Summary
Konventionelle metoder til at initiere suspension aggregat baseret hjertedifferentiering af humane pluripotente stængler celler (hPSCs) er plaget med kultur heterogenitet med hensyn til den samlede størrelse og form. Her beskriver vi en robust metode til hjertedifferentiering anvender mikrobrønde at generere størrelse-kontrollerede hPSC aggregater dyrkes under hjerte--fremmende betingelser.
Introduction
In vitro-cellekultur kan udføres under en række modaliteter, men udføres typisk enten i todimensionale adhærerende forhold eller i tredimensionelle suspension betingelser, der mere fuldstændigt rekapitule- in vivo-systemer. Derfor er der en stigende tendens i mange områder af forskning for at udvikle robuste metoder til at generere tredimensionelle væv konstruktioner. I scenarier, hvor celletyper og processer kræver en støttende ekstracellulære matrix (ECM) overfladeaktive og vedhæftning signaler, kan tre-dimensionelle kultur aktiveres via afstivet konstruktioner, hvor cellerne dyrkes på eller i en eksogen støtte matrix 1. Celler og processer, der ikke kræver vedhæftning til en støttende matrix kan udføres i suspension som unscaffolded systemer bestående primært eller udelukkende af celler (som så kan fortsætte at generere deres egne endogene matricer) 2,3. Her præsenterer vi en protokol for hjerte-differentiering of menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs - stamceller i stand til at blive hvilken som helst celletype i kroppen, hvad enten fra embryonale eller andre kilder) i størrelse-kontrolleret, ensartet, unscaffolded aggregater.
Differentiering af hPSCs som suspension aggregater er plaget af store variationer i den samlede størrelse både i en køre og mellem kørsler. Denne variabilitet er en konsekvens af den metode, der typisk anvendes til at generere disse aggregater, der involverer mekanisk dissociation af cellekolonier. For at reducere denne variabilitet, har en række metoder blevet anvendt til at kontrollere antallet af celler pr aggregat samt aggregatdiameter og ensartethed. Eksempler indbefatter dannelse af aggregater i mikrocentrifugerør 4 eller som hængende dråber 5, micropatterning defineret todimensionale hPSC kolonier 6, som derefter kan overføres til suspension eller centrifugering af celler i U- eller V-bundede flerbrøndsplader 7,8, 9. Men alle disse ca.oaches er begrænset af deres lille produktion af den samlede produktion. Well-baserede systemer anvender en lignende tilgang til V-bundede plade-systemer, men den mindre størrelse af mikrobrøndene (i denne protokol hver har en bredde på 400 um) muliggør generering af et større antal ensartede aggregater fra en enkelt kultur-plade brønd (standard diameter på ~ 15,5 mm indeholdende ~ 1.200 mikrobrønde), end det ville blive genereret fra en hel V-bundplade 10. Well-baserede aggregatdannelse har været anvendt i en række indstillinger, herunder differentiering af hPSCs at ektodermal 11, endodermal 12, mesodermale 13 og extraembryonic 14 skæbner; chondrogenese fra mesenchymstamceller 15; generation af ensartede substrater for toksikologisk screening 16; og undersøgelser af mechanobiology 17.
En stor udfordring i at udvikle robuste fremstilling protokoller til produktion af hPSC-afledte cardiomyocytes har været manglen på reproducerbarhed i hjertets differentiering effektivitet mellem kørsler. Vi har tidligere vist, at denne variation kan tilskrives heterogenitet i start hPSC befolkning, der omfatter både selvfornyende hPSCs og differentiere celler, der udtrykker gener forbundet med endoderm og neural differentiering 6,18. Signaler udskilt af disse differentierende celler påvirker hjerte- induktion. Specifikt extraembryonic endoderm fremmer kardial induktion, mens neurale progenitorer inhiberer kardial induktion. Ved hPSC sammenlægning, celler inden den samlede differentiere og organisere så udifferentierede hPSCs er omgivet af et lag af extraembryonic endoderm celler, der udvikler på den samlede overflade 13. Ved at kontrollere aggregat størrelse, kan vi modulere forholdet mellem hjerte--inducerende endoderm celler til udifferentierede hPSCs (overfladeareal til volumenforhold) og optimere dette forhold for maksimal kardial induktion 13.
Protocol
1. Fremstilling af Medium Komponenter
- Forbered Wash Medium. 100 ml DMEM / F12, tilsættes 1 ml 100x Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep), 1 ml 100x L-glutamin og 5 ml serum udskiftning.
