Summary
בשיטות מקובלות ליזום בידול מצטבר המבוסס השעית לב של פלוריפוטנטיים אדם נובע תאים (hPSCs) הם הטרידו עם ההטרוגניות תרבות ביחס גודל וצורה המצרפי. כאן אנו מתארים שיטה חזקה לבידול לב העסקת microwells ליצור שבשליטת הגודל hPSC אגרגטים בתרבית בתנאים לקידום לב.
Introduction
תרבית תאים במבחנה יכולה להתבצע תחת מספר שיטות, אבל בדרך כלל מתבצע בין אם דו ממדי תנאים חסידים או בתנאי השעיה תלת ממדים שיותר לשחזר באופן מלא במערכות vivo. כתוצאה מכך קיימת מגמה הולכת וגוברת בתחומים רבים של מחקר לפיתוח שיטות חזקות ליצירה תלת ממדי בונת רקמות. בתרחישים בם סוגי תהליכים בתא דורשים מטריקס תומך (ECM) אותות משטח דבקים, תלת ממד תרבות עשויה להיות מופעלת באמצעות בונת פיגום, שבו תאים בתרבית על או בתוך אקסוגניים תמיכת מטריקס 1. תאים ותהליכים שאינם דורשים הדבקה למטריצה תומכת יכולים להתבצע השעיה כמערכות unscaffolded המורכבות בעיקר או באופן בלעדי של תאים (אשר עשוי מכן להמשיך ליצור מטריצות אנדוגני משלהם) 2,3. כאן, אנו מציגים פרוטוקול o בידול לבתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם f (hPSCs - תאי גזע מסוגלים להפוך לכל סוג תא בגוף, אם ממקורות עובריים או אחרים) מבוקרים בגודל, מדים, אגרגטים unscaffolded.
דיפרנציאציה של hPSCs כמו אגרגטים השעיה סובלת וריאציות גדולות גודל מצטבר הוא בתוך לרוץ בין ריצות. השתנות זו היא תוצאה של השיטה המועסקת בדרך כלל כדי ליצור אגרגטים אלה, אשר כרוך ניתוק מכאני של מושבות תאים. כדי להפחית השתנות זו, מספר גישות שמשו לשלוט במספר תאים לכל סך הכל וכן בקוטר המצרפי ואחיד. דוגמאות כוללות היווצרות של אגרגטים צינורות microcentrifuge 4 או כפי תלוי טיפות 5, micropatterning מוגדרות דו ממדי מושבות hPSC 6 אז מה שיכול להיות מועבר ההשעיה, או צנטריפוגה של תאים לתוך U- או V-תחתון צלחות רבות גם 7,8, 9. עם זאת, כל אלה approaches מוגבל על ידי התפוקה שלהם הנמוכה של דור המצרפי. ובכן מבוססות מערכות לנקוט גישה דומה למערכות צלחת V-תחתון, אולם הגודל הקטן יותר של microwells (בפרוטוקול זה שלכל אחד מהם ברוחב של 400 מיקרומטר) מאפשר את הדור של מספרים גדולים יותר של אגרגטים אחיד מתרבות-צלחת אחת גם (בקוטר רמת ~ 15.5 מ"מ המכיל ~ 1,200 microwells) מאשר היה להיווצר מתוך צלחת V-התחתון כולו 10. ובכן מבוססי היווצרות המצרפי נעשה שימוש בכמה הגדרות כולל בידול של hPSCs כדי Ectodermal 11, endodermal 12, mesodermal 13 ו extraembryonic 14 גורלות; chondrogenesis מתאי גזע mesenchymal 15; דור של מצעים אחידים להקרנה טוקסיקולוגית 16; וחקירות של mechanobiology 17.
אחד האתגרים העיקריים בפיתוח פרוטוקולים הייצור חזקים לייצור hPSC הנגזרות cardiomyocytes כבר וחוסר השחזור יעיל בידול לב בין ריצות. הראינו בעבר ששונה זו ניתן לייחס ההטרוגניות באוכלוסיית hPSC החלה, המהווה הוא עצמי חידוש hPSCs ומבדל תאים המבטאים גנים הקשורים בידול האנדודרם עצבי 6,18. איתותי המופרשים מתאי המבדילים הללו להשפיע אינדוקציה הלב. באופן ספציפי, endoderm extraembryonic מקדם אינדוקצית לב, ואילו אבות עצביים לעכב אינדוקצית לב. עם צבירת hPSC, תאים בתוך להבדיל האוספים ומארגנים כך hPSCs המובחן מוקפים בשכבת תאי extraembryonic endoderm המתפתחים על פני השטח המצרפי 13. על ידי שליטת גודל מצטבר, אנו יכולים לווסת את היחס של תאי האנדודרם וישכנע לב כדי hPSCs המובחן (שטח פן יחס נפח) לייעל את היחס הזה לזירוז לב מרבי 13.
