인간 다 능성 줄기 세포의 서스펜션 기반의 심장 차별화를위한 마이크로 웰의 집계 크기 최적화

Summary

기존의 방법은 인간 만능의 서스펜션 집계를 기반으로 심장 분화 세포 (hPSCs) 골재의 크기와 모양에 대한 문화의 이질성으로 고생하는 줄기 시작합니다. 여기, 우리는 크기 조절 hPSC가 심장 촉진 조건에서 배양 집계 생성하는 마이크로 웰을 사용하는 심장 차별화를 위해 강력한 방법을 설명합니다.

Abstract

인간 만능 줄기 세포(hPSC)의 심장 분화는 일반적으로 현탁 세포 응집체에서 수행됩니다. hPSC의 기존 응집체 형성은 세포 군체를 더 작은 덩어리로 해리하는 것을 포함하며, 원하는 덩어리 크기에 도달할 때까지 세포 현탁액을 피펫팅하여 덩어리의 크기를 조잡하게 제어합니다. 기존의 hPSC의 응집체 기반 심장 분화의 주요 과제 중 하나는 배양 이질성과 공간적 무질서로 인해 가변적이고 비효율적인 심근세포 수율이 발생한다는 것입니다. 당사와 다른 연구자들은 이전에 인간 배아 줄기 세포(hESC) 응집체 크기를 조절하여 심장 유도 효율을 최적화할 수 있다고 보고한 바 있습니다. 우리는 확장 가능한 마이크로웰 기반 접근 방식을 사용하여 응집체 형성의 물리적 매개변수, 특히 응집체 크기 및 모양을 제어함으로써 이 문제를 해결했습니다. 여기에서 설명하는 방법은 마이크로웰에서 정의된 hPSC 수치를 강제 응집하고 심장 유도를 지시하는 조건에서 이러한 응집체를 후속 배양하는 것으로 구성됩니다. 이 프로토콜은 사용되는 웰의 크기와 수에 따라 쉽게 확장할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 심근세포 빈도가 70% 이상인 배양 결과를 일관되게 달성할 수 있습니다.

Introduction

시험 관내 세포 배양에서 양식의 개수에 따라 수행 될 수 있지만, 일반적으로 이차원 부착 상태 이상을 완전히 생체 시스템에서 요점을 되풀이 입체 정지 조건 중 수행된다. 따라서 입체적인 조직 구조를 생성하기위한 강력한 방법을 개발하는 연구가 다양한 분야에서 증가 경향이있다. 세포 유형 및 프로세스가지지 세포 외 기질 (ECM)의 표면과의 밀착성 신호를 요구 시나리오에서는 삼차원 배양 세포 또는 매트릭스 ^1지지 외래에서 배양 스캐 폴딩 구조를 통해 활성화 될 수있다. 지지가 매트릭스의 접착을 필요로하지 않는 세포와 공정은 주로 또는 독점적 ^2,3- (다음 자신의 내인성 행렬을 생성하기 위해 진행할 수있다) 세포로 구성 unscaffolded 시스템으로 현탁액을 행할 수있다. 여기, 우리는 심장 차별화 O를위한 프로토콜을 제시F 인간 다 능성 줄기 세포 - 크기 조절, 유니폼, unscaffolded 집계에서 (hPSCs는 배아 또는 기타 소스에서 몸의 모든 세포 유형이 될 수있는 세포 여부를 줄기).

서스펜션 집계로 hPSCs의 차별화가 실행 내부와 실행 사이에 모두 집합 크기가 큰 변화에 의해 괴롭혀된다. 이 변화는 세포 콜로니의 기계적 분리를 포함 일반적으로 이러한 응집체를 생성하기 위해 사용 된 방법의 결과이다. 이 변동을 저감하기 위해 접근 방법이 당 총 셀의 개수뿐만 아니라 골재 직경의 균일 성을 제어하기 위해 사용되어왔다. ^실시 예는 마이크로 원심 튜브 ⁴ 응집체의 형성을 포함하거나 걸려 ⁵ 삭제 같이 미세화하거나 세포의 원심 U- 또는 V 바닥 멀티 웰 플레이트 ^(7,8)으로 한 후 현탁액에 전송할 수 이차원 hPSC 콜로니 ⁶ 규정 ^9. 그러나, 이러한 모든 approaches 집계 세대의 낮은 처리량에 의해 제한됩니다. 음 기반 시스템은 V-저판 시스템과 유사한 방식의 마이크로 웰의 그러나 더 작은 크기를 채용 아니라 단일 배양 접시에서 균일 응집체 더 많은 수의 생성을 가능하게 (이 프로토콜에서 각각 400 ㎛의 폭을 갖는) 전체 V-바닥 판 ^(10)에서 생성되는 것보다 (포함 15.5 mm ~ 1,200 마이크로 웰 ~의 표준 직경). 음 계 응집체 형성이 ¹¹ 내배엽 ¹² 중배엽 ¹³ 배외 (extraembryonic) ¹⁴ 운명 외배엽하는 hPSCs의 분화를 비롯한 여러 설정에 사용되었다; 중간 엽 줄기 세포 ^(15)에서 연골; 독성 학적 검사 ^(16)에 대한 균일 한 기판의 생성; 및 제어 공학 ^(17)의 조사.

