीरे मवादआगे आईसीए Dumont संदंश का उपयोग करने में एच, और फिलामेंट अग्रिम जब तक यह आईसीए में देखे जा सकते हैं।

3. Reperfusion

  1. एक 30 मिनट रोड़ा अवधि के बाद, धीरे इसे खींच वापस Dumont संदंश का उपयोग करके रेशा निकालने के लिए और ईसीए के खुले अंत के आसपास सीवन सुरक्षित।
  2. ध्यान से संयुक्ताक्षर Dumont संदंश और रक्त प्रवाह का उपयोग कर सीसीए के माध्यम से फिर से शुरू है ढीला द्वारा सीसीए के आसपास अस्थायी सिवनी निकालें।
  3. एक निरंतर शल्य सीवन के साथ चीरा बंद करें। त्वचा के बंद होने या तो सतत या बाधित टांके के द्वारा पूरा किया जा सकता है। त्वचा स्टेपल भी एक स्वीकार्य तरीका है।
  4. मात्रा आपूर्ति के रूप में और एनाल्जेसिक Carprofen साथ खारा subcutaneously के 1 मिलीलीटर के साथ चूहों इंजेक्ट (5 मिग्रा / किग्रा, अनुसूचित जाति) शल्य प्रक्रिया, लक्षण संकेत मिलता है कि अतिरिक्त दर्द से राहत वापस hunched शामिल की जरूरत है, ungroomed कोट से दर्द और बेचैनी से राहत के लिए, कम गतिविधि, असामान्यतेवर, और भूख की कमी हुई।
  5. एक गर्म 30 डिग्री सेल्सियस पिंजरे एक गर्मी दीपक एक तापमान नियंत्रक का उपयोग कर विनियमित का उपयोग करने में संज्ञाहरण से वसूली के दौरान चूहों का निरीक्षण करें और पिंजरे के फर्श पर एक पेट्री डिश में मैश किए हुए चाउ जगह खाने को प्रोत्साहित करने के लिए। चूहों reperfusion की अवधि के दौरान पिंजरे प्रति एक स्थित हो जाएगा।

4. नकली सर्जरी

  1. monofilament प्रविष्टि के बिना ही प्रक्रिया के अधीन चूहों।

5. पोस्ट ऑपरेटिव न्यूरोलॉजिकल स्कोर (तालिका 1, चित्रा 2)

  1. Neurologically एक 18 बिंदु स्कोरिंग प्रणाली जनरल का आकलन करने का उपयोग कर उचित reperfusion की अवधि के बाद चूहों का मूल्यांकन; मोटर; संवेदी; Proprioception। एक उच्च स्कोर न्यूरोलॉजिकल मेल खाती है स्नायविक समारोह में कमी आई है।
    नोट: चूहों कि अनुत्तरदायी और चलने में असमर्थ न्याय कर रहे हैं euthanized किया जाएगा। मानवीय इच्छामृत्यु के लिए अन्य मानदंडों को 20% से अधिक की एक वजन घटाने में शामिल होंगे, श्वसन diतनाव, और शल्य चिकित्सा क्षेत्र के आसपास संक्रमण। सीओ 2 चैम्बर मौत की पुष्टि करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था या thoracotomy होगी इच्छामृत्यु और शारीरिक विधि के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

6. ब्रेन रोधगलितांश मात्रा का मापन (चित्रा 3)