Protocol
1. הכנת רכיבים בינוני
- כן לשטוף בינוני. לכל 100 מ"ל של DMEM / F12, להוסיף 1 מ"ל של 100x פניצילין / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס), 1 מ"ל של 100x L- גלוטמין, ו -5 מ"ל של החלפת בסרום.
- הכן את מדיום אינדוקצית לב בסל הגדרה הכימית פי הוראות היצרן.
- כן ריאגנטים המניות הבאים למדיה אשר ישמשו בפרוטוקול זה.
- L-Ascorbic Acid: כן פתרון מניות של 5 מ"ג לכל מיליליטר ב 4 מעלות צלזיוס, מים מזוקקים טהורים סטרילי בתוך שפופרת חרוטים.
- השאירו את הפתרון הזה על הקרח מערבולת הצינור מעת לעת עד המומס הוא נמס לגמרי. סנן לעקר את הפתרון חומצה אסקורבית באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
- הכן 1 aliquots מ"ל של תמיסת חומצה אסקורבית ולאחסן aliquots אלה ב -20 ° C. השתמש aliquot טרי מופשר כל מדיום זמן מוכן.
- ביום הכנה בינונית, לדלל 13 μl של monothioglycerol (MTG) ב 1 מ"ל של מדיום אינדוקציה בסל לב. בטל MTG בשימוש, בדילול מלא.
- הכן 1 aliquots מ"ל של transferrin (30 מ"ג / מ"ל) כדי לאחסן ב -20 ° C. חנות מופשרת aliquots ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים.
- הכן 4 חומצה הידרוכלורית מ"מ (HCl) המכיל 0.1% שור סרום אלבומין (BSA). במנדף קטר, להוסיף 30 μl של 6.0 פתרון N HCl 50 מ"ל מים מזוקקים טהורים לחלוטין. מסנן לעקר את הפתרון באמצעות מזרק מסנן 0.22 מיקרומטר. הוסף 2 מ"ל של תמיסת BSA 25% לפתרון HCl 50 מ"ל.
- כן בופר פוספט (PBS) המכיל 0.1% BSA. הוסף 20 μl של פתרון BSA 25% לכל מ"ל PBS.
- כן האדם העצם המוךפו"גנטי שהולך חלבון 4 (BMP-4) פתרון מניות (10 ng / μl). ממיסים 10 מיקרוגרם lyophilized BMP-4 ב 1 מ"ל של 4 פתרון חיץ מ"מ HCl המכיל 0.1% BSA. כן 50 μl aliquots לאחסן ב -20 ° C.
- כן 2 פקטור גדילת פיברובלסטים אדם (bFGF) פתרון מניות(10 ng / μl). ממיסים 10 מיקרוגרם lyophilized bFGF ב 1 מ"ל של בופר פוספט (PBS) המכיל 0.1% BSA. כן 50 μl aliquots לאחסן ב -20 ° C.
- הכן פקטור הגדילה של אנדותל כלי דם האדם (VEGF) פתרון המניות (5 ng / μl). ממיסים 5 מיקרוגרם VEGF lyophilized ב 1 מ"ל של PBS המכיל 0.1% BSA. כן 50 μl aliquots לאחסן ב -20 ° C.
- כן Activin פתרון מניות (10 ng / μl). ממיסים 10 מיקרוגרם lyophilized Activin א '1 מ"ל של PBS המכיל 0.1% שור סרום אלבומין (BSA). כן 50 μl aliquots לאחסן ב -20 ° C.
- כן מונע של Wnt הפקה-2 (IWP-2) פתרון מניות (10 מ"מימ). ממיסים 2 מ"ג IWP-2 ב 429 μl דימתיל sulfoxide (DMSO). כן 10 μl aliquots לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
- L-Ascorbic Acid: כן פתרון מניות של 5 מ"ג לכל מיליליטר ב 4 מעלות צלזיוס, מים מזוקקים טהורים סטרילי בתוך שפופרת חרוטים.
- כן בינוני אינדוקצית לב שלם. ל -100 מ"ל של Basal לב אינדוקציה בינונית, מוסיפים 1 מ"ל של 100x פן / סטרפטוקוקוס, 1 מ"ל של 100x L- גלוטמין, 500 μl של transferrin, 1מ"ל של חומצה אסקורבית מופשר טרי, ו -300 μl של MTG. בטל בינוני בשימוש.
2. הכנת צלחת microwell
הערה: כל הצעדים צריכה להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
- הוסף 0.5 מ"ל פתרון שטיפה (רכיב בערכה) היטב כל אשר ישמשו על הצלחת. כדי להבטיח כי המגעים פתרון פני השטח כולו בתוך כל microwell, בצנטריפוגה צלחת ב 840 XG למשך 2 דקות.