hPSC 유래 cardiom의 생산을위한 견고한 제조 프로토콜을 개발 한 주요 과제yocytes은 실행 사이의 심장 분화 효율 재현성의 부족이었다. 우리는 이전에이 변화는 내배엽 및 신경 분화 ^6,18과 관련된 유전자를 발현 모두 자기 갱신 hPSCs 및 분화 세포를 포함하는 시작 hPSC 인구의 이질성에 기인 할 수 있다는 것을 보여 주었다. 이러한 분화 세포에 의해 분비 신호는 심장 유도에 영향을 미친다. 신경 전구 세포가 심장 유도를 억제하면서 특히, 배외 (extraembryonic) 내배엽은 심장 유도를 촉진한다. hPSC 집계하면, 총 차별화 내의 세포와는 그래서 미분화 hPSCs은 골재 표면 ^(13)에 개발 배외 (extraembryonic) 내배엽 세포의 층으로 둘러싸여있다 정리할 수 있습니다. 응집체의 크기를 조절함으로써, 우리는 미분화 hPSCs (부피비 표면적)을 심장 유도 내배엽 세포의 비율을 조절하고, 최대 심장 유도 ^(13)이 비를 최적화 할 수있다.

Protocol

중간 구성 요소 1. 준비

1. 워시 매체를 준비합니다. DMEM / F12 100 ㎖ 당 1 100X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PEN / 패 혈성)의 ㎖, 100X L- 글루타민 1 ㎖ 혈청 대체 5 mL를 추가한다.
2. 제조업체의 지침에 따라 화학적으로 기저 심장 유도 매체를 준비합니다.
3. 이 프로토콜에서 사용되는 미디어 다음 재고 시약을 준비합니다.
   1. L- 아스코르브 산가 : 원뿔 튜브에 4 ° C, 멸균 울트라 순수한 증류수 ㎖의 당 5 밀리그램의 재고 솔루션을 준비합니다.
      1. 얼음에이 솔루션을두고 용질이 완전히 용해 될 때까지 주기적으로 튜브를 소용돌이. 필터 멸균 0.22 ㎛의 주사기 필터를 사용하여 아스코르브 산 용액.
      2. 아스코르브 산 용액 1 ml의 분취 량을 준비하고 -20 ℃에서 분취 액이 저장한다. 때마다 매체를 준비 갓 해동 나누어지는을 사용합니다.
   2. 매체 제조 당일기저 심장 유도 보통 1 ㎖에 monothioglycerol (MTG) 13 μL 희석. 사용하지 않는, 희석 MTG 폐기하십시오.
   3. -20 ℃에서 저장 트랜스페린 (30 ㎎ / ㎖) 1 ml의 분취 량을 준비한다. 스토어는 최대 3 개월 동안 4 ° C에서 분취 량을 해동.
   4. 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 4 mM의 염산 (HCL)을 준비한다. 흄 후드에서, 초순수, 증류수 50 ml의 6.0 N HCl 용액 30 μL를 추가한다. 필터 멸균 0.22 ㎛의 주사기 필터를 사용하여 용액. 50 ml의 HCl 용액에 25 % BSA 용액 2 ㎖를 추가합니다.
   5. 0.1 % BSA를 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비한다. ml의 PBS 당 25 % BSA 용액 20 μl를 추가합니다.
   6. 인간의 뼈 형태 형성 단백질 4 (BMP-4) 원액 (10 NG / μL)를 준비합니다. 0.1 % BSA를 함유하는 4 mM의 염산 완충액 1 ㎖에서 BMP-4 10 μg의 동결을 녹인다. -20 ° C에서 저장하는 50 μl의 분취 량을 준비합니다.
   7. 인간 섬유 아세포 성장 인자 2 (bFGF를) 원액을 준비(10 NG / μL). 0.1 % BSA를 함유하는 인산염 완충 식염수 1 ㎖ (PBS) 10 μg의 동결 건조의 bFGF를 녹인다. -20 ° C에서 저장하는 50 μl의 분취 량을 준비합니다.
   8. 인간의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 원액 (5 NG / μL)를 준비합니다. 0.1 % BSA를 함유하는 PBS 1 ㎖에 5 μg의 동결 건조 된 VEGF를 녹인다. -20 ° C에서 저장하는 50 μl의 분취 량을 준비합니다.
   9. 티빈에게 원액 (10 NG / μL)를 준비합니다. 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 PBS 1 ㎖에 티빈 동결 10 μg의 용해. -20 ° C에서 저장하는 50 μl의 분취 량을 준비합니다.
   10. 이 Wnt 생산-2 (IWP-2) 원액 (10 밀리미터)의 억제제를 준비합니다. 429 ㎕의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 2 mg을 IWP-2를 녹여. -80 ° C에서 저장하는 10 μl의 분취 량을 준비합니다.
4. 전체 심장 유도 매체를 준비합니다. 기저 심장 유도 보통 100 ㎖, 1 ~ 100X 펜 / ml의 스트렙토, 100X L- 글루타민 1 ㎖, 트랜스페린의 500 μL, 추가 1신선하게 해동 아스코르브 산 용액 및 MTG 300 μL. 사용되지 않는 매체를 폐기하십시오.