- Forbered kemisk definerede Basal Cardiac Induktion Medium ifølge producentens anvisninger.
- Forbered følgende materiel reagenser til medier, der vil blive anvendt i denne protokol.
- L-Ascorbinsyre: Der fremstilles en stamopløsning af 5 mg pr ml i 4 ° C, sterilt ultrarent destilleret vand i en konisk rør.
- Efterlad denne opløsning på is og vortex røret periodisk indtil det opløste stof er fuldstændigt opløst. Filter-steriliser ascorbinsyreopløsningen anvendelse af et 0,22 um sprøjtefilter.
- Forbered 1 ml portioner af ascorbinsyreopløsning og gemme disse alikvoter ved -20 ° C. Brug en frisk optøet alikvot hver gang medium fremstilles.
- På dagen for medium præparatFortyndes 13 pi monothioglycerol (MTG) i 1 ml Basal Cardiac Induktion Medium. Kassér ubrugt, fortyndet MTG.
- Forbered 1 ml alikvoter af Transferrin (30 mg / ml) at opbevare ved -20 ° C. Store optøet portioner ved 4 ° C i op til 3 måneder.
- Forbered 4 mM saltsyre (HCI) indeholdende 0,1% bovint serumalbumin (BSA). I et stinkskab, tilsættes 30 pi 6,0 N HCI-opløsning til 50 ml ultrarent vand. Filter-sterilisere opløsningen under anvendelse af en 0,22 um sprøjtefilter. Tilsæt 2 ml 25% BSA-opløsning til 50 ml HCI-opløsning.
- Forbered phosphatbufrede saltvand (PBS) indeholdende 0,1% BSA. Tilsæt 20 pi 25% BSA-opløsning pr ml PBS.
- Forbered Humant knoglemorfogenetisk protein 4 (BMP-4) stamopløsning (10 ng / pl). Opløs 10 ug lyofiliseret BMP-4 i 1 ml 4 mM HCl-buffer indeholdende 0,1% BSA. Forbered 50 pi alikvoter at opbevare ved -20 ° C.
- Forbered Humant for fibroblastvækstfaktor 2 (bFGF) stamopløsning(10 ng / pl). Opløs 10 ug lyofiliseret bFGF i 1 ml phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 0,1% BSA. Forbered 50 pi alikvoter at opbevare ved -20 ° C.
- Forbered human vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) stamopløsning (5 ng / pl). Opløs 5 ug lyofiliseret VEGF i 1 ml PBS indeholdende 0,1% BSA. Forbered 50 pi alikvoter at opbevare ved -20 ° C.
- Forbered Activin En stamopløsning (10 ng / pl). Opløs 10 ug lyofiliseret Activin A i 1 ml PBS indeholdende 0,1% bovint serumalbumin (BSA). Forbered 50 pi alikvoter at opbevare ved -20 ° C.
- Forbered Inhibitor of Wnt Production-2 (IWP-2) stamopløsning (10 mM). Opløs 2 mg IWP-2 i 429 pi dimethylsulfoxid (DMSO). Forbered 10 ul alikvoter at opbevare ved -80 ° C.
- L-Ascorbinsyre: Der fremstilles en stamopløsning af 5 mg pr ml i 4 ° C, sterilt ultrarent destilleret vand i en konisk rør.
- Forbered Complete Cardiac Induktion Medium. Til 100 ml Basal Cardiac Induktion Medium, tilsættes 1 ml 100x Pen / Strep, 1 ml 100x L-glutamin, 500 pi transferrin, 1ml frisk optøet ascorbinsyre og 300 pi MTG. Kassér ubrugt medie.
2. Fremstilling af mikrobrøndsplade
BEMÆRK: skal udføres Alle trin i en biologisk sikkerhedsskab.
- Tilsæt 0,5 ml skylleopløsning (kit Component) til hver brønd, der skal bruges på pladen. For at sikre, at løsningen i kontakt med hele overfladen i hver mikrobrønd, centrifugeres pladen ved 840 xg i 2 min.
- Inkubér pladen i 30 til 60 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer skylleopløsningen fra brøndene. Vask hver brønd to gange som følger: Tilsæt 1 ml PBS i hver brønd, centrifugeres pladen ved 840 x g i 2 min, og derefter aspirér PBS.
