Automatiseret Kvantificering og analyse af celletælling Procedurer Brug ImageJ Plugins

Abstract

Statens Institut for Sundhedsstyrelsens ImageJ er en kraftfuld, frit tilgængelig billedbehandling software suite. ImageJ har omfattende partikel algoritmer, som kan anvendes effektivt til at tælle forskellige biologiske partikler. Når tælle stort antal celleprøver, hæmocytometeret præsenterer en flaskehals med hensyn til tid. Ligeledes tælle membraner fra migration / invasion analyser med ImageJ plugin Cell Counter, selvom præcis, er usædvanligt arbejdskrævende, subjektive, og berygtet for at forårsage håndled smerter. For at imødekomme dette behov, har vi udviklet to plugins inden ImageJ for den eneste opgave automatiseret hæmocytometer (eller kendt volumen) og migration / invasion celletælling. Begge plugins stole på evnen til at tilegne høj kvalitet mikrografier med minimal baggrund. De er nemme at bruge og optimeret til hurtig optælling og analyse af store stikprøvestørrelser med indbyggede analyseværktøjer til at hjælpe kalibrering af tæller. Ved at kombinere det centrale princips of Cell Counter med en automatiseret optælling algoritme og post-optælling analyse, hvilket forøger den lethed, hvormed migration assays kan behandles uden tab af nøjagtighed.

Introduction

In vitro celletælling er en vigtig grundlæggende teknik i en lang række vævskultur eksperimenter. Nøjagtig bestemmelse af antallet af celler i en kultur er afgørende for eksperimentel reproducerbarhed og standardisering ^1,2. Celletælling kan udføres manuelt under anvendelse af et hæmocytometer samt anvendelse af en række automatiserede metoder, hver med deres egne fordele og ulemper ^3,4,5. De fleste af de automatiserede metoder til celletælling tilhører en af ​​to klasser, dem, der bruger Coulter-princippet eller flowcytometri. Coulter tællere drage fordel af celler elektrisk modstand for at bestemme celle antal og størrelse. De er hurtige, præcise og billigere end flowcytometre. Men de er sjældent til kun celletælling på grund af deres betydelige omkostninger sammenlignet med manuel tælling ^3. Flowcytometre, på den anden side, er dyre, men de har mange applikationer såsom celletælling, analyse af celler form, structure og måling indre cellemarkører ^4,5. Maskiner, der bruger en af ​​disse to principper er tilgængelige fra mange producenter. Manuel optælling er overkommelige, men tidskrævende og underlagt fordomme, mens de automatiserede metoder kommer med en brøkdel af den tid, der kræves for den manuelle optælling, men ved hjælp af dyre maskiner ^6.

Andre almindelige cellekultur procedurer er in vitro celle motilitet assays, nemlig celle migration og invasion ^7. Migration og invasion-assays er almindeligt anvendt til at undersøge cellemotilitet og invasivitet som svar på en kemotaktisk respons. Desuden er de i vid udstrækning anvendes til at studere fosterudvikling, differentiering, inflammatorisk respons, og metastase af flere celletyper ^7-11. Celler, der er migreret eller invaderet gennem den porøse membran af en migration assay kan kvantificeres på to forskellige måder. For det første, ved farvning af cellerne med et fluorescerende farvestof, dissociation from membranen, og kvantificering ved anvendelse af et fluorescerende læser ^12. En begrænsning ved denne metode til kvantificering er, at ingen post kan bevares af membranerne, og der er ingen mulighed for yderligere analyse ^13. Den anden kvantificering metode er for migreret / invaderet celler, der skal faste og farvet med fluorescerende farvestof eller mere almindeligt, med cytologiske farvestoffer såsom krystalviolet, toluidinblåt farvestof eller hæmatoxylin; så cellerne kvantificeres manuelt med inverterede mikroskopiske billeder af disse membraner, som er en meget tidskrævende opgave ^12,13.

