Summary
脂肪由来幹細胞 (Asc) は簡単に隔離され、正常ラットの脂肪から採取しました。ASC のシーツは、細胞シート工学を使用して作成することができます、ザッカー出展全層脂肪の糖尿病のラット皮膚の露出した骨の欠陥と人工皮膚の層で覆われてに移植することができます。
Abstract
人工皮膚は、臨床実習でかなり治療成績を成し遂げた。ただし、妨げられる血流や大きな傷、糖尿病患者の傷のため人工皮膚の治療が長引く可能性も。細胞ベースの治療は糖尿病性の潰瘍の治療のための新しい手法として登場している、細胞シート工学は、細胞移植の有効性を改善しました。レポートの数は、脂肪由来幹細胞 (Asc)、間葉系間質細胞 (MSC) の種類は、脂肪組織と他の組織から MSCs と比較されたときコレクションのユーザー補助機能の相対的な豊かさのための治療の可能性を示すことを示唆しています。したがって、Asc は、幹細胞治療上の使用のための良いソースに表示されます。本研究では通常の Lewis ラットの副睾丸脂肪脂肪から ASC シートが作成されましたとアスコルビン酸を含む通常の培養液に温度応答性培養皿を用いたします。ASC シート Zucker 糖尿病性脂肪酸 (ZDF) ラットに移植、2 型糖尿病の減少を示す肥満モデルラット創傷治癒します。傷は後部の頭蓋表面上に作成された、ASC シートが傷に移植した膜人工皮膚シートをカバーするため使用されました。ASC シートを受け取った ZDF ラット ASC シートの移植なし ZDF ラットよりも癒しの傷があった良い。このアプローチは、ASC シート湿潤環境の維持を必要とする、乾燥した条件に敏感であるために限られていた。したがって、人工皮膚は、乾燥を防ぐために ASC シートをカバーしていました。人工皮膚との組み合わせで ASC シートの同種移植も他の難治性潰瘍や火傷、末梢動脈疾患と膠原病、観察などに適用して栄養不足ですか、ステロイドを使用している患者に投与されることがあります。したがって、この治療は糖尿病創傷治癒の治療方法の改善への第一歩かもしれません。
Introduction
糖尿病患者の人口は世界的に増加しており 4 億 2015年1;糖尿病患者の約 15-25% は、下肢糖尿病性潰瘍2の進行からのリスクです。下肢糖尿病性潰瘍は難治性で、完全な回復後のリハビリ訓練の長期治療を必要とする可能性があります。頻繁に長い治療期間は、患者の生活の質の大幅な削減の結果します。したがって、糖尿病の傷の治療のために減らすか、悪化を防ぐ新たな治療法が開発されなければなりません。糖尿病創傷治癒過程を評価するため我々 は、糖尿病性潰瘍創傷治癒モデル ラットでは, 実用的な臨床的条件を模倣する、最適化し、創傷治癒促進細胞シート工学を用いた脂肪由来幹細胞 (ASC) シートを移植かどうか評価します。
間葉系間質細胞 (MSCs) は、様々 な細胞の血統3に分化する能力を彼らの免疫調節効果、自己再生能力のための創傷治癒を促進するための優れたポテンシャルを展示します。MSCs パラクリン活動4、5潜在的な血管新生を含む他のティッシュから得られる利点を展示して Asc が脂肪組織由来 MSC の一種。脂肪組織は人間の体内では、比較的豊富なでき、アクセシビリティ、低侵襲の手順を使用して、コレクションです。したがって、Asc は創傷治癒のアプリケーション6、7の実験に使用されています。
以前のレポートは、傷の周りの地域に単一細胞 MSC 懸濁液の直接注入が創傷治癒8,9を加速することが示されています。ただし、単一細胞懸濁液を注入糖尿病性潰瘍モデルにおける創傷治癒の加速のレポート、にもかかわらず、創傷部位に移植細胞の生存時間は明確ではないです。
本研究では、温度応答性培養皿を用いた細胞シート工学を適用されます。これらの料理はある温度応答性高分子Nイソプロピルアクリルアミド彼らの表面の10に共有結合です。グラフト高分子層温度制御細胞接着や培養皿の表面から剥離が可能です。皿の表面は 37 ° c、それは 32 ° C 以下の温度では親水性になったとき、細胞が自発的に表面から切り離すに対し、細胞が接着し、増殖を許可する疎水性になります。の温度を減らすことによって単にそのまま細胞間結合と細胞外マトリックス (Ecm) の連続した細胞シートとして培養細胞を収穫できます。したがって、損傷、トリプシンなどの ECM 蛋白質分解酵素は必要な11ではありません。したがって、細胞シート工学は、細胞間の接続を維持でき、細胞移植の有効性を改善することができます。