  1. 5 मिनट और हर 10 मिनट में एक बार संज्ञाहरण हासिल की है - ketamine (150 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) पैर चुटकी शुरू में हर 3 द्वारा इंजेक्शन संज्ञाहरण के आईपी मॉनिटर गहराई का एक संयोजन का उपयोग संज्ञाहरण प्रेरित।
  2. एक लापरवाह स्थिति में चूहों प्लेस और आइरिस सीधे कैंची का उपयोग गर्दन पेरिटोनियम के द्वारा पीछा करने के पेट से त्वचा में कटौती।
  3. उरोस्थि Dumont संदंश का उपयोग लिफ्ट और पसलियों में कटौती दिल को बेनकाब करने के लिए।
  4. बाएँ और छाती hemostats के दो जोड़े का उपयोग कर के दाईं ओर, दिल को उजागर खोलें।
  5. एक 26 जी सुई बाएं वेंट्रिकल में एक 5 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी डालें और सही आलिंद काटा। कमरे के तापमान सामान्य नमक या phospha साथ छिड़कनाते बफर खारा (पीबीएस) जब तक तरल पदार्थ स्पष्ट हो जाता है (आमतौर पर 3 - 5 मिनट)।
  6. खोपड़ी हटाये ध्यान से मस्तिष्क से दूर आईरिस सीधे कैंची और Dumont संदंश का उपयोग।
  7. घ्राण बल्ब और सेरिबैलम एक रेजर ब्लेड का उपयोग इतना है कि मस्तिष्क मैट्रिक्स में फिट होगा काट दिया। यहां तक ​​कि खंडों में मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए इस मैट्रिक्स का प्रयोग करें। उपयोग करने से पहले मैट्रिक्स टेंशन मत लो ऊतक शांत रखने के लिए। मस्तिष्क मैट्रिक्स में रखें और बर्फ पर यह निर्धारित किया है।
  8. 2 मिमी राज्याभिषेक दो रेज़र ब्लेड का उपयोग कर खंडों में मस्तिष्क टुकड़ा। एक रेजर ब्लेड ऊपर से 2 मिमी शुरुआत का उपयोग कर पहली कटौती करें और जगह में इस धार छोड़ दें। एक और 2 मिमी पहली पीछे कटौती करें। ऊतक संलग्न के साथ पहली धार निकालें। इस प्रक्रिया को दोहराएं जब तक सभी ऊतक कटा कर दिया गया है।
    नोट: 4 होना चाहिए - जब समाप्त 5 खंडों।
  9. 2% 2,3,5-triphenyltetrazalium क्लोराइड (टीटीसी), जो फिर एक उथले पानी से स्नान एक में रखा गया है जिसमें 24 अच्छी तरह से थाली में खंडों की जगहटी 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस। एक व्यक्ति में अच्छी तरह से प्रत्येक खंड रखने के लिए उन्हें जिस क्रम में वे काट रहे थे में रखने के लिए मदद करता है। सुनिश्चित करें कि टीटीसी समाधान पूरी तरह से ऊतक खंडों को शामिल किया। बाद 10 मिनट के सभी स्लाइस पर बारी।
  10. 10% formalin की एक छोटी राशि के लिए एक नया 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं में रखें और जिस क्रम में वे काट रहे थे में इस प्लेट को खंडों हस्तांतरण।
  11. कंप्यूटर में स्कैन खंडों और पूरे मस्तिष्क टुकड़ा 6 ImageJ विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के प्रतिशत के रूप रोधगलितांश आकार का विश्लेषण (एनआईएच 1.57 छवि सॉफ्टवेयर) 6।
    1. infarcted क्षेत्र को रेखांकित एक क्षेत्र माप उत्पन्न करते हैं। अगले क्षेत्र का निर्धारण करने के लिए पूरे contralateral गोलार्द्ध को मापने। contralateral गोलार्द्ध के क्षेत्र द्वारा रोधगलितांश क्षेत्र फूट डालो और रोधगलितांश मात्रा निर्धारित करने के लिए 100 से गुणा करें।

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Representative Results

चूहे कराना पड़ा 30 मिनट MCAO प्रेरित मस्तिष्क ischemia (चित्रा 1) reperfusion की अवधि के द्वारा पीछा (24 घंटा और 1 विकेटकीपर यहां प्रस्तुत कर रहे हैं, लेकिन reperfusion की लंबाई अलग किया जा सकता है)। MCAO के दौरान मृत्यु दर कम से कम था (लगभग 2%)। पोस्ट ischemia, मृत्यु दर (पहले 24 घंटा के भीतर) के आसपास 26% थी।

लेजर डॉपलर Flowmetry पहले और MCAO / reperfusion के बाद एमसीए के इलाके में रक्त के प्रवाह छिड़काव पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। चित्रा 4 स्पष्ट रूप से दर्शाता जब अस्थायी सीसीए टाई रेशा हटाने और घटित करने के लिए reperfusion ischemia के 30 मिनट के बाद जारी किया गया है, वहाँ एक रेला है कि छिड़काव, जो <आधारभूत छिड़काव (यानी, सर्जरी से पहले) reperfusion में 5 मिनट के लिए 100% तक पहुँच गया है।