3. Dannelse af hPSC aggregater i mikrobrøndsplade
BEMÆRK: skal udføres Alle trin i en biologisk sikkerhedsskab.
- Placer Wash Medium i et 37 ° C vandbad.
BEMÆRK: volumen kræves = 1 ml x antal brønde HPSC, der vil blive adskilt. - Opdel hPSCs til enkelte celler
BEMÆRK: Disse trin beskriver adskillelse af celler dyrket på 6 brønde - mængden reagens kan skaleres proportionalt til forskellige kultur-formater.- Aspirere dyrkningsmediet fra hver hPSC kultur godt for dissociation. Skyl hver brønd med 1 ml dissociation enzym, og derefter straks aspirér dissociation enzym fra hver brønd.
BEMÆRK: Residual dissociation enzym bør være tilstrækkelig til at dissociere cellerne. - Inkubér pladen ved 37 ° C i 3 minutter.
- Der tilsættes 1 ml vaskemedium til hver brønd og mekanisk dissociere cellerne fra vævskultur overflade ved pipettering vaskemediet med en P1000 mikropipette over vævskultur overflade. Hvis dissociation synes at være ufuldstændige og celleklumper forblive, passere suspensionen gennem en si på dette punkt.
- Overfør cellesuspensionen til et 15 ml konisk rør og opbevarerøret i inkubatoren, mens celletallet udføres i det næste trin.
- Udfør en celletælling:
- Tage en 10 pi prøve af cellesuspensionen indsamlet i det foregående trin. Tilsæt 30 pi trypanblåt og bland suspensionen godt ved pipettering.
- Overfør 10 pi Trypan Blue-farvede celler til hvert kammer i et hæmocytometer og visualisere under inverteret mikroskop med 10x objektiv. Tæl cellerne.
- Fra celletal resultater, beregne, hvor mange brønde kan podes ved 1,2 x 10 6 celler pr brønd i mikrobrøndsplade. Beregn Sammenlægning Medium forpligtet til frø cellerne ved 1 ml per brønd.
- Forbered sammenlægning medium. Pr 10 ml komplet Cardiac Induktion Medium, tilsættes 0,5 pi BMP4 stamopløsning (slutkoncentration = 0,5 ng / ml) og Y-27632 ROCK inhibitor (slutkoncentration = 10 uM).
- Fjern den koniske rør indeholdende de hPSCs fra inkubatoren og centrifuge røret ved 200 xg i 5 min. Aspirere vaskemediet og resuspender cellerne i aggregering medium ved en densitet på 1,2 x 10 6 celler pr.
- Aspirer PBS vaskeopløsningen fra hver brønd i mikrobrøndsplade. Ved hjælp af en P1000 mikropipette, fordeler og frø 1 ml af cellesuspensionen til hver brønd på mikrobrøndsplade. Til frø et stort antal brønde, periodisk vortex cellesuspensionen for at forhindre bundfældning.
- Centrifugeres pladen ved 200 x g i 5 min. Observere pladen under mikroskop for at bekræfte celler er spundet til bunden af hver mikrobrønd.
- Inkubér pladen i 24 timer ved 37 ° C i en 5% CO2, 5% O2 (hypoxisk) inkubator.
- Aspirere dyrkningsmediet fra hver hPSC kultur godt for dissociation. Skyl hver brønd med 1 ml dissociation enzym, og derefter straks aspirér dissociation enzym fra hver brønd.
4. Cardiac Induktion Stage 1
- En dag efter aggregering (dag 1), forberede det nødvendige volumen af fase 1 Induktion medium (for en 24-brønds plade, volumen = 1 ml x antal brønde). For 1 ml kompletcardiac induktion medium, tilsættes 1 ml af BMP4 stamopløsning (slutkoncentration = 10 ng / ml), 0,5 pi bFGF stamopløsning (endelig koncentration = 5 ng / ml) og 0,6 pi Activin A (slutkoncentration = 6 ng / ml). Placer medium i en 37 ° C vandbad i mindst 15 min.
- Fjern mikrobrøndsplade fra inkubatoren. Undersøg aggregater under lup. Sammenlignet med umiddelbart efter centrifuge aggregering, bør de vises intakt med glatte kanter (mere rund og mindre firkantet end den foregående dag).