さらに、細胞シート移植細胞注入12と比較した場合の細胞生存率が増加します。このプロトコル Zucker 糖尿病脂肪 (ZDF) ラットは、創治癒遅延と 2 型糖尿病や肥満モデルとして選ばれました。ZDF ラットは、自発的に約 4 週間で肥満を開発します。彼らは、8、12 週齢、その時点で発揮する高血糖インスリン抵抗性、脂質異常症、高トリグリセリド血症13に関連付けられている間肥満と 2 型糖尿病を開発します。創傷治癒、血流の低下、末梢血管、糖尿病性腎症14,,1516観察も。また、ZDF ラット糖尿病性潰瘍などの難治性皮膚潰瘍の治癒過程を研究するための適切なモデルがあります。
人間および齧歯動物の創傷治癒のメカニズムの違いは、皮膚の解剖学的差異に関連付けられます。正常ラットの創傷治癒は、再上皮化および肉芽組織の形成に基づいて人間の創傷治癒過程に対し創収縮に基づいています。通常、傷副木齧歯動物モデルで使用される創収縮を最小限に抑え、肉芽組織17、漸進的な形成を可能が非糖尿病ラットで傷はほぼ完全に収縮によって閉じられます。ただし、糖尿病創傷収縮 ZDF ラットは障害者と創傷治癒の主が再上皮化および肉芽組織形成を介して行われますしたがって、このプロセスより人間の創傷治癒の14に似ています。
糖尿病性創傷デブリドマンが臨床的によく遭遇後露出した骨付き。無胸腺ヌードマウス18,19の背中に直径 12 mm 全厚皮傷や正常マウス20の背中に直径 10 mm 全厚皮の傷、前が調査されました。重度の糖尿病の傷のための臨床モデルを開発するには、より大きい (15 × 10 mm2) 全層皮膚欠陥は骨を露出し、骨膜なしとして作成された、2 型糖尿病と肥満ラットで、前に説明した21。
通常の Lewis ラットの Asc からラット ASC (rASC) シートは、ASC シートの同種移植によって作成されました。臨床実習、潰瘍糖尿病患者は多くの場合、制御不能な高血糖と高体重指数、これら合併症原因創傷治癒障害これらの患者からの脂肪組織の取得の難易度を高めるなど、重度の糖尿病合併症を示すために、自家移植が可能。さらに、糖尿病を展示動物から Asc プロパティを変更、関数22障害者します。したがって、ここで示されるプロトコルは、正常ラットから rASC シートの同種移植と人工皮膚の糖尿病ラットへの応用について説明します。
このプロトコルで使われる膜人工皮膚の傷の自発収縮を防ぐことができます、新しい結合組織のマトリックスの合成を促進して true 真皮23を似ています。このプロトコルでは、人工皮膚は rASC シート上に配置、創収縮または緩いラット皮膚から結果の拡大を防ぐために糸で固定します。さらに、人工皮膚が移植された ASC シートや傷の湿潤環境を維持、感染や外部の力から傷を保護に ASC シート三次元フレームワークを提供します。最後に、非粘着ドレッシングは、外的な影響から保護、湿潤環境の維持、滲出液を吸収する創傷で配置されます。
RASC シートは薄い、柔軟性、および変形を暴行心24など、受信者のサイトに移動に付着することができます。細胞シート工学は様々 な組織の再建のために使用されているし、治療効果25,26.を生成することができます。臨床治療の可能性を示す ASC シートは、多くのタイプの傷の治癒を促進可能性があります。さらに、ASC シート、人工皮膚の使用と組み合わせるの同種移植は難治性の潰瘍や末梢動脈疾患や膠原病にみられるなど、火傷の治療に適用されるかもしれないまたは彼らは栄養不足ですか、ステロイドを使用している患者に投与されることがあります。このアプローチには、Asc を移植の効率が上がります。ZDF ラットの創傷治癒モデル人間の創傷治癒過程に似ており、小型の実験動物の臨床条件を模倣する重度の巻き具合が生成されます。
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Representative Results
このプロトコルでは、セルベースの難治性の糖尿病性創傷の治療法を確立しようとしています。(図 1に示す) として簡潔に同種 rASC のシーツは細胞シート工学を用いた正常ラットから作成された、糖尿病ラットの重層全層皮膚欠損創に人工皮膚を使用してそれから移植します。RASC シート (図 2 a) の良い例と悪い例 rASC シート (図 2 b) の光学顕微鏡の画像は図 2のとおりです。Asc は、新しい培養皿にメッキが、料理は、ゆっくりと前後に揺り動かしたと左と右制服 rASC シードと均一に厚 rASC シート (図 2 a) を実現するインキュベーターでする必要があります。RASCs を均一に接続および培養皿の表面に培養できない、シートを連続する ASC シート (図 2 b) として収集できません。図 3は、Asc が皿の表面に均一に付したので、室温で連続した細胞シートとして収穫されている ASC シートを示しています。通常、鉗子のペアを持つ rASC シートを処理できます。必要に応じて、転送の膜は、細胞シートを培養皿から傷のサイトに転送する使用ことができます、場合など細胞シートがもろく、壊れやすい。