At overvinde ulemperne af manualen celletælling blev to pålidelige og præcise automatiserede celle tællere for cellekoncentration og for migration assay udviklet. Disse automatiserede celletæller algoritmer udviklet til ImageJ som et plugin bruger Oracles Java edb-sprog. ImageJ er en offentlig og udbredt billedbehandling værktøj udviklet af National Institute of HeaLTH (NIH) ^14,15; derfor, skriver disse plugins til ImageJ letter nem integration i det biologiske samfund.

Automatisering af celletælling sikrer høj produktivitet og reproducerbarhed sammenlignet med manuel tælling. Selvom andre tilgængelige software og plugins kan bruges til at beregne celle koncentration gennem billedanalyse ^5,16,17, Cell Koncentration Lommeregner plugin er hurtig og kan også håndtere fortyndinger af celler og behandlinger. Desuden kan alle resultater og beregninger fra disse to tællere gemmes og eksporteres. De to plugins, der er beskrevet i dette dokument er optimeret til brug for en fasekontrastmikroskop for levende celler og stort synsfelt (hele membran capture) billeddannelse til migration assay membraner gennem brug af en dissekere omfang. De plugins er frit tilgængelige for download med monteringsvejledning fra: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Protocol

1. Forbindelse mikroskop og kamera opsætning (Cell Koncentration Calculator)

1. Øg pære lysstyrke til fuld med lyset justering knop, skifte til 4X objektiv, og sikre fase kontrast filtre er valgt.
   BEMÆRK: Enhver inverteret fasekontrastmikroskop til vævsdyrkning med en mørk baggrund, fx, PHP fasekontrast, kan anvendes efter standard mikroskop og kamera procedurer.
2. Inden mikroskopet software, sæt billedoptagelse indstillinger til default værdierne.
   BEMÆRK: Se mikroskopets brugermanualen for at finde placeringen af ​​disse indstillinger.
   1. Set 'lysstyrke', 'kontrast', og 'mætning "til 100% og" gamma "og" gevinst "til 1,0.
      BEMÆRK: Afhængigt af den software, kan 'lysstyrke "og" kontrast "standard til en værdi på 0% i stedet for 100%.
   2. Set at fange motiver i sort-hvid med den højeste opløsning tilrådighede (1.600 x 1.200 pixels (px) eller større).
      BEMÆRK: En "mætning" på 0% er tilstrækkeligt, hvis en sort og hvid indstilling er ikke tilgængelig.
3. Placer en standard hæmocytometer på mikroskopet scenen og tage et billede som vist i (figur 1A); dette er "Volume Calibration billede '. Juster eksponering timing efter behov.

2. Billede Volume kalibrering

1. Åbent ImageJ og fra menuen plugins, starte Cell Koncentration Calculator (CCC) plugin, f.eks Plugins> Analyzer> 'Cell Koncentration Calculator ".
   1. Hvis højre side 'Billede Volume Calibration' panel ikke er synlig, skal du klikke på 'Kalibrer "for at vise det.
2. I ImageJ, åbne 'Volume Calibration billede' fra trin 1.3 ( "File"> "Åbn") og CCC klik på knappen 'Get Billede Dimension'.
   BEMÆRK: Dette vil fylde i både Image Width ogHøjde tekstbokse med billedopløsningen i pixels automatisk.
3. I ImageJ, vælge 'Lige Linje Tool' ud for markeringsværktøjerne og trække en lige linje på tværs af hele længden af hæmocytometeret primære (P) -square demonstreret i (figur 1B) ved at klikke og trække markøren.
   1. Skub "M" for at få vist Resultater vinduet med de lige line målinger. Indtast værdien fra Length kolonnen til »P-square længde 'tekstboks i CCC (figur 1B).
   2. Klik på "Beregn Billede Volume 'knappen for at lydstyrken billedet i billede Volume tekstfeltet. Alternativt, hvis mængden af ​​billedet allerede er kendt, skal du skrive volumen i nL i billedet Volume tekstfeltet.
4. Klik på knappen 'Gem'.
   BEMÆRK: Dette plugin er nu kalibreret.