- דגירה את הצלחת למשך 30 עד 60 דקות ב RT.
- לשאוב את פתרון השטיפה מהבארות. לשטוף כל פעמיים גם כדלקמן: הוסף 1 מ"ל של PBS על כל טוב, צנטריפוגה את הצלחת ב 840 XG למשך 2 דקות, ולאחר מכן לשאוב PBS.
3. גיבוש hPSC אגרגטים פלייט microwell
הערה: כל הצעדים צריכה להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
- מניחים לשטוף בינוני באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
הערה: נפח נדרש = 1 מ"ל x מספר בארות של HPSC כי יהיה ניתק. - לנתק hPSCs תאים בודדים
הערה: שלבים אלה מתארים את הניתוק של תאים בתרבית על 6 צלחות היטב - הכרכים מגיבים וניתן לשנותם באופן יחסי עבור פורמטי תרבות אחרים.- לשאוב את המדיום תרבות מכל תרבות hPSC גם דיסוציאציה. יש לשטוף היטב עם כל 1 מ"ל של אנזים דיסוציאציה, ומיד לשאוב האנזים דיסוציאציה מכל טוב.
הערה: אנזים דיסוציאציה שיורית צריך להספיק כדי לנתק את התאים. - דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
- הוסף 1 מ"ל של לשטוף בינוני זה טוב מכנית לנתק את התאים מפני השטח בתרבית רקמה על ידי pipetting וואש בינוני עם micropipettor P1000 על פני בתרבית רקמה. אם הניתוק שנראה גושים שלמים ותא להישאר, לעבור את ההשעיה דרך מסנן בנקודה זו.
- מעבירים את ההשעיה לתא צינור חרוטי 15 מ"ל ולאחסןהצינור בחממה בעוד שמספר התא מתבצע בשלב הבא.
- בצעו ספירת תאים:
- לקחת דגימת 10 μl של השעית התא שנאספה בשלב הקודם. הוסף 30 μl של Trypan כחול ומערבבים ההשעיה היטב על ידי pipetting.
- העבר 10 μl של Trypan כחול מוכתם תאים לכל מקום משכנו של hemocytometer ולדמיין תחת מיקרוסקופ הפוכה במטרה 10X. ספירת התאים.
- מתוצאות ספירת תאים, לחשב כמה בארות ניתן זורעים 1.2 x 10 6 תאים לכל גם צלחת microwell. חישוב צבירת בינוני נדרש זרע התאים ב 1 מ"ל לכל טוב.
- כן בינוני צבירה. לכל 10 מיליליטר של מדיום אינדוקצית לב מלא, להוסיף 0.5 μl של פתרון מניות BMP4 (ריכוז סופי = 0.5 ng / ml) ו- Y-27632 ROCK מונע (ריכוז סופי = 10 מיקרומטר).
- הסר את צינור חרוטי המכיל את hPSCs מן החממה centrifuge הצינור ב XG 200 במשך 5 דקות. לשאוב את המדיום לשטוף ו resuspend התאים במדיום צבירה בצפיפות של 1.2 x 10 6 תאים לכל מיליליטר.
- לשאוב את הפתרון לשטוף PBS מבאר כל צלחת microwell. באמצעות micropipettor P1000, להפיץ זרע 1 מ"ל שווה של השעיה התא היטב כל על צלחת microwell. לזרע מספר רב של בארות, מעת לעת מערבולת השעית התא למנוע שיקוע.
- צנטריפוגה את הצלחת ב XG 200 במשך 5 דקות. שים את הצלחת תחת מיקרוסקופ כדי לאשר תאים טוו לתחתית של כל microwell.
- דגירה את הצלחת למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס חממה 5% CO 2, 5% O 2 (חוסר חמצן).
- לשאוב את המדיום תרבות מכל תרבות hPSC גם דיסוציאציה. יש לשטוף היטב עם כל 1 מ"ל של אנזים דיסוציאציה, ומיד לשאוב האנזים דיסוציאציה מכל טוב.
4. אינדוקציה הלב שלב 1
- יום אחד לאחר צבירה (יום 1), להכין את נפח הנדרש בינוני אינדוקציה שלב 1 (24 צלחת היטב, נפח = 1 מ"ל x מספר בארות). עבור 1 מ"ל של שלמהבינוני אינדוקצית לב, להוסיף 1 μl של פתרון מניות BMP4 (ריכוז סופי = 10 ng / ml), 0.5 μl של פתרון מניות bFGF (ריכוז סופי = 5 ng / ml), ו -0.6 μl של Activin A (ריכוז סופי = 6 ng / מ"ל). מניחים את המדיום באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות לפחות.
- הסר את צלחת microwell מן החממה. בדוק את אגרגטים תחת מיקרוסקופ. לעומת צבירה שלאחר צנטריפוגות מיד, הם צריכים להופיע שלמים עם קצוות חלקים (יותר עגול פחות מרובע מאשר יום קודם לכן).