स्ट्रोक शुरुआत (रोधगलितांश मात्रा की माप करने से पहले) न्यूरोल के बाद 24 घंटेसामान्य, संवेदी, मोटर और proprioceptive घाटे से संबंधित ogical स्कोर (तालिका 1) का मूल्यांकन किया गया। इस स्कोरिंग प्रणाली उद्देश्य ( 'हाँ या नहीं') मूल्यांकन के लिए मानदंड प्रदान करने का इरादा है। चित्रा 2 से पता चलता है कि 24 घंटे में चूहों के लिए स्कोर (एन = 27) 12.56 ± 0.7 था, और 1 हफ्ते बाद उच्च बनी (11.50 ± 1.5 )। एक उच्च स्कोर न्यूरोलॉजिकल मेल खाती है स्नायविक समारोह में कमी आई है।

रोधगलितांश मात्रा में 24 घंटा, यानी, नकली पशुओं से अधिक पर न्यूरोलॉजिकल स्कोर करने के लिए इसी तरह के पैटर्न नजर आता है। है, जो बढ़ रहे थे 1 सप्ताह के बाद स्ट्रोक (28.5 ± 1.9%): MCAO के बाद 24 घंटे, चूहों बड़े रोधगलितांश मात्रा में (15.9 ± 2.6% चित्रा 3) था।

आकृति 1
चित्रा 1: योजनाबद्ध मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा के स्थान दिखा(MCAO) सर्जरी और मस्तिष्क परिसंचरण के बड़े पोत Vasculature। ए सर्जिकल MCAO बाहरी मन्या धमनी में और उसके बाद समीपस्थ बीच मन्या धमनी में एक रेशा की प्रविष्टि के माध्यम से हासिल की है। बीजी। MCAO उत्प्रेरण के लिए कदम। पूर्वकाल संचार धमनी (एसीए); मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए); संचार धमनी (PcomA) पीछे; मस्तिष्क धमनी (पीसीए) पीछे; आधारी धमनी (बीए); आंतरिक मन्या धमनी (आईसीए); बाहरी कैरोटिड धमनी (ईसीए); pterygopalatine धमनी (पीपीए); आंतरिक मन्या धमनी (आईसीए)। (स्मिथ एट अल। से अनुमति के साथ संशोधित, संदर्भ # 5।) यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। 18 सूत्रीय स्ट्रोक स्कोर इस comprehensive स्ट्रोक स्कोर जनरल, और संवेदी, मोटर और एक स्ट्रोक के बाद माउस व्यवहार के proprioceptive पहलुओं में कार्यात्मक सुधार का आकलन है। डेटा मतलब ± SEM हैं। * पी <0.05। एन = 3 चूहों / समूह। डेटा प्लस एनोवा का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था एक Bonferroni पोस्ट अस्थायी परीक्षण। (स्मिथ एट अल। से अनुमति के साथ संशोधित, संदर्भ # 5।) यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:।। MCAO चूहे के बाद C57BL / 6 चूहों 24 घंटा के रोधगलितांश वॉल्यूम, हटा रहे थे sectioned और 2% के साथ दाग 30 मिनट MCAO और 24 घंटा या reperfusion ए) दिमाग के 1 विकेटकीपर के अधीन थे 2,3,5- triphenyltetrazolium क्लोराइड (टीटीसी)। जीवित ऊतक में, डीहाइड्रोजनेज enzymatically 1,3,5-यात्रा के लिए टीटीसी को कमhenylformazaon (TPF), जो कि एक लाल रंग है, लेकिन इस्कीमिक ऊतकों में एंजाइम बी कार्यशील नहीं है, तो ऊतक सफेद रहता है।) ग्राफ चूहों में रोधगलितांश मात्रा में वृद्धि का एक स्ट्रोक था होने से पता चलता है। डेटा मतलब ± SEM हैं। ** पी <0.002, **** पी <0.0001 दिखावा बनाम; एन = 4 चूहों / समूह। डेटा प्लस एनोवा का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था एक Bonferroni पोस्ट अस्थायी परीक्षण। स्केल बार = 1 सेमी (स्मिथ एट अल। से अनुमति के साथ संशोधित, संदर्भ # 5।) यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। MCAO और reperfusion चूहे के दौरान एमसीए क्षेत्र के छिड़काव 30 मिनट MCAO करने के लिए <5 मिनट reperfusion अधीन थे, और। आधार रेखा 100% करने के लिए सामान्यीकृत थे। अनुभव के रूप मेंcted, reperfusion की अवधि में छिड़काव 5 मिनट MCAO, यानी की तुलना में अधिक था, जब ऊतक का कोई छिड़काव हुआ। डेटा मतलब ± SEM हैं। * पी <0.05। एन = 3 चूहों / समूह। डेटा प्लस एनोवा का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था एक Bonferroni पोस्ट अस्थायी परीक्षण। (स्मिथ एट अल। से अनुमति के साथ संशोधित, संदर्भ # 5।) यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1: न्यूरोलॉजिकल स्कोरिंग सिस्टम एक बिंदु परीक्षण से प्रत्येक के लिए एक हाँ जवाब के लिए दिया जाता है।। 18 7.8 के बाहर के निशान।