마이크로 웰 플레이트 2. 준비

참고 : 모든 단계가 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다.

1. 접시에 사용되는 각 웰에 0.5 ml의 세척 용액 (키트의 구성 요소)를 추가합니다. 용액 연락처 각 마이크로 웰의 내부 표면 전체를 2 분 동안 840 XG에 플레이트를 원심 분리되도록한다.
2. 실온에서 30 ~ 60 분 동안 접시를 품어.
3. 우물에서 세척 용액을 대기음. 다음과 같이 각 웰에 두 번 씻으 : 각 웰에 PBS 1 ml의 추가, 원심 분리기 판을 2 분 동안 840 XG에 다음 PBS를 대기음.

hPSC 3. 형성은 마이크로 웰 플레이트에서 집계합니다

참고 : 모든 단계가 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다.

1. 37 ° C의 물을 욕조에 세척 매체를 놓습니다.
   참고 : 볼륨은 HP의 우물 = 1 ML의 X 번호를 요구해리 될 것이다 SC.
2. 하나의 세포에 hPSCs을 떼어 놓다
   참고 :이 단계는 6 웰 플레이트에서 배양 세포의 분리를 설명 - 시약의 볼륨은 서로 다른 문화 형식에 대해 비례 적으로 확장 할 수 있습니다.
   1. 각 hPSC 문화에서 잘 해리의 문화 매체를 기음. 분해 효소 1 ㎖로 각 웰을 헹군 후 즉시 각 웰의 분해 효소 대기음.
      주 : 잔류 분해 효소는 세포를 해리하기에 충분해야한다.
   2. 3 분 37 ° C에서 접시를 품어.
   3. 각 웰에 세척 보통 1 ㎖를 첨가하고 기계적 조직 배양 표면 위에 P1000의 micropipettor로 세척 중간 피펫 팅하여 조직 배양 표면에서 세포를 해리. 해리가 완료되지 않은 세포 덩어리가 남아있는 것으로 나타나는 경우,이 시점에서 스트레이너를 통해 정지를 전달합니다.
   4. 15 ML 원뿔 관 및 저장에 세포 현탁액을 전송인큐베이터에서 튜브는 셀 수는 다음 단계에서 수행된다.
   5. 셀 카운트를 수행합니다
      1. 이전 단계에서 수집 된 세포 현탁액 10 μL 샘플을보십시오. 트리 판 블루의 30 μl를 추가하고 피펫으로 잘 현탁액을 섞는다.
      2. 혈구의 각 실에 트리 판 블루 염색 된 세포의 10 μl를 전송하고 10 배 목적으로 반전 현미경으로 시각화. 세포를 계산합니다.
   6. 셀 카운트 결과로부터, 마이크로 웰 플레이트의 웰 당 1.2 × ¹⁰⁶ 세포로 시딩 수 잇는 웰 구한다. 계산 집계 매체는 물론 당 1 ml의에서 세포를 배정해야합니다.
   7. 집계 매체를 준비합니다. 전체 심장 유도 보통 10 ㎖, 당 BMP4 원액 0.5 μL (최종 농도 = 0.5 NG / ㎖) 및 Y-27632 ROCK 억제제 (최종 농도 = 10 μM)를 추가합니다.
   8. 인큐베이터와 centrifu에서 hPSCs를 포함하는 원뿔 튜브를 제거GE의 5 분 200 XG에 튜브. 세척 매질 대기음 용액 당 1.2 × ¹⁰⁶ 세포의 밀도로 응집 매질에서 세포를 재현 탁.
   9. 마이크로 웰 플레이트의 각 웰에서 PBS 세척 용액을 대기음. 균등하게 분배하고 잘 마이크로 웰 플레이트에 각 세포 현탁액의 씨앗 1 ml를하는 P1000의 micropipettor를 사용하여. 웰 다수 시드 주기적 침강 방지 세포 현탁액을 소용돌이.
   10. 5 분 동안 200 XG에서 접시를 원심 분리기. 세포는 각각의 마이크로 웰의 바닥에 방사 한 확인하기 위해 현미경으로 접시를 관찰한다.
   11. 5 % CO _2, 5 % O ₂ (저산소증) 인큐베이터에서 37 ℃에서 24 시간 동안 플레이트를 인큐베이션.