図 4は、ZDF ラット糖尿病創傷治癒モデルと人工皮膚併用同種 rASC シートの移植として使用を示しています。RASC シートは、サイズ調整可能な柔軟なソフトと鉗子 (図 4 A-F) のペアで傷のサイトの隅々 まで拡張されることができます。RASC シートで覆われた欠陥も人工皮膚 (15 × 10 mm2) で覆われているし、5-0 ナイロン縫合糸 (図 4) を使用して約 10 針縫合します。湿潤環境の維持、傷を保護するために、分泌物が吸収されたと非粘着ドレッシング (20 × 15 mm2) 人工皮膚上に置かれた、5-0 ナイロン縫合糸が適用された (図 4I)。非粘着ドレッシングは、アプリケーションのいくつかの日以内 ZDF ラットによって頻繁に削除されます。したがって、移植後ラットを監視する必要があります。通常、非粘着ドレッシングは、全身麻酔下で 2 日ごとに置き換えられます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5のマクロの写真は、rASC シートの移植の代表の結果です。以前の研究では、rASC シート移植グループ (図 5 b) の平均傷分野だった制御グループ (図 5 a) よりも大幅に小さかった。コントロールの rASC シートの移植せず、傷口をカバーする人工皮膚のみを使いました。これらの画像は傷の作成後 14 日目撮影された (n = 各グループ 6)31。
図 1: 実験的移植手順の概略図。同種ラット脂肪由来幹細胞 (rASC) シートと 2 型糖尿病と肥満のラット創傷治癒モデルにおける人工皮膚移植実験手順の概略図が実行されます。(A) ラット脂肪組織は通常のルイス ・ ラットから外科的切除します。rASCs が分離し 60 cm2培養皿上にシード ・ 7 8 日間 5% CO2インキュベーターで 37 ° C で培養します。(B) rASCs が 2-3 日毎に継代し、通路 3 rASCs 35 mm 径の温度応答性培養皿上に播種します。セルは、7-8 日の 37 ° c 5% CO2インキュベーターで 16.4 μ g/mL L-アスコルビン酸リン酸マグネシウム塩 n 水和物 (AA) を含む完全培地で培養しました。RASCs は 20 ° C に温度を減らすことによって連続した rASC シートとして収穫されました。(C) rASC シート露出骨が糖尿病と肥満 (Zucker 糖尿病脂肪 (ZDF) ラット) 創傷治癒モデルとして使用されるラットの頭の上に 15 × 10 mm2全層皮膚欠損創に移植します。(D) rASC シートは欠陥の上に直接頭蓋骨に置かれ、覆われて) 10 x 15 mm2枚に縫合した二分子膜人工皮膚の場所 10 ナイロン縫合糸 (5-0)。糖尿病 2015年; 64: 2723-2734;許可を得ています。糖尿病 (c) 著作権 (2015 年) のアメリカの糖尿病連合によって。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:Asc の顕微鏡画像を光します。Asc 間ギャップの無い、培養皿の端に ASC の増殖の光学顕微鏡画像。(A)、rASC 養殖 (A) の開始後 7 日間すべての方向で均一な厚みを持つシートです。(B) 制服をシードせず rASC シート。養殖 (B) の開始後 7 日連続 rASC シートを取得できません。スケール バー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:RASC 常温シート像の低速度撮影画像。常温 rASC シートの状態のコマ撮り画像。rASCs 35 mm 直径温度応答性培養皿に自発的に、徐々 に室温 (約 20 ° C) で料理の表面を切り離すし、連続したシートとして収穫されました。(A) 室温に温度応答性培養皿を移動した後約 5 分。(B) 約 10 分室温に 35 mm 径の温度応答性培養皿を移動した後。(C) 約 20-30 分室温に温度応答性培養皿を移動した後。良い品質 rASC シート (C) です。RASC シートの状態を (D E) 約 20-30 分室温に温度応答性培養皿を移動した後。この rASC シートは、平均的な質 (D) のことです。(F G) rASC シートは通常、鉗子のペアで処理されます。細胞シートはもろく、壊れやすい、培養皿から細胞シートを傷のサイトに転送するため、膜が足場として使用できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 傷創造の時系列画像と rASC 人工皮膚と非粘着性ドレッシング シート移植