- Fjern supernatanten uden at forstyrre aggregaterne inde mikrobrøndene:
- Hold mikrobrøndsplade vandret niveau (dvs.., Ikke vippe den). For hver brønd på mikrobrøndsplade, placere spidsen af en P1000 mikropipette på overfladen af dyrkningsmediet og mod kanten af brønden.
- Fjern langsomt mediet, sørg for ikke at forstyrre de aggregater i bunden af mikrobrøndene. Efter reduktion than medium niveau til ca. 1 til 2 mm fra den teksturerede mikrobrønd overflade, langsomt vippe pladen til at indsamle medium ved den ene side af brønden (når mængden er tilstrækkelig lav, er flydende bevægelse stærkt reduceret, og det er lettere at undgå aggregater blive løftet ud af deres individuelle mikrobrønde). Langsomt pipetteres ud den resterende medium i brønden.
- Sådan tilføjer frisk Trin 1 Induktion Medium samtidig sikre aggregaterne forbliver i deres individuelle mikrobrønde: Tegn 1 ml Trin 1 induktion medium med en P1000 mikropipette. Hold pipettespidsen mod den indvendige kant af brønden og meget langsomt dispensere mediet mod indersiden brøndens væg. Gentag for de resterende brønde.
- Returnere pladen til inkubatoren under hypoxiske betingelser i 3 dage.
5. Cardiac Induktion Stage 2
- På dag 4 sted vaskemedium (volumen = antal brønde x 2 ml) i et 37 ° C vandbad i mindst 15 min.
- Forberede det nødvendige volumen af fase 2 Induction Medium (volumen = antal brønde x 1 ml): Per ml komplet Cardiac Induktion Medium, tilsættes 2 pi VEGF stamopløsning (slutkoncentration = 10 ng / ml) og 0,5 pi IWP-2 stamopløsning (slutkoncentration = 5 uM). Placer forberedte etape 2 Induktion medium i et 37 ° C vandbad i mindst 15 min.
- Anvendelse af en 5 ml serologisk pipette høste aggregaterne fra hver brønd i mikrobrøndsplade og indsamle den samlede suspension i en 15 ml konisk rør (samle op til 10 brønde pr 15 ml rør).
- Lad aggregaterne til at nøjes med 15 min i en hypoxisk inkubator.
BEMÆRK: Dette trin er vigtigt at adskille enkelte celler og cellerester fra de intakte aggregater. - Aspirere supernatanten omhyggeligt og resuspender aggregater i 10 ml præ-opvarmet Wash Medium at fjerne resterende induktive cytokiner (f.eks Activin A er en potent signalmolekyle selv ved meget lave concentrations).
- Centrifuger aggregaterne ved 50 xg i 2 min. Aspirere supernatanten. Resuspender de pelleterede aggregater i forvarmet Induktion 2 Medium.
- Overfør aggregatsuspension til en 24-brønds ultralav binding (ULA) plade ved 1 ml per brønd. Overhold aggregater under mikroskopet så ensartet, stramme celleklynger. Inkuber under hypoxiske betingelser indtil dag 6.
6. Cardiac Induktion Stage 3
- På dag 6 forberede det nødvendige volumen af Stage 3 Induktion Medium (volumen = antal brønde x 1 ml). For 1 ml komplet Cardiac Induktion Medium, tilsættes 2 pi VEGF stamopløsning (slutkoncentration = 10 ng / ml), og 0,5 pi bFGF stamopløsning (endelig koncentration = 5 ng / ml). Placer forberedt Stage 3 induktion medium i et 37 ° C vandbad i mindst 15 min.
- Brug en 5 ml serologisk pipette til at overføre aggregaterne til 15 ml koniske rør, pooling op til 10 ml aggregats pr rør.
- Tillad 10 min for aggregaterne at bosætte. Aspirere supernatanten og resuspender aggregaterne i det foropvarmede Stage 3 Induktion Medium. Anvendelse af en 5 ml serologisk pipette omfordele aggregaterne i en 24-brønds ULA plade ved 1 ml per brønd.
- På dag 10, forberede det nødvendige volumen af Stage 3 Induktion Medium (volumen = antal brønde x 1 ml) som pr Trin 6.1.
- Brug en 5 ml serologisk pipette til at overføre aggregaterne til 15 ml koniske rør, pooling op til 10 ml aggregater pr rør.
- Tillad 10 min for aggregaterne at bosætte. Aspirere supernatanten og resuspender aggregaterne i fase 3 Induktion Medium. Anvendelse af en 5 ml serologisk pipette omfordele aggregaterne i en 24-brønds ULA plade ved 1 ml per brønd.