4. 심장 유도 1 단계

1. 집계 다음의 어느 날 (1 일), (우물, 볼륨 = 1 ML의 X 번호 24 웰 플레이트 용) 1 단계 유도 매체의 필요한 볼륨을 준비합니다. 전체 1 ㎖를 들어심장 유도 매체, BMP4 스톡 용액 (최종 농도 = 10 NG / ㎖) 1 μL, bFGF의 스톡 용액 (최종 농도 = 5 NG / ㎖) 0.5 μL와 티빈 (A)의 0.6 μl를 추가 (최종 농도 = 6 NG / ㎖). 적어도 15 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 매체를 넣습니다.
2. 인큐베이터에서 마이크로 웰 플레이트를 제거합니다. 현미경 집계를 검사합니다. 즉시 후 원심 분리기 집계에 비해, 그들은 부드러운 가장자리 (더 라운드 전날보다 작은 광장)에 그대로 나타납니다.
3. 마이크로 웰 내부의 집계를 방해하지 않고 뜨는을 제거 :
   1. 수평 레벨을 마이크로 웰 플레이트를 잡고 (예.,을 기울이지 않는다). 각 웰 마이크로 웰 플레이트에 대해, 배지의 표면에 상기 웰의 가장자리에 대해 P1000의 micropipettor의 선단을 배치.
   2. 천천히 마이크로 웰의 하단에있는 집계를 방해하지 않도록주의, 배지를 제거합니다. t을 감소 후텍스쳐 마이크로 웰의 표면으로부터 약 1 내지 2 mm로 그 중간 레벨 서서히 볼륨이 충분히 낮아지면 유체 운동이 크게 감소 웰 (일측에 매체를 수집 플레이트를 기울여 드러내 점점 응집을 방지하기 쉽다는 ) 개별 마이크로 웰의 아웃. 천천히 잘 남아있는 매체를 피펫.
4. 집계는 개별 마이크로 웰에 남아 확보하면서 신선한 1 단계 유도 매체를 추가하려면 다음과 P1000의 micropipettor와 함께 1 단계 유도 배지 1 ㎖을 그립니다. 우물의 안쪽 가장자리에 피펫 팁을 잡고 아주 천천히 잘의 내부 벽에 매체를 분배. 나머지 우물에 대해 반복합니다.
5. 3 일 저산소 조건에서 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다.

5. 심장 유도 2 단계

1. 하루에 4 일, 장소는 15 분의 최소 37 ° C의 물을 욕조에 (우물의 부피 = 수 × 2 ㎖) 매체를 씻는다.
2. (최종 농도 = 10 NG / ㎖) VEGF 원액의 2 μl를 추가, 전체 심장 유도 중간 ml의 당 0.5 ㎕를 IWP-2 : 2 단계 유도 중간 (우물 × 1 ml의 부피 = 수)의 필요한 양을 준비 주식 솔루션 (최종 농도 = 5 μM). 15 분의 최소 37 ° C를 물을 욕조에 준비된 2 단계 유도 매체를 넣습니다.
3. 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여 마이크로 웰 플레이트의 각 웰에서 집계를 수확하고 원뿔 튜브 (15 ML 튜브 당 10 우물까지 수집) 15 용액에 집계 정지를 수집합니다.
4. 집계가 저산소 배양기에서 15 분 동안 정착하도록 허용합니다.
   참고 :이 단계는 그대로 집계에서 단일 세포와 세포 파편을 분리하는 것이 중요합니다.
5. 잔류 유도 사이토 카인을 제거하기 위해 미리 예열 워시 보통 10 ㎖의 집계를 조심스럽게 뜨는을 기음과 재현 탁 (예를 들면, 티빈 A는 심지어 매우 낮은 공에 강력한 신호 분자이다ncentrations).
6. 2 분 50 XG에서 집계를 원심 분리기. 뜨는을 대기음. 예비 가온이 유도 매체에 펠렛을 재현 탁 집합체.
7. 물론 당 1 ml의에서 24도 초저 첨부 파일 (ULA) 판에 집계 정지를 전송합니다. 유니폼, 꽉 세포 클러스터와 현미경으로 집계을 준수하십시오. 6 일까지 저산소 조건에서 품어.