人工皮膚と非粘着ドレッシング創傷の作成と rASC シート移植の時系列画像。ZDF の頭 (A) ラットは電気カミソリで剃毛されました。体の毛を剃り後、チェック マーク (15 × 10 mm2) は油性の疎水性ペンを使って描かれていました。(B) A の全層皮膚欠損 (15 × 10 mm2) は、骨膜に表皮から皮膚組織を除去することによって麻酔の ZDF ラットの頭に作成されました。皮膚や皮膚組織、メス切除し、骨膜は、骨膜で削除された raspatory。滅菌生理食塩水で湿らせたガーゼを使用すると、圧力は、切除後の出血を止めるに適用されました。(C) rASC シート移植。RASC シートは、ピンセットのペアを使用してラットの頭蓋骨のすぐ上の欠陥の上に置かれました。(D G)傷のサイズに合わせて調整 rASC シート拡張子。RASC シートは、柔軟な調節可能なとピンセットのペアを使用して傷のサイトの隅々 まで拡張することができます。広い傷の 2 つまたは 3 つの柔軟な rASC シートを積み重ねることができます。(H) rASC シートを覆う人工皮膚を縫合します。欠陥と移植された rASC シートは、5-0 ナイロン縫合糸を使用して 10 針縫合した人工皮膚 (15 × 10 mm2) で覆われていた。(私) 非-接着剤のドレッシング (20 × 15 mm2) 傷のサイトに結紮鑷子は、人工皮膚で覆われて。傷を保護するために、非粘着ドレッシング (20 × 15 mm2) 5-0 ナイロン縫合糸、人工皮膚の上に置かれました。糖尿病 2015年; 64: 2723-2734;許可を得ています。糖尿病 (c) 著作権 (2015 年) のアメリカの糖尿病連合によって。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 肉眼像全層皮膚欠陥。全層皮膚の肉眼写真欠陥 rASC シート (A) と (B) rASC シートの移植移植なしの傷の作成後 14 日。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
RASC シートを正常に培養するための最も重要な手順は次のとおりです: 1) 温度は、温度応答性培養皿上での培養中におよそ 37 ° C に保たれなければなりません。RASC シートの作成時にすべてのプロシージャを 37 ° C の熱板に行ったし、すべての試薬は自発的に料理31から切り離す細胞を防ぐために 37 ° C に加温しました。2) 受信者 ZDF ラットを監視すると、rASC シートの巧妙な移植のために重大である非粘着ドレッシングの削除を禁止する必要があります。ドレッシングを削除した場合、新しい非粘着ドレッシングは傷のサイトから切り離す移植 ASC シートを防ぐために適用する必要があります。
この手順を使用して、rASC シート一般に得られた通路をシードの 5-7 日以内温度応答性培養皿上の 3 のセル。RASC シートを生成するために必要な培養時間は、最初の細胞密度や AA を含む完全な培養液を適用する時間に応じて調整できます。RASC シート細胞培養中に皿から切り離すと、rASC シートをリメイクする必要があります、細胞の剥離が発生した場合追加料理を準備する必要があります。
このプロトコルの制限は次のとおりです: 1) 温度応答性培養皿を使用する場合は、全体のプロセス中に 37 ° C のおおよその温度を維持するために厳密な温度管理を適用する必要があります。2) rASC シートを取得後 rASC シートは乾燥した条件に敏感なので湿潤状態を維持するために特別な医療機器を使用する必要があります。受信者のラットの状態を毎日観察を含む 3) 術後の管理が必要です。
露出した骨に大きな傷は、臨床的に多く観察されます。たとえば、交通事故外傷、火傷、感染した傷、デブリードマン後破損または壊死性の傷は、露出した骨に大きな傷に開発できます。ここでは、深刻な傷の臨床モデルは、大規模な全層皮膚欠損を用いた 2 型糖尿病と肥満ラットにおける露出骨を開発しました。このモデルには、糖尿病ラットの創傷治癒過程を評価するための標準的なモデルとして使用される可能性があります。
人工皮膚デブリードマン後, 全層皮膚欠損用市販医療機器、遺伝子組換え塩基性繊維芽細胞成長因子 (bFGF) は血管新生、肉芽形成を促進するために創傷治癒のため広く使用されています。これらの 2 つの治療法は、慢性の傷、糖尿病傷などもかなりの治療結果を達成するために使用されています。それは、Asc が angiogeneic 成長因子28, 血管新生29,30に貢献でき、創傷治癒を促進する血管内皮増殖因子 (VEGF)、肝細胞増殖因子 (HGF)、bFGF などを分泌することが報告されています。私たちの以前の研究は、Asc が継続的にこれらの成長因子の31を分泌することを確認しました。したがって、ASC シート、人工皮膚と組み合わせる新しい治療オプションとして血管新生と創傷治癒の31日を加速するために使用される可能性がある、これらのシートは、将来的に各種の難治性潰瘍や人間の医療現場で火傷の治療に適用される可能性があります。