- Inkuber under hypoxiske betingelser i to dage. På dag 12, begynde at inkubere cellerne ved normoksiske oxygenniveauer i resten af dyrkningsperioden (37 ° C, 20% O2, 5% CO2).
NOTE:Efter dette tidspunkt, cellerne ikke længere dyrkes under hypoxiske betingelser. - Gentag denne komplette medium udveksling (trin 6.2 og 6.3) hver 4 dage, begyndende dag 14 indtil celle høst (typisk, er peak cardiomyocyte koncentrationer observeret efter dag 14 i differentiering).
7. flowcytometri Analyse af kardiel troponin T (cTnT) Expression Hyppigheden af Microwell Culture Output
- Dissociér aggregaterne som følger:
- Brug en 5 ml serologisk pipette til at overføre en brønd af aggregater til en 15 ml konisk rør. Centrifuger aggregater ved 50 x g i 2 min og omhyggeligt aspirere supernatanten.
- Der tilsættes 1 ml frisk opløst 1 mg / ml collagenase type II løsning på aggregaterne. Overfør aggregatsuspension til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Inkubér aggregaterne i Collagenase type II natten over ved stuetemperatur.
- Den følgende dag, så brug en P1000 mikropipette til forsigtigt adskille aggregaternetil en homogen enkelt cellesuspension. Hvis aggregaterne ikke let dissocierer, afregne aggregaterne, aspireres supernatanten, og der inkuberes aggregaterne i 700 pi Dissociation enzym til 1 til 2 minutter ved stuetemperatur. Pipettér forsigtigt aggregaterne 1 til 2 gange med en P1000 mikropipette til at dissociere.
- Fortynd dissociation enzym: Tilføj 700 pi vaskemedium indeholdende 14 pi 1 mg / ml DNAse stamopløsning. Tage en 10 pi prøve at udføre en celletælling, og centrifugeres den resterende suspension under anvendelse af en bench-top mikrocentrifuge ved 300 xg i 2 min.
- Udfør en celletælling: Farv prøven 10 pi tælling med et tilsvarende volumen trypanblåt og tælle anvendelse af et hæmocytometer.
- Fjern 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende de resterende celler fra mikrocentrifuge. Aspirere supernatanten og resuspender cellerne, i en koncentration på 200.000 til 500.000 celler pr 100 pi, i Hanks balancerede saltopløsning indeholdende2% kalvefosterserum (HF).
- For hver betingelse, overføre 100 pi cellesuspension pr brønd til 2 brønde på en plade med 96 brønde (en brønd vil blive farvet med cTnT antistof og den anden vil være det sekundære antistof-kontrol).
- Centrifugeres pladen ved 300 x g i 2 min. Fjern supernatanten med en multikanalpipette.
- Fikseres cellerne: Tilsæt 200 pi fikseringsopløsning (kit komponent) pr brønd og inkuberes pladen i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Centrifugeres pladen ved 300 x g i 2 min. Brug en multikanalpipette til omhyggeligt trække supernatanten fra brøndene. Bortskaffe supernatanten i en beholder paraformaldehyd affald.
- Vask de fikserede celler to gange: Tilsæt 200 pi af HF til hver brønd. Centrifugeres pladen ved 300 x g i 2 min. Aspirer supernatanten og gentag vasketrinnet gang mere. Fikserede celler kan opbevares i op til en uge i HF ved 4 ° C.
- Permeabilisere cellerne:
- Centrifugeres pladen ved 300xg i 2 min.
- Tilsæt 100 pi Permeabilisering Solution (kit komponent) til hver brønd og inkuberes pladen ved stuetemperatur i 5 min.
- Centrifugeres pladen ved 300 x g i 2 min og aspirere supernatanten.
- Forbered en master mix af anti-cTnT i HF ved den optimale koncentration for det givne lotnummer (Den optimale fortynding skal bestemmes ved titrering og typisk i området fra 1: 500 til 1: 2000).
- For hver betingelse (2 brønde pr betingelse), tilsættes 100 pi masterblandingen til en brønd (farvede prøve) og 100 pi almindeligt HF til den anden brønd (sekundært antistof kontrol). Inkuber cellerne ved 4 ° C i 30 minutter.