3. Kamera Eksponering kalibrering

1. Efter cellehøst foroptælling via hæmocytometer, belastning 10 uL af celler i et kammer af hæmocytometeret og placere den på mikroskop scenen.
2. Brug de samme indstillinger fra trin 1.2, justere eksponeringen tid, så baggrunden linjer hæmocytometeret forsvinde.
   1. Justere fokus, således at det indre af cellerne er mørkere end cellemembranen, hvilket indikerer fokus i den sektion centrale pasning af cellen og ikke polerne.
   2. Yderligere justere eksponeringen således at cellerne ikke er overeksponerede og ligne dem afbildet i (figur 1C).
      BEMÆRK: Let synlige hæmocytometer linjer er acceptable. Det anbefales at gemme eller optage disse indstillinger for at opretholde nøjagtighed og reproducerbarhed.

4. Image Acquisition

1. For hver celleprøve, at belastning 10 uL i begge kamre i hæmocytometeret øge statistisk inferens power ^2. Placer hæmocytometeret på mikroskopbordettil billeddannelse.
   BEMÆRK: opløsning og forstørrelse af hvert billede skal være den samme som den "Volume Calibration billede '. Dette plugin tæller alle billeder af enhver valgte mappe; holde billeder, der skal tælles sammen i den samme mappe.
   1. Hvis et filnavn auto tilvækst funktion er tilgængelig, tænde den og sørg for hvert billede vises ikke efter optagelse for at øge gennemløb.
      BEMÆRK: Manuel spare og lukke hvert billede vil drastisk bremse processen. Se mikroskopet brugervejledning for oplysninger om tilgængeligheden af ​​en auto-tilvækst funktion.
   2. Opsamle mindst tre ikke-overlappende billeder af den centrale region af hæmocytometer selv (5-10) anbefales mere for at øge nøjagtigheden.
      BEMÆRK: Undgå både øverst og nederst for afdelingerne som celler tendens til at stige i tæthed begge steder. Tag den samme antal billeder for hver kammer. Dette er nødvendigt for et velfungerende plugin under tælle.

   5. Billede Counting og fortyndinger

   1. I CCC, klik på 'Tæl celler "og observere Vælg Register dialogboksen. Vælg en mappe, der skal tælles.
   2. Overhold prøvenummer indtastningsfeltet efter valg af en mappe. Indtast antallet af billeder taget pr kammer, dvs., 4.1.2, og klik på "OK". Dette plugin vil nu tælle alle jpg, tiff og png billeder i den valgte mappe i alfabetisk rækkefølge.
      BEMÆRK: Hvis du klikker på knappen "Sample Viewer" vil bringe op Sample Viewer vinduet viser oplysninger om de optalte prøver. Prøve koncentration er den gennemsnitlige koncentration af alle billeder taget pr kammer. Prøver med uden enhed koncentrationer kan føjes til denne liste, såsom tilføjelse af et lægemiddel eller lille molekyle behandling.
      1. Fortælle de celleprøver, hvis koncentrationerne variere betydeligt inden for tællinger af de samme prøver (afsnit 4).
         BEMÆRK: For at beregne fortyndinger for alle than talte-prøver, CCC bruger automatisk formlen _C1 V ₁ = C ₂ V _2.
   3. Brug scenariet for podning 15.000 celler pr 200 pi i 30 brønde i en 96-brønds plade + 1 ekstra:
      1. Indstil tekstboksen til højre for C2 etiket til 15.000, og koncentrationen volumen tekstboksen til 200, ændre den tilstødende kombinationsboksen enhed til "pi".
         BEMÆRK: plugin vil i sidste ende beregne koncentrationen i celler / ml.
      2. Sørg for, at lydstyrken kombinationsfeltet har V2 valgt (endelig volumen) og i tekstboksen til højre ind 6200 (200 pi x (30 + 1)), vælge 'uL "i volumen enhed kombinationsfeltet.
   4. Klik på 'Beregn Fortynding' for at tilføje den aktuelt indtastet fortynding til det nederste venstre liste.
      NB: For hver fortynding tilsættes, vil blive løst for hver prøve og vises i træet diagrammet til højre. Dobbeltklik på hver post til at ekspandere.
   5. Hvis du klikker than 'Save' knappen under knappen 'Sample Viewer' for at skrive til filen alle eksempeldata og fortyndinger.
   6. BEMÆRK: Disse data kan inddrives som helst ved at klikke på 'Load' og vælge den gemte fil.