- הסר את supernatant מבלי להפריע אגרגטים בתוך microwells:
- החזק את צלחת microwell אופקית ברמה (כלומר., לא להטות אותו). עבור כל טוב על צלחת microwell, הנח את הקצה של micropipettor P1000 על פני השטח של מדיום התרבות על קצה הבאר.
- לאט להסיר את המדיום, נזהר שלא להפריע המצרפים בתחתית של microwells. לאחר שהוריד tהוא ברמה בינונית לכ 1 עד 2 מ"מ מפני שטח microwell מרקם, לאט להטות את הצלחת לאסוף בינוני בצד אחד של הבאר (פעם העצמה נמוכה מספיק, בתנועה זורמת מופחתת במידה ניכרת וזה קל יותר להימנע אגרגטים מקבלים הרים מתוך microwells האישי שלהם). לאט פיפטה את המדיום הנותרים הבאר.
- כדי להוסיף בינוני אינדוקציה טריים שלב 1 תוך הקפדה על אגרגטים להישאר microwells האישיים שלהם: צייר 1 מ"ל של מדיום אינדוקציה שלב 1 עם micropipettor P1000. החזק את קצה פיפטה כנגד הקצה הפנימי של הבאר לאט מאוד לוותר על המדיום אל הקיר הפנימי של הבאר. חזור על הבארות הנותרות.
- מחזיר את הצלחת אל האינקובטור בתנאי חוסר חמצן במשך 3 ימים.
5. אינדוקצית לב שלב 2
- ביום 4, במקום לשטוף בינוני (נפח = מספר בארות x 2 מ"ל) באמבט המים 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 15 דקות.
- הכן את הנפח של בינוני אינדוקציה שלב 2 (נפח = מספר בארות x 1 מ"ל): לכל מ"ל של מדיום אינדוקציה לב מלאה, להוסיף 2 μl של פתרון המניות VEGF (הריכוז הסופי = 10 ng / ml) ו -0.5 μl IWP-2 פתרון מניות (= 5 מיקרומטר ריכוז סופיים). מניחים את המדיום אינדוקציה מוכן שלב 2 באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 15 דקות.
- בעזרת פיפטה 5 מ"ל סרולוגית, לקצור המצרפים מבאר כל צלחת microwell לאסוף את ההשעיה המצרפי צינור חרוטי 15 מ"ל (לאסוף עד 10 בארות לכל שפופרת 15 מ"ל).
- אפשר המצרף להתיישב במשך 15 דקות בתוך חממה היפוקסי.
הערה: שלב זה חשוב להפריד תאים בודדים ופסולת הסלולר מן אגרגטים ללא פגע. - לשאוב supernatant בזהירות resuspend המצרפים ב 10 מ"ל של בינוני מחומם מראש לשטוף כדי להסיר ציטוקינים אינדוקטיביים שיורית (למשל, Activin A הוא מולקולת איתות חזק אפילו שיתוף נמוך מאודncentrations).
- צנטריפוגה אגרגטים ב 50 XG למשך 2 דקות. לשאוב supernatant. Resuspend המצרפים pelleted במדיום אינדוקציה 2 מחומם מראש.
- מעבירים את ההשעיה המצרפי מצורף אולטרה-נמוכה 24 גם צלחת (אולא) ב 1 מ"ל לכל טוב. שים המצרפים מתחת למיקרוסקופ כאחידות, צבירי תאים חזקים. דגירה בתנאי חוסר חמצן עד יום 6.
6. אינדוקציה הלב שלב 3
- ביום 6, להכין את הנפח של בינוני אינדוקציה שלב 3 (נפח = מספר בארות x 1 מ"ל). עבור 1 מ"ל של מדיום אינדוקציה לב מלאה, להוסיף פתרון המניות 2 μl VEGF (הריכוז הסופי = 10 ng / ml), ו -0.5 μl של פתרון מניות bFGF (ריכוז סופי = 5 ng / ml). מניחים בינוני אינדוקציה שלב 3 מוכן באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 15 דקות.
- השתמש פיפטה 5 מ"ל סרולוגיות להעביר את אגרגטים ל -15 מ"ל צינורות חרוטי, איגום עד 10 מ"ל של המצרפיים לכל צינור.
- אפשר 10 דקות עבור אגרגטים להתיישב. לשאוב supernatant ו resuspend המצרפים במדיום אינדוקציה שלב 3 מחומם מראש. בעזרת פיפטה 5 מ"ל סרולוגית, להפיץ מחדש המצרפים לתוך צלחת 24 גם אולא ב 1 מ"ל לכל טוב.
- ביום 10, להכין את הנפח של בינוני אינדוקציה שלב 3 (נפח = מספר בארות x 1 מ"ל) לפי שלב 6.1.