6. 심장 유도 3 단계

1. 하루 6 일, 3 단계 유도 중간 (우물 × 1 ml의 부피 = 수) 필요한 볼륨을 준비합니다. 전체 심장 유도 중간 1ml를 들어, 2 μL VEGF 스톡 용액 (최종 농도 = 10 NG / ㎖), 및 bFGF의 스톡 용액 (최종 농도 = 5 NG / ㎖) 0.5 μl를 추가한다. 15 분의 최소 37 ° C를 물을 욕조에 준비 3 단계 유도 매체를 넣습니다.
2. 총 10 ㎖까지 풀링, 15 ml의 원뿔 튜브 응집체를 전송하는 데 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여튜브 당들.
3. 집계가 정착하는 10 분을 허용합니다. 뜨는을 기음과 미리 예열 3 단계 유도 중간에 집계를 재현 탁. 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여, 잘 당 1 ml의에서 24 웰 ULA 판으로 집계 재배포.
4. 10 일에, 3 단계 유도 중간 단계 6.1에 따라 (우물 × 1 ml의 부피 = 수) 필요한 볼륨을 준비합니다.
5. 튜브 당 집계 10 ㎖까지 풀링, 15 ML 원뿔 튜브 응집체를 전송하는 데 5 ml의에게 혈청 학적 피펫을 사용합니다.
6. 집계가 정착하는 10 분을 허용합니다. 뜨는을 기음과 3 단계 유도 중간에 집계를 재현 탁. 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여, 잘 당 1 ml의에서 24 웰 ULA 판으로 집계 재배포.
7. 이틀 동안 저산소증 조건 하에서 인큐베이션. 일 12 일 배양 기간의 나머지 (37 ° C, 20 % O _2, 5 % CO _2)에 대한 정상 산소의 산소 농도에서 세포를 배양하기.
   노트:이 시점 후에, 세포가 더 이상 저산소증 조건 하에서 배양 없다.
8. 이 완전 배지 교환을 반복 세포 수확까지 14 일부터 4 일마다 (6.2 및 6.3 단계) (일반적으로, 피크 심근 농도는 차별화의 14 일 후 관찰된다).