परीक्षण संक्षिप्त विवरण क्या इसके लिए परीक्षण करता है? संदर्भ
मॉरिस पानी भूलभुलैया एक खुला मैदान पानी भूलभुलैया प्रक्रिया जहां मूषक एक छिपा मंच पर पानी से बचने के लिए सीखना स्थानिक स्मृति, आंदोलन नियंत्रण, और संज्ञानात्मक मानचित्रण 19
rotarod एक क्षैतिज घूर्णन छड़ी जहां मूषक आगे चलना चाहिए ताकि के रूप में गिर करने के लिए नहीं मोटर समन्वय, संतुलन, और पकड़ शक्ति 20
पोल कृन्तकों एक पोल पर रखा गया है और फिसलने या गिरने के लिए मनाया के रूप में वे एक पिंजरे में नीचे अपने तरीके से बनाने आंदोलन cortical क्षति के कारण होता विकारों 21, 22
चाल विश्लेषण मूषक एक गिलास प्लेट क्रॉस के रूप में उनकी पंजा प्रिंट उनकी गतिविधियों की जांच के लिए कब्जा कर रहे हैं चलना पैटर्न (पंजा दबाव, छलाँग लंबाई, चौड़ाई और आवृत्ति, पैर की अंगुली प्रसार, चाल कोण, और शरीर रोटेशन)और मोटर समन्वय 23, 24
स्टिकी लेबल परीक्षण टेप की स्ट्रिप्स कृन्तकों के forepaw की गंजा भाग पर लागू समय रिकॉर्ड करने के लिए प्रत्येक पंजा, संपर्क के आदेश को हटाने का समय है, और आदेश को हटाने के संपर्क करने के लिए Forepaw संवेदनशीलता और ज्ञानेन्द्रिय घाटा 25, 26
कोना एक 30 डिग्री के कोण बनाने दोनों बोर्डों के बीच रखा कृन्तकों; जब कोने दृढ़रोम के दोनों ओर प्रेरित कर रहे हैं और कृंतक rears में गहरे प्रवेश करने और वापस जाता खुले अंत का सामना करना Neurodevelopmental विकार और दोहराव व्यवहार (निगरानी बनाम विपरीत दिशा एक ही दिशा में बदल जाता है) 27, 28
सिलेंडर कृन्तकों forelimb गतिविधि के साथ एक गिलास सिलेंडर में रखा जाता है, जबकि दीवार के खिलाफ पालन दर्ज की गई है लोकोमोटर विषमता और poststr का मूल्यांकनOke अंग उपयोग 28
सीढ़ी एक baited डबल सीढ़ी के साथ एक बॉक्स में एक मंच पर रखा कृन्तकों; मूषक भोजन सीढ़ियों से ऊपर चारा इकट्ठा करने के लिए आंदोलन को बढ़ावा देने के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं पहुँचना स्वतंत्र रूप संवेदी क्षमताओं की आवश्यकता होती है प्रत्येक forelimb के लिए योग्यता, निपुणता, और मोटर समन्वय 25, 29
सीढ़ी कृन्तकों एक क्षैतिज सीढ़ी पार चलना अपने पिंजरे तक पहुंचने के लिए; पैर से निकल जाता है, जबकि सीढ़ी पार चलने दर्ज की गई हैं हरकत के दौरान पैर दोष; forelimb और hindlimb समारोह और समन्वय 30