- השתמש פיפטה 5 מ"ל סרולוגיות להעביר את אגרגטים ל -15 מ"ל צינורות חרוטי, איגום עד 10 מ"ל של אגרגטים לכל צינור.
- אפשר 10 דקות עבור אגרגטים להתיישב. לשאוב supernatant ו resuspend המצרף בשלב 3 אינדוקציה בינונית. בעזרת פיפטה 5 מ"ל סרולוגית, להפיץ מחדש המצרפים לתוך צלחת 24 גם אולא ב 1 מ"ל לכל טוב.
- דגירה בתנאי חוסר חמצן במשך ימים. ביום 12, להתחיל דוגרי התאים ברמות חמצן normoxic לשארית תקופת התרבות (37 ° C, 20% O 2, 5% CO 2).
הערה:לאחר נקודת זמן זו, תאים הם כבר לא מתורבתים בתנאי חוסר חמצן. - חזור על חילופי בינוני מלא זה (שלבי 6.2 ו -6.3) כל 4 ימים, החלו ביום 14 עד קציר תאים (בדרך כלל, ריכוזי cardiomyocyte שיא נצפים לאחר יום 14 של בידול).
7. ניתוח cytometry זרימה של Cardiac Troponin T (cTnT) תדירות הביטוי של פלט תרבות microwell
- לנתק את אגרגטים כדלקמן:
- השתמש פיפטה סרולוגיות 5 מ"ל להעביר 1 גם של אגרגטים על צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה אגרגטים ב 50 XG למשך 2 דקות ובזהירות לשאוב supernatant.
- הוסף 1 מ"ל של טרי מומס 1 מ"ג / מ"ל Collagenase פתרון Type II כדי המצרפים. מעבירים את ההשעיה המצרפי צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. דגירה אגרגטים Collagenase Type II הלילה בטמפרטורת החדר.
- למחרת, השתמש micropipettor P1000 בעדינות כדי לנתק את אגרגטיםלתוך השעית תא בודדת הומוגנית. אם המצרפים לא לנתק בקלות, ליישב את אגרגטים, לשאוב supernatant, דגירה אגרגטים 700 μl של אנזים דיסוציאציה 1 עד 2 דקות ב RT. בעדינות פיפטה המצרפים 1 עד 2 פעמים עם micropipettor P1000 לנתק.
- לדלל את אנזים דיסוציאציה: הוסף 700 μl של שטפי בינוני המכיל 14 μl של 1 מ"ג / פתרון המניות DNAse מ"ל. לקחת דגימה 10 μl לבצע ספירת תאים, צנטריפוגות ההשעיה הנותרים באמצעות microcentrifuge הספסל העליון ב XG 300 במשך 2 דקות.
- בצע ספירת תאים: כתם מדגם הספירה 10 μl עם נפח שווה של כחול Trypan ולספור באמצעות hemocytometer.
- הסר את צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge המכיל את התאים הנותרים מן microcentrifuge. לשאוב supernatant ו resuspend התאים, בריכוז של 200,000 ל -500,000 תאים לכל 100 μl, ב הנקס מאוזן תמיסת מלח המכיל2% בסרום שור עוברי (HF).
- עבור כל תנאי, להעביר 100 μl של ההשעיה תא לכל היטב 2 בארות של צלחת 96-היטב (גם אחד יהיה מוכתם עם נוגדן cTnT והשני יהיה שליטה נוגדנים משני).
- צנטריפוגה את הצלחת ב 300 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant עם micropipettor רב.
- תקן את התאים: הוספת 200 μl של פתרון קיבוע (רכיב בערכה) לכל היטב דגירת הצלחת במשך 15 דקות ב RT.
- צנטריפוגה את הצלחת ב 300 XG למשך 2 דקות. השתמש micropipettor רב כדי למשוך את supernatant בזהירות מבארות. השלך את supernatant מיכל פסול paraformaldehyde.
- לשטוף את התאים הקבועים פעמים: הוספת 200 μl של HF היטב כל אחד. צנטריפוגה את הצלחת ב 300 XG למשך 2 דקות. לשאוב supernatant, וחזור על השלב לשטוף פעם נוספת. תאים קבועים ניתן לאחסן עד שבוע ב HF על 4 מעלות צלזיוס.
- Permeabilize התאים:
- צנטריפוגה את הצלחת ב 300XG למשך 2 דקות.
- הוספת 100 μl של פתרון Permeabilization (רכיב בערכה) היטב כל דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- צנטריפוגה את הצלחת ב 300 XG למשך 2 דקות ו לשאוב supernatant.
- להכין תערובת אמן אנטי-cTnT ב HF בריכוז האופטימלי עבור ממספרת נתון (הדילול האופטימלי צריך להיקבע על ידי טיטרציה ובדרך כלל נע בין 1: 500 עד 1: 2,000).