   6. Migration og Invasion (Counter)

   1. Udfør migrations- og invasion analyser ved hjælp af standard Boyden kammer metode ^7-9.
   2. Efter cellerne er migreret / invaderet, forsigtigt fjerne mediet inden indsatsen ved at vende og forsigtigt at banke. Wick væk overskydende medie klæbet til bunden af ​​membranen ved at berøre kanten til en papirserviet.
      BEMÆRK: Rør ikke membranen sig til håndklæde, dette kan løsne overholdes celler.
   3. Fix og plette de celler som rapporteret ^7-9 i en 24-brønds plade oprettet med hver række indeholdende ~ 500 pi af en anden opløsning, fx fiksativ Stain 1, Stain 2, og dobbelt destilleret vand (Hedeselskabet ₂ O). Fyld en anden plade med 1x PBS to placere indsatser i før opskæring.
   4. Vask indsatser ved at placere dem i brønde fyldt med Hedeselskabet ₂ O og fylde indsatsen med Hedeselskabet ₂ O. Tøm vandet, før pensling væk celler ved inversion.
   5. Brug en ren bomuld applikator til at fjerne un-migrerede / un-invaderet celler fra toppen af ​​membranen pas på ikke at beskadige membranen. Være grundig omkring kanterne af membranen.
   6. Skær membranen under anvendelse af en barbermaskine eller en skalpel og omhyggeligt overføre membranen (med bunden opad) til et rent objektglas.
   7. Tilføj en lille dråbe montering opløsning under og oven på membranen og dække med et tyndt dækglas.
      BEMÆRK: Undgå at fange bobler i monteringsløsning til at bevare nøjagtigheden af ​​tæller.

   7. dissektionsmikroskop og kamera opsætning

   1. Tænd mikroskopets lyskilden og kameraet.
      BEMÆRK: Se mikroskopets brugervejledningen for detaljerede instruktioner.
   2. Within mikroskopets software, der er billedoptagelse indstillinger til default værdierne.
      BEMÆRK: Hvis der er en gennemsnitsberegning funktion, anbefales en værdi på fire. Dette er et godt kompromis mellem graden af ​​udjævning og billedoptagelse tid. Ligeledes kan en lille grad af skarphed øger billede troskab.
      1. Set 'lysstyrke', 'kontrast', og 'mætning "til 100% og" gamma "og" gevinst "til 1,0.
         BEMÆRK: Afhængigt af den software, kan 'lysstyrke "og" kontrast "standard til en værdi på 0% i stedet for 100%.
      2. Indstil display (real-time) og fange beslutning til deres maksimale indstillinger (1600 x 1200 px og 2592 x 1944 px, henholdsvis).
         BEMÆRK: Skærmopløsning kan justeres efter behov, hvis opdateringshastigheden er for langsom. Lavere opløsninger vil gøre det vanskeligere at fokusere præcist, men øge opdateringshastigheden.
   3. For den fase af dissekere rækkevidde, bruge en solid hvid baggrundund; en sort eller glas baggrund er utilstrækkelig.
   4. Bruge ovenstående trin lyskilde, fortrinsvis fra to fleksible LED lys til højre og venstre for scenen.
      BEMÆRK: A nedenfor scenen lyskilde lyser porerne i migration assay membran, som kan have en negativ indflydelse på nøjagtigheden af ​​de efterfølgende tæller.
   5. Placer en udfyldt migration assay membran slide på scenen. Ser man på den real-time billede, der vises af softwaren, justere forstørrelsen med knop zoom indstilling, så kanterne af en enkelt membran er lige inden for kameraets synsfelt.
      BEMÆRK: Placering af dias på en glasplade overtop den hvide baggrund scenen gør det lettere at manøvrere dias for billeddannelse.
   6. Juster lyskilde positioner (7.6.1) og eksponering gange for at gengive så tæt som muligt det ideelle billede er afbildet i figur 2A. Afhængigt af lysstyrken, bør eksponeringstider på 5-60 ms være tilstrækkelig.
      NOTE:Målet er at producere et billede med så lidt baggrundsfarve som muligt, og en ensartet belyst membran uden at reducere billedet troskab, dvs. overeksponering der fører til et tab af synlige celler.
      1. Placer venstre og højre lyskilder i en lav vinkel i forhold til dias. Dette vil hjælpe med at fjerne baggrunden pletten og kromatisk aberration. Forsøge at holde hver lyskilde direkte modsat til den anden.
         BEMÆRK: Mens manøvrering hver lyskilde i position, vende den anden fra. Dette hjælper til at centrere det område af belysning på membranen selv mere let og præcist.
   7. Fjern dias og hvidbalance billedet ved hjælp af en enkelt knap klik i mikroskopet software.
      BEMÆRK: Mikroskopet er nu kalibreret. Gem så mange indstillinger som muligt til fremtidig brug og noterer lyskildens positioner og intensitet.