तालिका 2: Murine व्यवहार परीक्षण के उदाहरण हैं।

जीएलपी के लिए सुझाव इस प्रकार है:
- विशिष्ट जिसका विवरण स्ट्रोक का मॉडल चुना गया है (जैसे, Longa बनाम कोइज़ुमी), और तनाव, आयु, लिंग, वजन स्पष्ट रूप से सूचना दी।
- एक डबल अंधा फैशन में प्रदर्शन अध्ययन।
- पावर विश्लेषण की सूचना दी।
- शामिल किए जाने और अध्ययन में बहिष्कार के लिए मानदंड अध्ययन करने से पहले फैसला किया है, और सूचना दी।
- पशु संकट, दर्द या बीमारी के कोई लक्षण के लिए दैनिक (मूल रूप, शरीर के वजन और व्यवहार) पर नजर रखी।
- अध्ययन से बाहर रखा जानवरों की रिपोर्टिंग।
- समूहों में पशुओं के Randomization।
- & #160; नकारात्मक और सकारात्मक परिणामों की रिपोर्टिंग।
- सर्जरी, एनेस्थेटिक, शरीर का तापमान और रक्त गैसों की लंबाई की रिपोर्टिंग।
- पर्यावरण का इस्तेमाल किया, यदि कोई हो संवर्धन की रिपोर्टिंग।

तालिका 3: अच्छी प्रयोगशाला अभ्यास के लिए सुझाव।

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Discussion

20 साल पहले अपनी अवधारणा के बाद से, मानव एक रेशा की प्रविष्टि को शामिल स्ट्रोक के लिए MCAO मॉडल के अध्ययन की एक बड़ी संख्या में इस्तेमाल किया गया है। इस तथ्य यह है कि mimics क्या स्ट्रोक (यानी, इस्कीमिक स्ट्रोक) का सबसे सामान्य रूप में चिकित्सकीय होता है की वजह से है। स्ट्रिएटम सेरेब्रल कॉर्टेक्स से ischemia के लिए अधिक संवेदनशील है, और जैसे, इस्कीमिक समय की लंबाई में दोनों स्ट्रिएटम और dorsolateral कोर्टेक्स प्रभावित हो जाएगा कि क्या है, या बस स्ट्रिएटम अनुवाद करेंगे। दोनों रोधगलितांश और reperfusion बार तदनुसार अलग किया जा सकता है, और इस शोधकर्ता बहुत बड़ा दौरे के लिए क्षणिक ischemic हमले (TIAs) के साथ जुड़े रोग प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सक्षम होना करने की क्षमता प्रदान करता है।

इन वर्षों में संशोधनों और MCAO का रेशा विधि की समस्या निवारण को दिखाया गया है प्रक्रिया के महत्व को बाँझ परिस्थितियों में प्रदर्शन किया जा रहा संक्रमण 9 के जोखिम से बचने के लिए। परिणाम भिन्न हो सकते हैंकृंतक प्रजातियों के बीच, तनाव (संरचनात्मक बदलाव के लिए दिखाया गया है) 10,11, वजन, और anesthetics इस्तेमाल किया, लेकिन यहाँ प्रस्तुत परिणामों में प्रवृत्तियों अन्य प्रयोगशालाओं जहां MCAO किया जाता है में परिलक्षित होने की संभावना है। खाते में लेने के लिए अन्य महत्वपूर्ण कदम शरीर का तापमान, रक्तचाप और रक्त गैसों हैं। यह अच्छी तरह से स्थापित है कि शरीर के तापमान को न्यूरोलॉजिकल नुकसान को प्रभावित करता है, छोटे हाइपोथर्मिया 12 और अधिक गंभीर घाटे के साथ जुड़े घावों के साथ अतिताप 13 में प्रस्तुत किया जा रहा है। जैसे, तापमान मापा जाना चाहिए और नियंत्रित है, उदाहरण के लिए, एक गर्मी पैड के साथ पशु तापमान नियंत्रकों के उपयोग के माध्यम से, इतनी के रूप में 36.5 डिग्री सेल्सियस पर शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए। खंड पुनःपूर्ति और पिंजरे के तल पर नरम चाउ रखकर खाने का प्रोत्साहन भी अतिरिक्त कारकों निरीक्षण करने के लिए कर रहे हैं। रक्तचाप और रक्त गैसों 6,14 दोनों आसानी से मापा जा सकता है और commerc से आसानी से उपलब्ध उपकरणों का उपयोग कर नजर रखीial आपूर्तिकर्ताओं।