- עבור כל תנאי (2 בארות לכל מצב), להוסיף 100 μl של מיקס מאסטר גם אחד (מדגם מוכתם) ו -100 μl של HF הרגיל לבאר האחרים (שליטת נוגדנים משני). דגירת התאים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 2 דקות. לשאוב supernatant ולהוסיף 200 μl של HF לכל טוב. חזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת.
- להכין תערובת מאסטר של נוגדנים משני. העבר בהיקף של HF שמקביל 100 μl לכל היטב (שליטה נוגדנים משניcTnT מוכתם) מטופלת. הוסף 1 μl של נוגדנים משני אנטי עכבר APC עז לכל 200 μl של HF (1: 200 דילול).
- כתם הדגימות. הוספת 100 μl של פתרון מכתים היטב כל (הן את השליטה נוגדנים משני ובארות אנטי cTnT מוכתם). דגירה תאים בחושך על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (לשמור על צלחת מכוסה או בחושך לאחר הוספת נוגדנים משני ניאון כדי להימנע photobleaching).
- צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 2 דקות. לשאוב supernatant ולהוסיף 200 μl של HF לכל טוב. חזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת.
- העברת דגימות 5 מ"ל עגול זרימת התחתונה cytometer צינורות ניתוח ולבצע cytometry הזרימה עבור האות בערוץ APC באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים עבור המכשיר 19.
Representative Results
אגרגטים שבשליטת גודל של hPSCs יכול להיווצר ביעילות באמצעות מערכת microwell, תלוי רק ריכוז של תאים ואת שטח microwell. בעקבות צנטריפוגה קצר, המספרים המתאימים של תאים (1,000 בפרוטוקול זה) הם הביאו יחד בכל microwell (איור 1 א). חשוב לציין, תאים אלה מחדש קשרים תאיים בתוך 24 שעות, ולא צריך עוד למלא באר, אך הן מופיעים אגרגטים קומפקטיים עם קצוות חלקים (איור 1 ב). אגרגטים אלה מספקים את החומרים המוצא לבידול נוסף לקראת גורל לב. אם התאים אינם מהווים אשכולות חזקים, זה מצביע על מוות של תאים אפשריים בעקבות התנתקות reaggregation, ואת התאמתו של ריכוזי passaging ורוק התא בודדים מעכב עבור קו תא מסוים צריכים להיבחן. שלושת הימים הבאים microwells להראות שינוי קטן מורפו המצרפי משעמם, למרות צמיחה כמה ניכרת. כאשר יוסר microwells, אגרגטים צריכים לשמור ההקפה, מורפולוגיה צפופה ולהיות בסדר גודל דומה לזה (איור 1 ג). תרבות 24 גם צלחות אולא תאפשר הרחבת תא נוספת וצמיחה.
במשך היום 8, לאחר החשיפה הראשונה איתות Activin, ועיכוב Wnt, המצרפים יתחילו להופיע כמו אגרגטים גדולים ובהירים (1D איור). במהלך תקופה זו, פסולת הסלולר ניכרת תהיה ברורה בתחתית כל טוב יש להסיר על ידי המאפשר אגרגטים להתיישב לפני הסרת תקשורת. לפעמים, אגרגטים רבים מךתןז. זה לא לעכב את הבידול של אגרגטים אחרים הבאר, אם כי אלה "אגרגטים סופר" נוטים שלא להציג את השינויים המורפולוגיים לראות עם אגרגטים קטנים נוטים פחות לעבור התמיינות מלאה.
"Jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> תוצאות בידול המשך שינויים מורפולוגיים בולטים המצרפים עם גודל מוגבר והופעת האזורים סיביים מאורגנים. במשך היום 12, אגרגטים קבלנות ניתן לצפות. אלה תמיד יהיו מורכבים של תאים גדולים, שקופים ולעתים קרובות כוללים תאי מטריקס נרחבים מחוץ במצטבר (איור 2). בעוד צירים המצרפי-רחבים מצביעים אבחון מוצלח, ביטוי סמן לב עשוי להיות גם ציין אגרגטים שאינו מופיעים להתכווץ. בעקבות ניתוק של אגרגטים immunolabeling, רוב התאים יהיה חיובי עבור cTnT סמן cardiomyocyte ידי cytometry זרימה (איור 3). הביטוי של סמן זה הוא יציב לתאים ועלולים להיות שנצפה אגרגטים מאוחר ככל יום 19 של בידול.