- Centrifugeres cellerne ved 300 x g i 2 min. Aspirere supernatanten, og der tilsættes 200 pi HF per brønd. Gentag dette vasketrin en gang til.
- Forbered en master mix af det sekundære antistof. Overfør en mængde af HF, der svarer til 100 pi til hver brønd (sekundært antistof kontrol ogcTnT-farvet), der behandles. Tilsæt 1 pi gede-anti-muse-APC sekundært antistof pr 200 pi HF (1: 200 fortynding).
- Farv prøverne. Tilsæt 100 pi farvning opløsning til hver brønd (både det sekundære antistof-kontrol og anti-cTnT-farvede brønde). Cellerne inkuberes i mørke ved 4 ° C i 30 minutter (holde pladen belagt eller i mørke efter tilsætning fluorescerende sekundære antistof for at undgå fotoblegning).
- Centrifugeres cellerne ved 300 x g i 2 min. Aspirere supernatanten, og der tilsættes 200 pi HF per brønd. Gentag dette vasketrin en gang til.
- Overfør prøverne til 5 ml rundbundet flowcytometer analyse rør og udfør flowcytometri for signal i APC-kanal med standardprotokoller for instrumentet 19.
Representative Results
Størrelse-kontrollerede aggregater af hPSCs kan effektivt dannes under anvendelse af mikrobrønd-systemet, kun afhænger af koncentrationen af celler og mikrobrønd overfladeareal. Efter en kort centrifugering, er det relevante antal celler (1.000 i denne protokol) samlet i hver mikrobrond (figur 1A). Vigtigt er det, disse celler genetablere intracellulære forbindelser inden 24 timer, og bør ikke længere fylde godt, men vises som kompakte aggregater med glatte kanter (Figur 1B). Disse aggregater giver udgangsmaterialerne til yderligere differentiering mod en kardiel skæbne. Hvis cellerne ikke danne tætte klynger, tyder dette muligt celledød efter dissociation og reaggregation, og egnethed enkelt celle overførselsteknikker og ROCK inhibitorkoncentrationer for en bestemt cellelinje skal undersøges. De følgende tre dage i mikrobrønde viser ringe ændring i samlet morphology, selv om en vis vækst er indlysende. Udtages fra mikrobrøndene, bør aggregater opretholde deres runde, tæt pakket morfologi og være af samme størrelse til hinanden (figur 1C). Kultur i ULA 24-brønds plader bliver grundlag for nye celle ekspansion og vækst.
Ved dag 8, efter eksponering først til activin signalering, og Wnt hæmning, vil aggregaterne begynder at fremstå som større og lysere aggregater (Figur 1D). I denne periode vil en betydelig cellerester være indlysende i bunden af hver brønd og skal fjernes ved at lade aggregater at bosætte før du fjerner medier. Lejlighedsvis, vil mange aggregater smelter sammen. Dette vil ikke inhibere differentieringen af andre aggregater i brønden, selv om disse "super aggregater" tendens til ikke at udvise de morfologiske ændringer, der ses med mindre aggregater og er mindre tilbøjelige til at undergå fuldstændig differentiering.
"Jove_content" fo: holde-together.within-page = "1"> Fortsat differentiering påfører bemærkelsesværdige morfologiske ændringer af aggregater med en forøget størrelse og udseende af organiserede fibrøse regioner. Ved dag 12, kan de ordregivende aggregater iagttages. Disse vil altid bestå af store gennemsigtige celler og ofte er indgående ekstracellulære matrix uden for aggregatet (figur 2). Mens samlede hele sammentrækninger indikerer en succesfuld differentiering, kan hjerte-markør udtryk også observeres i aggregater, der ikke synes at trække sig sammen. Efter dissociation af aggregater og immunolabeling, vil et flertal af celler være positiv for cardiomyocyte markør cTnT ved flowcytometri (figur 3). Ekspressionen af denne markør er stabilt i cellerne og kan observeres i aggregater så sent som dag 19 af differentiering.