MCAO तकनीक की सीमाओं को ठीक से क्षति के बिना धमनियों से वेगस तंत्रिका विदारक और पीपीए है, जो न केवल प्रभावी ढंग से स्ट्रोक के लिए प्रेरित करने की क्षमता है, लेकिन यह भी माउस के जीवित रहने की दर को प्रभावित कर सकते में रेशा को आगे बढ़ाने से परहेज शामिल हैं। विवो MCAO तरीकों में विकल्प के संबंध में सबसे महत्वपूर्ण महत्व जीवित रहने की दर जब Longa विधि यहाँ वर्णित का उपयोग कर रहा है। हम यह भी पाया है कि इस वृद्धि ल्युकोसैट endothelial सेल बातचीत और बढ़ रोधगलितांश मात्रा में है, जो इस मॉडल, एक बार में महारत हासिल है, स्ट्रोक के उपचार के लिए संभावित चिकित्सात्मक लक्ष्य के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण बनाने के लिए मेल खाती है।

हालांकि हम किसी भी यहां की सूचना नहीं है, व्यवहार परीक्षणों के एक नंबर भी इस तरह के मॉरिस पानी भूलभुलैया, rotarod, पोल परीक्षण, चाल विश्लेषण, चिपचिपा लेबल परीक्षण, कोने परीक्षण, सिलेंडर परीक्षण, सीढ़ी परीक्षण, और सीढ़ी परीक्षण के रूप में किया जा सकता है (तालिका देखेंविवरण और संदर्भ) के लिए 2। शाम जानवरों इन व्यवहार परीक्षण पूरा करने के साथ कोई समस्या नहीं है; हालांकि, स्ट्रोक जानवरों इन परीक्षणों में काफी कम सफलतापूर्वक प्रदर्शन करते हैं। इस के बाद से, बहस का एक ऐसा क्षेत्र है पर्यावरण संवर्धन न केवल MCAO मॉडल के reproducibility को प्रभावित करता है, लेकिन यह भी व्यवहार परीक्षण 15 के परिणाम को प्रभावित करेगा कि क्या है। यह स्पष्ट नहीं है, लेकिन यह प्रयोगशाला के भीतर इस मानकीकरण के लायक है, और अध्ययन के दौरान।

अलग स्ट्रोक परिणाम को मापने के लिए उपलब्ध परीक्षणों के ढेर सारे हैं। हम रक्त के प्रवाह माप, एक में गहराई 18 सूत्रीय मस्तिष्क संबंधी आकलन के स्कोर के लिए लेजर डॉपलर के रोजगार प्रस्तुत किया है, और यह भी मात्रा माप रोधगलितांश। हालांकि, अतिरिक्त विकल्प भी उपयोगी है, ऐसे इमेजिंग के रूप में कर रहे हैं। हम नियमित रूप से intravital प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग सेलुलर बातचीत का अध्ययन करने के लिए (एक भड़काऊ प्रतिक्रिया की विशेषता) 6 सेरे के भीतर रोजगारवास्तविक समय में bral microcirculation, anesthetized जानवरों 5,6,16 में। MCAO और reperfusion नकली पशुओं 5,6,16 बनाम एक बढ़ मस्तिष्क भड़काऊ प्रतिक्रिया पैदा करता है। ऐसे चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग 17 और पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी 18 के रूप में अन्य इमेजिंग तौर तरीकों का भी इस्तेमाल किया जा सकता क्योंकि वे अनुदैर्ध्य अध्ययन है कि चिकित्सकीय प्रासंगिक हैं के लिए अवसर प्रदान करते हैं।