1.jpg "/>
איור 1: ציר הזמן של hPSC הבדיל כלפי גורל לב מיד לאחר צבירה, תאים כמעט ממלאים כל microwell (א).. יום אחד מאוחר יותר, המצרפים להופיע מרוכז וחלקה (B). מורפולוגיה זו נמשכת גם כאשר אגרגטים יוסרו מן microwells ו מצופה לתוך צלחות גם (C). במשך היום 8, אגרגטים מתחילים להתרחב להופיע בהיר (ד '). סרגל קנה מידה:. 250 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: אגרגטים בגין המתקשרים יום 12 של בידול לאחר שישה ימים Cardiac אינדוקציה שלב 3 בינוני, התכווצויות המצרפי-רחב כוחנית נצפו (הפאנל העליון:. להירגעation, פאנל באמצע: התכווצות). הפנל התחתון נגזר הפחתת הלוחות הגבוהים ובינוניים, עם רוב ההבדלים משמעותיים המופיעים כשחור או לבן (ראשי חץ). סרגל קנה מידה:. 250 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. Immunolabeling עבור Cardiac Troponin T ב הבדיל hPSCs באותו יום 17, רוב התאים הם חיוביים עבור T טרופונין לבבי ידי cytometry זרימה (היסטוגרמה מלא). מוצג גם הם תאים מוכתם נוגדנים משני בלבד (היסטוגרמה ללא מילוי). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
זה נצפה כי בידול הלב ביותר של תאי גזע פלוריפוטנטיים הוא תהליך משתנה מאוד. אמנם זה לא מפתיע כי שורות תאים שונות להפגין נטיות שונות עבור קיבולת בידול כדי סוגי תאים מסוימים, היא נצפתה כי יעילות בידול הלב משתנה באופן דרמטי בין לשכפל פועל באמצעות באותו תא קו 6. הפרוטוקול המתואר כאן כתובות מקור עיקרי אחת מהשונות ידי ישירות השליט את המספר הסלולרי קלט לכל המצרפי. כדי לצמצם עוד יותר השתנות בין ריצות, מומלץ כי קווי hPSC המותאמים passaging תא בודד משמשים, כמו צורה זו של תוצאות הרחבה ותחזוקת hPSC באוכלוסיות פלוריפוטנטיים עקביות יותר ביחס תדרי ביטוי של סמני pluripotency (למשל, Oct4, Nanog, tra-1-60, וכו.).
הפרוטוקול כפי שנכתב כאן מציין גודל כולל של 1,000 תאים עבור oאינדוקצית לב ptimal משורת תאי גזע עוברית הס-2. כדי להחיל בפרוטוקול זה כדי שורות תאים שונות, זה קריטי, כי מסך גודל מצטבר ראשוני שיש לבצע כדי לקבוע את גודל המצטבר האופטימלי ספציפי שורת תאים. אמנם זה לא משפיע על הנהלים ישירות להיות אחריו כאן, אנו מזכירים לקורא שמשנה בגודל המצרפי צפיפות תאים הכוללות צפויים להשפיע אספקת חמצן. זה עשוי להיות שיקול רלוונטי ביישומים במורד הזרם. בנוסף, מוות של תאים אפופטוטיים היא דאגה במהלך דיסוציאציה של hPSCs תאים בודדים. לכן, חשוב להבטיח כי מעכב ROCK הוא נוכח במהלך צבירת תא כפיית microwells. לבסוף, זה קריטי, כי ביום 4 של בידול המצרפים נשטפים היטב כדי להסיר עקבות Activin A, נוכח בינוני 1 אינדוקציה, לפני resuspension אינדוקציה 2 בינוני. לאחר יום 4 של בידול, Activin מקדם בידול האנדודרם על החשבון טווהאינדוקציה Derm 20.
היישום העיקרי של שיטה זו הוא להקרין בגדלים המצרפי המקדמים בידול הלב ביותר. עם זאת, אחת המגבלות של הטכניקה הנוכחית היא כי אתה עשוי להתקשות הייצור בקנה מידה לב לרמות רלוונטיות קלינית באמצעות צלחות microwell. עד בסולם של בידול לב בדרך כלל מתבצע בתנאי תרבות בתפזורת bioreactors השעיה עורר 21. לכן, ברגע שמערכת microwell נעשה שימוש כדי לקבוע טווחים מקובלים של גודל מצטבר לזירוז הלב ביותר, הצעד הבא בהיקף של עד הוא לקבוע מהירויות מאיצות bioreactor שיכול ליצור את הגודל מצטבר תא הרצוי.