심장 트로포 닌 T (cTnT를) 마이크로 웰 문화 출력의 발현 빈도 7. 유동 세포 계측법 분석

1. 다음과 같이 집계를 떼어 놓다 :
   1. 15 ML 원뿔 튜브에 집계 1도를 전송하는 데 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용합니다. 2 분 50 XG에서 집계을 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 대기음.
   2. 집계에 갓 용해 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 유형 II 솔루션 1 ML을 추가합니다. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 집계 정지를 전송합니다. 실온에서 하룻밤 동안 콜라게나 제 II 형의 응집체 부화.
   3. 다음 날, 부드럽게 집계를 떼어 놓다하기 위해 P1000의 micropipettor를 사용균질 한 단일 세포 현탁액. 집계가 쉽게 해리하지 않는 경우, 집계를 정착 뜨는을 대기음하고, 실온에서 1 ~ 2 분 동안 해리 효소의 700 μL의 집계를 품어. 조심스럽게 해리 할 수있는 P1000의 micropipettor으로 집계 1 ~ 2 번 피펫.
   4. 해리 효소를 희석 : 1 ㎎ / ㎖ DNase의 원액 14 μl를 포함하는 세척 매체의 700 μl를 추가합니다. 2 분 동안 300 XG에 벤치 탑의 microcentrifuge를 사용하여 나머지 정지를 셀 수를 수행하고, 원심 분리하기 위해 10 μL 샘플을 가져 가라.
2. 세포 계수를 수행하여 트리 판 블루 동량 10 μL 계산 샘플 얼룩과 혈구를 사용하여 계산.
3. 의 microcentrifuge에서 남아있는 세포를 포함하는 1.5 ml의 microcentrifuge 관을 제거합니다. 뜨는을 기음과 포함 행크스 균형 소금 용액에 100 μL 당 200,000 500,000 세포의 농도로, 세포를 재현 탁2 % 태아 소 혈청 (HF).
4. 각 조건을 위해, 세포 현탁액 100 ㎕ 당 웰을 96- 웰 플레이트 (하나의 웰은 cTnT의 항체로 염색되며, 다른 하나는 이차 항체 제어 것) 2 웰 옮긴다.
5. 2 분 동안 300 XG에 접시를 원심 분리기. 멀티 채널 micropipettor와 뜨는을 제거합니다.
6. 세포를 수정 : 잘 당 고정 솔루션 (키트의 구성 요소)의 200 μl를 추가하고 실온에서 15 분 동안 접시를 품어.
7. 2 분 동안 300 XG에 접시를 원심 분리기. 조심스럽게 우물에서 뜨는을 철회 멀티 채널 micropipettor를 사용합니다. 파라 포름 알데히드 폐기물 용기에 뜨는을 폐기하십시오.
8. 두 번 고정 된 세포를 씻으 : 각 웰에 HF 200 μl를 추가합니다. 2 분 동안 300 XG에 접시를 원심 분리기. 뜨는을 대기음, 한 번 더 세척 단계를 반복합니다. 고정 된 세포는 4 ° C에서 HF 최대 일주일 동안 저장 될 수있다.
9. 세포 Permeabilize 하시려면 :
   1. (300)에서 접시를 원심 분리기2 분 XG.
   2. 각 웰에 Permeabilization 용액 (키트 성분) 100 ㎕를 추가하고 실온에서 5 분 동안 평판을 배양한다.
   3. 2 분 300 XG에 접시를 원심 분리기와 뜨는을 대기음.
10. 주어진 로트 번호에 대한 최적의 농도로 HF에 방지 cTnT의의 마스터 믹스를 준비합니다 (최적의 희석은 적정에 의해 결정되며 일반적으로 1 범위해야합니다 : 500 1 : 2,000).
11. 각 조건 (조건 당 2 웰)의 경우, 하나의 잘 (스테인드 샘플)과 다른 잘 (이차 항체 제어)에 일반 HF 100 ㎕에 마스터 믹스 100 μl를 추가합니다. 30 분 동안 4 ° C에서 세포를 품어.
12. 2 분 동안 300 XG에 세포를 원심 분리기. 뜨는을 대기음 잘 당 HF 200 μl를 추가합니다. 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다.
13. 이차 항체의 마스터 믹스를 준비합니다. 마다 잘 100 μL에 해당하는 HF의 볼륨 (이차 항체 제어를 전송하고cTnT를 염색)의 치료를 받고. (: 200 희석 1) HF 200 μL 당 염소 항 - 마우스 - APC 차 항체의 1 μl를 추가합니다.
14. 샘플을 얼룩. 각 웰 (이차 항체 제어 및 안티 cTnT를 묻은 우물 둘 다) 염색 용액 100 μl를 추가합니다. 30 분 동안 4 ° C (photobleaching에 방지하기 위해 형광 차 항체를 추가 한 후 커버 플레이트 또는 어둠 속에서 유지)에 어둠 속에서 세포를 품어.
15. 2 분 동안 300 XG에 세포를 원심 분리기. 뜨는을 대기음 잘 당 HF 200 μl를 추가합니다. 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다.
16. 분석 튜브 사이토 5 ㎖ 둥근 바닥 흐름 샘플을 전송 한 기기 ^(19)의 표준 프로토콜을 사용하여 APC 채널에서 신호에 대한 유세포 분석기를 수행한다.

Results

hPSCs 크기 조절 응집체 효과적으로 단 전지의 농도 및 마이크로 웰 표면적에 의존 마이크로 웰 시스템을 사용하여 형성 될 수있다. 짧은 원심 분리 후, 세포의 적절한 숫자 (이 프로토콜 1000)는 각각 마이크로 웰 (그림 1A)에 함께하게된다. 중요한 것은,이 세포는 24 시간 이내에 세포 내 연결을 다시 설정하고 더 이상 잘 채우기 없지만, 부드러운 가장자리 (그림 1B)와 소형 집계로 나타납니다. 이 집계는 심장 운명을 향해 더 차별화를위한 출발 물질을 제공합니다. 세포가 꽉 클러스터를 형성하지 않으면,이 가능한 세포 분리 및 재 응집 다음 죽음과 검사해야 특정 세포주 단일 세포 및 계대 ROCK 억제제 농도의 적합성을 시사한다. 마이크로 웰의 다음과 같은 세 가지 일 집계 모토에 약간의 변화를 보여말의 뜻은 약간의 성장은 분명하다,하지만. 마이크로 웰에서 제거 할 때, 단위는 라운드, 단단히 포장 형태를 유지하고 서로 (그림 1C)와 비슷한 크기 여야한다. ULA 24- 웰 플레이트의 배양은 상기 세포의 성장 및 팽창을 허용한다.