1.jpg "/>
Figur 1: Tidslinje for hPSC differentieret mod en hjerte skæbne Umiddelbart efter sammenlægning, celler næsten fylde hver mikrobrond (A).. En dag senere, synes aggregaterne kondenseret og glat (B). Denne morfologi fortsætter selv når aggregaterne fjernes fra mikrobrøndene og udpladet i brønde (C). Ved dag 8, aggregater begynder at udvide og synes lysere i farven (D). Målestok:. 250 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Materialeliste Begynd kontraherende ved Dag 12 af Differentiering Efter seks dage i Cardiac Induktion Trin 3 Medium blev kraftige aggregerede hele sammentrækninger observeret (øverste panel:. Slappeation, midterste panel: sammentrækning). Den nederste panel er afledt af at trække den øverste og midterste paneler, med de fleste signifikante forskelle optræder som sorte eller hvide (pilespidser). Målestok:. 250 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Immunmærkning for kardiel troponin T i differentierede hPSCs På dag 17, de fleste af cellerne er positive for kardiel troponin T ved flowcytometri (fyldt histogram). Også vist er celler farvet med sekundært antistof alene (uden fyld histogram). Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Det er blevet observeret, at en effektiv hjertefunktion differentiering af pluripotente stamceller er en meget variabel proces. Mens det ikke er overraskende, at forskellige cellelinier udviser varierende tilbøjeligheder til differentiering kapacitet til specifikke celletyper, er det blevet observeret, at hjertedifferentiering effektivitet svinger dramatisk mellem replikat testkørsler med den samme cellelinje 6. Protokollen beskrevet her omhandler en væsentlig kilde til denne variation ved direkte styring af input celle antal pr aggregat. For yderligere at reducere variabiliteten mellem kørsler, anbefales det, at hPSC strækninger udbygget til enkelt celle passage anvendes, da denne form for hPSC udbygning og vedligeholdelse resulterer i mere konsistente pluripotente populationer med hensyn til ekspressionsfrekvenser af pluripotens markører (f.eks Oct4, Nanog, Tra-1-60, osv.).
Protokollen som skrevet her angiver en samlet størrelse på 1000 celler for optimal kardial induktion fra HES-2 embryonale stamceller linje. For at anvende denne protokol til forskellige cellelinjer, er det afgørende, at en indledende screening aggregat størrelse udføres for at bestemme cellelinje-specifikke optimale samlede størrelse. Selv om det ikke direkte indflydelse de procedurer, der skal følges her, vi minde læseren om, at ændringer i den samlede størrelse og samlede celletæthed forventes at påvirke ilt levering. Dette kan blive en relevant overvejelse i efterfølgende anvendelser. Derudover apoptotisk celledød er en bekymring under dissociation af hPSCs til enkelte celler. Derfor er det afgørende at sikre, at ROCK inhibitor er til stede under tvungen celleaggregering i mikrobrøndene. Endelig er det afgørende, at på dag 4 af differentiering aggregaterne er godt vasket for at fjerne spor Activin A, til stede i induktionen 1 Medium, før resuspension i Induction 2 Medium. Efter dag 4 af differentiering, Activin A fremmer endoderm differentiering på bekostning af mesoderm induktion 20.
Den vigtigste anvendelse af denne teknik er at screene aggregatstørrelser der fremmer effektiv hjertedifferentiering. Men en af begrænsningerne ved det nuværende teknik er, at det er udfordrende at skalere hjerte- produktion til klinisk relevante niveauer ved hjælp mikrobrøndsplader. Opskalering af hjertedifferentiering udføres typisk i løs dyrkningsbetingelser i omrørt suspension bioreaktorer 21. Derfor, når det mikrobrønd system er blevet anvendt til at bestemme acceptable intervaller af aggregatstørrelse for effektiv hjertefunktion induktion, det næste skridt at opskalere er at bestemme bioreaktor rotorhastigheder, der kan generere den ønskede celleaggregatstørrelse.