אחד ההבדלים המשמעותיים של טכניקה זו ביחס לשיטות אחרות לבידול לב המצרפי מבוסס הוא בכך שהוא מאפשר חקירות ישירות לתוך ויסות את ההשפעות של איתות אנדוגני אגרגטים וכןשיתוף התרבות של סוגי רקמות אינדוקטיביים / מעכבות עם hPSCs ב -13 המצרפי. אלו סוגים של חקירות יכולים להודיע פיתוח תהליך ייצור לב בקנה מידה גדולה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet | |||
| Pipette aid | |||
| Serological pipettes (5 to 25 ml) | |||
| Aspirator | |||
| Aspirator or Pasteur pipettes | |||
| 15 and 50 ml conical tubes | |||
| Fume hood | |||
| 0.22 µm syringe filter | |||
| 5% CO2, 5% O2, and humidity controlled cell culture incubator | Hypoxic (low oxygen) incubator | ||
| 5% CO2, 20% O2, and humidity controlled cell culture incubator | |||
| Low speed centrifuge with a swinging bucket rotor fitted with a plate holder | |||
| P2, P20, P200, and P1000 micropipettors and associated tips | |||
| Inverted microscope with 4X, 10X and 20X phase objectives | |||
| Ultra-Low Attachment (ULA) 24 well plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Bench-top microcentrifuge | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Sterile Ultrapure distilled water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Vortex | |||
| Ice | |||
| -20 °C freezer | |||
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic; Aliquoting of MTG is strongly recommended to minimize oxidation due to repeated opening. Aliquots can be stored at 4 °C for up to 3 months, -20 °C is recommended for long-term storage. |
| StemPro-34 Medium | Thermo Fisher Scientific | 10639-011 | Basal Cardiac Induction Medium; The supplement is stored at -20 °C and the basal medium at 4 °C. |
| Transferrin | Roche | 10652202001 | |
| BMP-4 | R&D Technologies | 314-BP | |
| bFGF | R&D Technologies | 233-FB | |
| VEGF | R&D Technologies | 293-VE | |
| Activin A | R&D Technologies | 338-AC | |
| IWP-2 | Reagents Direct | 57-G89 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | 15561 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | Corrosive |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| 100x L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| TrypLE Select | Thermo Fisher Scientific | 12563 | Dissociation enzyme |
| Hemocytometer | |||
| Trypan Blue | |||
| Aggrewell 400 plates | StemCell Technologies | 27845 | Microwell Plates |
| Aggrewell Rinsing Solution | StemCell Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Tocris | 1254 | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483 | |
| 96 well plate (for FACS staining) | |||
| Intraprep Permeabilization Reagent | Beckman Coulter | IM2389 | Kit with 2 parts: Fixation Solution and Permeabilization Solution; Toxic |
| cTnT antibody | Neomarkers | MS-295 | |
| goat anti-mouse-IgG APC antibodyThermoFisher | Molecular Probes | A865 | |
| 5 ml round bottom flow cytometry tubes | FACS machine dependent |
References
- Wintermantel, E., et al. Tissue engineering scaffolds using superstructures. Biomaterials. 17, 83-91 (1996).
- Lazar, A., et al. Formation of porcine hepatocyte spheroids for use in a bioartificial liver. Cell Transplant. 4, 259-268 (1995).
- Sachlos, E., Auguste, D. T. Embryoid body morphology influences diffusive transport of inductive biochemicals: a strategy for stem cell differentiation. Biomaterials. 29, 4471-4480 (2008).
- Johnstone, B., Hering, T. M., Caplan, A. I., Goldberg, V. M., Yoo, J. U. In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Exp. Cell Res. 238, 265-272 (1998).
- Steinberg, M. S. Does differential adhesion govern self-assembly processes in histogenesis? Equilibrium configurations and the emergence of a hierarchy among populations of embryonic cells. J. Exp. Zool. 173, 395-433 (1970).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells Dayt. Ohio. 26, 2300-2310 (2008).
- Koike, M., Kurosawa, H., Amano, Y. A Round-bottom 96-well Polystyrene Plate Coated with 2-methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine as an Effective Tool for Embryoid Body Formation. Cytotechnology. 47, 3-10 (2005).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, 1601-1603 (2005).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells Dayt. Ohio. 25, 929-938 (2007).
- Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PloS One. 3, e1565 (2008).
- Kozhich, O. A., Hamilton, R. S., Mallon, B. S. Standardized generation and differentiation of neural precursor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 9, 531-536 (2013).
- Ungrin, M. D., et al. Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics. Biotechnol. Bioeng. 109, 853-866 (2012).
- Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 17, 1901-1909 (2011).
- Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reprod. Camb. Engl. 140, 3-9 (2010).
- Markway, B. D., et al. Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures. Cell Transplant. 19, 29-42 (2010).
- Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell. Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. 127, 403-411 (2012).
- Wallace, L., Reichelt, J. Using 3D culture to investigate the role of mechanical signaling in keratinocyte stem cells. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 989, 153-164 (2013).
- Ungrin, M., O'Connor, M., Eaves, C., Zandstra, P. W. Phenotypic analysis of human embryonic stem cells. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. , (2007).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. JoVE. , e52010 (2014).
- Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFβ family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Dev. Camb. Engl. 138, 861-871 (2011).
- Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol. Bioeng. 102, 493-507 (2009).