8 일째으로 첫 번째 티빈 신호와의 Wnt 억제에 노출 된 후, 집계는 크고 밝은 집계 (그림 1D)로 표시하기 시작합니다. 이 기간 동안 상당한 세포 파편을 각 웰의 바닥에 명백 할 것이다 집계 매체를 제거하기 전에 정착시킴으로써 제거되어야한다. 때때로, 많은 집계가 함께 융합 할 것이다. 이 "슈퍼 집계가"작은 집계에 보이는 형태 학적 변화를 전시하지 않는 경향이 완전한 차별화를받을 가능성이 적은 있지만, 이것은 물론 다른 골재의 분화를 억제하지 않습니다.

FO "jove_content"유지 - together.within 페이지 =을 증가 크기와 조직 섬유 영역의 모양과 집계에 주목할만한 형태 학적 변화의 "1"> 계속 분화의 결과. 12 일까지, 계약 집계는 관찰 할 수있다. 이들은 항상 큰 투명 세포로 구성 될 종종 집계 (그림 2) 외부의 광범위한 세포 외 기질이 포함됩니다. 총 전체의 수축이 성공적으로 차별화를 나타내는 반면, 심장 마커의 발현도 계약을 표시하지 않는 집계에서 관찰 할 수있다. 단위 및 immunolabeling의 분리 후, 세포의 대부분은 유동 세포 계측법에 의한 심근 마커 cTnT를 (그림 3)에 대한 긍정적 인 것입니다. 이 마커의 발현이 세포에서 안정하고 늦게 분화 19 일로서 응집체에서 관찰 될 수있다.

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그림 1 : hPSC의 타임 라인은 심장 운명을 향해 차별화 된 즉시 집계 한 후, 세포가 거의 각각의 마이크로 웰 (A)를 입력합니다.. 어느 날 후, 집계가 응축 나타납니다 부드러운 (B). 이 형태의 집합체가 마이크로 웰로부터 제거하고, 웰 플레이트 (C)에 도금되는 경우에도 지속. 8 일째으로 집계 확장하기 시작 및 색상 (D)에서 가벼운 나타납니다. 스케일 바 :. 250 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 :. 심장 유도 3 단계 중간에 육일는 강력한 집계 차원의 수축이 관찰 한 후 집계는 (주 분화 (12)에 의해 상부 패널을 계약 시작 : 휴식ATION, 가운데 패널 : 수축). 하판은 검은 색 또는 흰색 (화살촉)로 나타나는 가장 중요한 차이점이 상부 및 중간 패널 감산으로부터 유도된다. 스케일 바 :. 250 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 :. 하루에 17에서 차별화 된 hPSCs에서 심장 트로포 닌 T에 대한 Immunolabeling, 세포의 대부분은 유동 세포 계측법 (채워진 막대 그래프)에 의해 심장 트로포 닌 T에 긍정적이다. 또한 혼자 차 항체 (채워지지 히스토그램)으로 염색 된 세포가되어 도시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 다 능성 줄기 세포를 효율적으로 심장 분화가 매우 다양 과정임을 관찰되었다. 그것은 다른 세포주가 특정 세포 유형으로 분화 용량 변화 성향을 나타내는 것은 당연하지만, 이는 심장 분화 효율 동일한 세포주 ^(6)를 사용하여 실행 복제 사이 급격히 변동하는 것이 관찰되었다. 여기에 설명 된 프로토콜은 직접 집계 당 입력 세포 수를 제어함으로써 이러한 변화의 한 주요 원인을 해결합니다. 상기 런 사이 변동을 저감하기 위해서는, 단일 세포 계대하도록 hPSC 라인 능성 마커의 발현 빈도 (예를 들면, 인 Oct4, Nanog를에 대하여 더 일관 능성 인구 hPSC 확장 및 유지 보수의 결과,이 형태로 사용되는 것을 권장 TRA-1-60, 등.).

여기서 작성된 프로토콜은 O 1,000 세포 응집체 크기를 지정HES -2- 배아 줄기 세포주로부터 유도 ptimal 심장. 상이한 세포주에이 프로토콜을 적용하기 위해서는 초기 집합 크기 화면 세포주 별 최적의 응집체 크기를 결정하기 위해 수행되는 것이 중요하다. 직접적 여기 따라야 할 절차에 영향을주지 않지만, 우리는 산소 전달에 영향을 미치는 것으로 예상되는 골재의 크기와 전체 셀 밀도의 변화 리더 나게. 이 다운 스트림 애플리케이션에서 관련 고려 될 수 있습니다. 또한, 사멸 세포의 죽음은 하나의 세포에 hPSCs의 해리 동안 관심사입니다. 따라서, 그 ROCK 저해제는 마이크로 웰의 강제 세포 응집 동안 존재 확인하는 것이 중요하다. 마지막으로 분화 4 일에 집계가 아니라 이전에 유도 2 중간에서 재 부유로 유도 한 매체에 존재하는 추적 티빈을 제거하는 세척하는 것이 중요합니다. 분화 4 일 후에 티빈 A는 메소 희생 내배엽 분화를 촉진덤 유도 ^20.