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Disclosures
次の著者は、このパブリケーションに関連する金融関係を開示: 岡野光夫氏が創設者であり、技術と東京女子医科大学からの特許のライセンスを取得、セル ・ シード社理事長、岡野光夫・大和雅之がセル シード株式会社東京女子医科大学の関係者がセル ・ シード社から研究資金を受け取る他の著者は、この文書に関連する金融関係を持たないを宣言します。
Acknowledgments
著者は、実用的なアドバイスを提供するため医学部形成外科、再建外科、順天堂大学医学部の博士占部をありがとうございます。糖尿病センターの東京女子医科大学医学部優れたテクニカル サポートのための村田英一氏も感謝いたします。本研究は、教育省、文化、スポーツ、科学、技術 (文部科学省) 日本から開発途上技術革新システム「細胞シート組織工学センター (CSTEC)」のプロジェクトの学際的研究領域プログラムを高度なイノベーション センターの作成によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM glutamax | Invitrogen | 32571-036 | Carlsbad, CA |
| Fetal bovine serum (FBS) | Japan Bioserum Co Ltd. | S1650-500 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Collagenase A | Roche Diagnostics | 10 103 578 001 | Mannheim, Germany |
| 60 cm2 Primaria tissue culture dish | BD Biosciences | 353803 | Franklin Lakes, NJ |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) | Life Technologies | 1490-144 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Life Technologies | 25200-056 | |
| L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate | Wako | 013-19641 | |
| 35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) | CellSeed | NUNC-174904 | Tokyo, Japan |
| Microwarm plate (MP-1000) | Kitazato Science Co., Ltd. | 1111 | |
| Rodent mechanical ventilator | Stoelting | #50206 | Wood Dale, IL |
| 4% isoflurane | Pfizer Japan | 114-13340-3 | Tokyo, Japan |
| Artificial skin (Pelnac®) | Smith & Nephew | PN-R40060 | Tokyo, Japan |
| Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) | Smith & Nephew | 66800679 | Known as Allevyn non-adhessing® in the United State |
| 5-0 nylon suture | Alfresa | EP1105NB45-KF2 | |
| 20 CELLSTAR TUBES | greiner bio-one | 227 261 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430791 | |
| 14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL | Hu-Friedy | P14 | Chicago, IL |
References
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