En af de signifikante forskelle i denne teknik med hensyn til andre fremgangsmåder til aggregat-baserede hjertedifferentiering er, at den muliggør direkte undersøgelser modulering af virkningerne af endogen signalering i aggregater samtco-dyrkning af induktive / inhibitoriske vævstyper med hPSCs i aggregatet 13. Disse typer af undersøgelser kan informere procesudvikling af stor skala hjerte-produktion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet | |||
| Pipette aid | |||
| Serological pipettes (5 to 25 ml) | |||
| Aspirator | |||
| Aspirator or Pasteur pipettes | |||
| 15 and 50 ml conical tubes | |||
| Fume hood | |||
| 0.22 µm syringe filter | |||
| 5% CO2, 5% O2, and humidity controlled cell culture incubator | Hypoxic (low oxygen) incubator | ||
| 5% CO2, 20% O2, and humidity controlled cell culture incubator | |||
| Low speed centrifuge with a swinging bucket rotor fitted with a plate holder | |||
| P2, P20, P200, and P1000 micropipettors and associated tips | |||
| Inverted microscope with 4X, 10X and 20X phase objectives | |||
| Ultra-Low Attachment (ULA) 24 well plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Bench-top microcentrifuge | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Sterile Ultrapure distilled water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Vortex | |||
| Ice | |||
| -20 °C freezer | |||
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic; Aliquoting of MTG is strongly recommended to minimize oxidation due to repeated opening. Aliquots can be stored at 4 °C for up to 3 months, -20 °C is recommended for long-term storage. |
| StemPro-34 Medium | Thermo Fisher Scientific | 10639-011 | Basal Cardiac Induction Medium; The supplement is stored at -20 °C and the basal medium at 4 °C. |
| Transferrin | Roche | 10652202001 | |
| BMP-4 | R&D Technologies | 314-BP | |
| bFGF | R&D Technologies | 233-FB | |
| VEGF | R&D Technologies | 293-VE | |
| Activin A | R&D Technologies | 338-AC | |
| IWP-2 | Reagents Direct | 57-G89 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | 15561 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | Corrosive |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| 100x L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| TrypLE Select | Thermo Fisher Scientific | 12563 | Dissociation enzyme |
| Hemocytometer | |||
| Trypan Blue | |||
| Aggrewell 400 plates | StemCell Technologies | 27845 | Microwell Plates |
| Aggrewell Rinsing Solution | StemCell Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Tocris | 1254 | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483 | |
| 96 well plate (for FACS staining) | |||
| Intraprep Permeabilization Reagent | Beckman Coulter | IM2389 | Kit with 2 parts: Fixation Solution and Permeabilization Solution; Toxic |
| cTnT antibody | Neomarkers | MS-295 | |
| goat anti-mouse-IgG APC antibodyThermoFisher | Molecular Probes | A865 | |
| 5 ml round bottom flow cytometry tubes | FACS machine dependent |
References
- Wintermantel, E., et al. Tissue engineering scaffolds using superstructures. Biomaterials. 17, 83-91 (1996).
- Lazar, A., et al. Formation of porcine hepatocyte spheroids for use in a bioartificial liver. Cell Transplant. 4, 259-268 (1995).
- Sachlos, E., Auguste, D. T. Embryoid body morphology influences diffusive transport of inductive biochemicals: a strategy for stem cell differentiation. Biomaterials. 29, 4471-4480 (2008).
- Johnstone, B., Hering, T. M., Caplan, A. I., Goldberg, V. M., Yoo, J. U. In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Exp. Cell Res. 238, 265-272 (1998).
- Steinberg, M. S. Does differential adhesion govern self-assembly processes in histogenesis? Equilibrium configurations and the emergence of a hierarchy among populations of embryonic cells. J. Exp. Zool. 173, 395-433 (1970).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells Dayt. Ohio. 26, 2300-2310 (2008).
- Koike, M., Kurosawa, H., Amano, Y. A Round-bottom 96-well Polystyrene Plate Coated with 2-methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine as an Effective Tool for Embryoid Body Formation. Cytotechnology. 47, 3-10 (2005).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, 1601-1603 (2005).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells Dayt. Ohio. 25, 929-938 (2007).
- Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PloS One. 3, e1565 (2008).
- Kozhich, O. A., Hamilton, R. S., Mallon, B. S. Standardized generation and differentiation of neural precursor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 9, 531-536 (2013).
- Ungrin, M. D., et al. Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics. Biotechnol. Bioeng. 109, 853-866 (2012).
- Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 17, 1901-1909 (2011).
- Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reprod. Camb. Engl. 140, 3-9 (2010).
- Markway, B. D., et al. Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures. Cell Transplant. 19, 29-42 (2010).
- Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell. Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. 127, 403-411 (2012).
- Wallace, L., Reichelt, J. Using 3D culture to investigate the role of mechanical signaling in keratinocyte stem cells. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 989, 153-164 (2013).
- Ungrin, M., O'Connor, M., Eaves, C., Zandstra, P. W. Phenotypic analysis of human embryonic stem cells. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. , (2007).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. JoVE. , e52010 (2014).
- Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFβ family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Dev. Camb. Engl. 138, 861-871 (2011).
- Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol. Bioeng. 102, 493-507 (2009).