이 기술의 주요 응용 프로그램은 효율적인 심장 분화를 촉진 집계 크기를 선별하는 것입니다. 그러나, 현재 기술의 한계 중 하나는 마이크로 웰 플레이트를 이용하여 임상 적으로 관련된 수준 심장 생산 스케일 도전된다는 것이다. 심장 차별화의 스케일 업 일반적으로 교반 서스펜션 생물 반응기 ^(21)의 대량 배양 조건에서 수행된다. 마이크로 웰 시스템이 효율적 심장 유도 골재 크기의 허용 가능한 범위를 결정하는 데 사용 된 후 따라서 확장하는 다음 단계는 원하는 세포 응집체 크기를 생성 할 수있는 바이오 리액터 임펠러 속도를 결정하는 것이다.

골재 기반 심장 분화하는 다른 방법에 대해 이러한 기술의 큰 차이의 하나는 집합체 내인성 신호의 변조에 영향뿐만 아니라 직접 조사를 가능하게한다는 것이다골재 ⁽¹³⁾ 내의 hPSCs와 유도 / 억제 조직 유형의 공동 배양. 조사 이러한 유형의 대규모 심장 생산 공정 개발을 알릴 수있다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
생물 안전 캐비닛
피펫 보조제
혈청학적 피펫 (5 - 25 ml)
흡인기
흡인기 또는 파스퇴르 피펫,
15 및 50ml 원뿔형 튜브
흄 후드
0.22 µ m 주사기 필터
5% CO2, 5% O2, 및 습도 조절 세포 배양 인큐베이터			저산소(저산소) 인큐베이터
5% CO2, 20% O2, 및 습도 조절 세포 배양 인큐베이터
플레이트 홀더가 장착된 스윙 버킷 로터가 있는 저속 원심분리기
P2, P20, P200 및 P1000 마이크로피펫터 및 관련 팁
4X, 10X 및 20X 위상 대물렌즈를 갖춘 도립 현미경
ULA(Ultra-Low Attachment) 24웰 플레이트	Corning/Costar	3473
1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브
벤치탑 마이크로 원심분리기
L-아스코르브산	Sigma-Aldrich	A4403
멸균 초순수 증류수	Sigma-Aldrich	W3500
Vortex
Ice
-20 > C 냉동고
모노티오글리세롤	시그마-알드리치	M6145	독성; 반복적인 개방으로 인한 산화를 최소화하기 위해 MTG의 부분 견적을 강력히 권장합니다. 부분 표본은 4°C; C 최대 3 개월, -20 ° C는 장기 보관에 권장됩니다.
StemPro-34 매체	Thermo Fisher Scientific	10639-011	기초 심장 유도 매체; 보충제는 -20 °에 저장됩니다. C 및 4 °C에서 기저 매체.
트랜스페린	로슈	10652202001
BMP-4	R & D 기술	314-BP
bFGF	R& D 기술	233-FB
VEGF	R & D 기술	293-VE
액티브 A	R & D Technologies	338-AC
IWP-2	시약 직접	57-G89
인산염 완충 식염수 (PBS)	Thermo Fisher Scientific	14190
소 혈청 알부민 (BSA)	Thermo Fisher Scientific	15561
염산	Sigma-Aldrich	258148	부식성
디메틸설폭사이드(DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12660
100x 페니실린/스트렙토마이신	Thermo Fisher Scientific	15140
100x L-글루타민	Thermo Fisher Scientific	25030
녹아웃 세럼 교체	Thermo Fisher Scientific	10828010
TrypLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563	해리 효소
혈구분석기
Trypan Blue
Aggrewell 400 플레이트	StemCell Technologies	27845	마이크로웰 플레이트
Aggrewell 헹굼 솔루션	StemCell 기술	7010	마이크로웰 린싱 솔루션
Y-27632 ROCK 억제제	Tocris	1254
콜라겐분해효소 타입 II	시그마-알드리치	C6885
Hank's Balanced Salt	Solution Thermo Fisher Scientific	14025092
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12483
96 웰 플레이트(FACS 염색용)
Intraprep Permeabilization 시약	Beckman Coulter	IM2389	키트(2개 부품 포함): 고정 솔루션 및 투과화 솔루션; 독성
cTnT 항체	네오마커	MS-295
염소 안티 마우스 -IgG APC 항체ThermoFisher	Molecular Probes	A865
5 ml 둥근 바닥 유세포 분석 튜브	FACS 기계에 따라 다릅니다