मस्तिष्क के ऊतकों के histological विश्लेषण, प्लाज्मा और सीरम नमूनों नियमित प्रदर्शन किया जाना चाहिए के रूप में वे स्ट्रोक के लिए pathophysiological प्रतिक्रियाओं के आगे लक्षण वर्णन की अनुमति है और तंत्र शामिल है, लेकिन यह भी, और शायद अधिक महत्वपूर्ण बात, वे शोधकर्ताओं परिणाम पर यौगिकों के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति स्ट्रोक का, इस प्रकार इस दुर्बल और घातक बीमारी के लिए संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों के लिए महत्वपूर्ण डेटा प्रदान करते हैं। अंत में, हमें विश्वास है कि यह बहुत ही उचित है शोधकर्ताओं ने न केवल सबसे उपयुक्त स्ट्रोक मॉडल बीए पर विचार करने के लिएउनके अध्ययन के लिए आवश्यकताओं पर sed, लेकिन यह भी कि जीएलपी ( "अच्छी प्रयोगशाला अभ्यास") को अनिवार्य कर दिया है। जीएलपी सुझाव के लिए 3 टेबल देखें।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Male C57BL/6 mice Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME #000664
Ketamine Hydrochloride Morris & Dickson, Shreveport, LA 67457-108-10
Xylazine Akorn, Inc, Lake Forest, IL NADA# 139-236
DC temperature control system FHC, Bowdoin, ME 40-90-8D
Mini rectal thermistor probe FHC, Bowdoin, ME 40-80-5D-02
Heating pad FHC, Bowdoin, ME 40-90-2-06
Clippers Amazon, Bellevue, WA #64800
70% ethanol Worldwide Medical Products, Bristol, PA #51011023
Dissecting microscope Olympus, Center Valley, PA SZ40
Iris scissors (straight) Fine Science Tools, Foster City, CA 11251-20
Dumont forceps (45° bent tip) Fine Science Tools, Foster City, CA 11297-00
Micro vessel clip Fine Science Tools, Foster City, CA 18055-05
Micro dissecting spring scissors (straight) Fine Science Tools, Foster City, CA 14088-10
Retractors (blunt) Fine Science Tools, Foster City, CA 18200-11 (Helen used 17022-13)
Cotton tipped applicators Fisher Scientific, Waltham, MA 23-400-100
Gauze sponges Covidien, Mansfield, MA #9023
7-0 silk braided surgical suture Braintree Scientific, Braintree, MA SUT-S103
0.9% sodium chloride Morris & Dickson, Lake Forest, IL 0409-4888-20
6-0 medium MCAO suture (silicon rubber coated monofilament) Doccol Corporation, Sharon, MA 6023PKRe
Sofsilk 6-0 silicone coated braided silk Covidien, Mansfield, MA SUT-14-1
Carprofen Pfizer, New York, NY NADA# 141-199
Puralube Dechra, Norwich, UK NDC 17033-211-38
Physitemp temperature controller Harvard Apparatus, Holliston, MA TCAT-2AC
Heat lamp Harvard Apparatus, Holliston, MA HL-1
Laser doppler probe AD Instruments, Colorado Springs, CO MSP100XP
24-well plates Fisher Scientific, Waltham, MA #353226
Phosphate buffered saline (PBS) Life Technologies, Carlsbad, CA 20012-050
Single edge razor blades Fisher Scientific, Waltham, MA 12-640
2,3,5-triphenyltetrazalium chloride (TTC) Sigma Aldrich, St. Louis, MO T8877-50G
Mouse brain matrix slicer Braintree Scientific, Braintree, MA BS-A 5000C
Water bath VWR, Radnor, PA #182
10% formalin Sigma Aldrich, St. Louis, MO HT501128-4L
ImageJ analysis software NIH, Bethesda, MD free download
Retractor Medical Device Purchase, Newcastle, CA MP-740

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References

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चिकित्सा अंक 116 स्ट्रोक माउस क्षणिक ischemia reperfusion मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा intraluminal रेशा intraluminal सीवन
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Vital, S. A., Gavins, F. N. E.… More

Vital, S. A., Gavins, F. N. E. Surgical Approach for Middle Cerebral Artery Occlusion and Reperfusion Induced Stroke in Mice. J. Vis. Exp. (116), e54302, doi:10.3791/54302 (2016).

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