   8. Image Acquisition og Flatfield

   1. I softwaren, sætcapture-mappen, og fange et billede pr membran. Navngiv billederne efter den generelle skabelon: Navn - ###, fx kontrol - 001.tif, kontrol - 002.tif, Test narkotika - 001.tif, og så videre.
      BEMÆRK: Du opnår de bedste billedresultater, gem den type billedfil som tiff frem for andre lossy formater såsom jpeg.
      BEMÆRK: Billeder, der ikke følger den generelle skabelon vil stadig blive talt, men vil ikke være omfattet af automatiseret gruppering og flad Fielding.
      1. Hvis der ønskes flatfield korrektion for hvert dias finde et tomt område og tage en Blank billede efter navngivningskonventionen: Navn - Blank.
         BEMÆRK: En blank er et område på diaset, der ikke indeholder membran og repræsenterer baggrundsbelysning.
      2. Umiddelbart før billeddannelse, flade hver membran ved at påføre tryk over dækglasset og fjerne så mange fanget bobler som muligt.
   2. I ImageJ, gå til Plugins og åbn TC plugin; fx Plugins> Analyser> & #39; Transwell Counter «.
   3. Inden TC, klik på knappen 'Flatfield "og observere Vælg Register dialogboksen. Vælg den mappe, hvor membranen billeder blev gemt.
      BEMÆRK: Kun billeder gemt med den generelle skabelon ovenfor, vil blive automatisk flatfield rettes og gemmes i en ny mappe kaldet Flatfield inden for den valgte mappe. Se figur 2B for et eksempel på en flatfield korrigeret billede.

   9. Konfigurationsindstillinger

   1. Åbn en migration assay membran billede i ImageJ ( 'Filer ">" Åbn ") og vælge Billede> Justering>' Color Threshold ...«. Overhold Threshold vinduet Farve for at justere, hvilke farver vil blive filtreret ud af billedet.
      1. Nederst i vinduet, indstilles Thresholding metode til 'Shanbhag «, Threshold farve til' White ', og Color plads til" RGB "(rød grøn blå); fjerne markeringen Mørk baggrund, hvis valgt.
      2. Juster toppenskydere ved at klikke og trække markørerne til 0 og de nederste skydere til 255 (lad de nederste skydere på 255). Sørg for, at billedet er fuldt hvid.
   2. Juster grønne og røde top skydere indtil kun de kerner er synlige.
      BEMÆRK: De udvalgte vil variere helt af cellen pletten anvendte indstillinger. Se figur 2C.
   3. I TC plugin, input værdierne af RGB øverste skydere i de tilknyttede Configuration Settings 'RGB Threshold' tekstbokse. Klik på knappen "Tilføj / Rediger 'og overskrive konfigurationen.
      1. Lad Size Range nedre og øvre værdier på 1 - Infinity.
   4. Inden panelet konfigurationsindstillinger, skal du klikke på 'Gem' for at skrive indstillingerne til harddisken.

   10. Counting billeder og kalibrering

   1. Åbn TC plugin (8.2) og klik på 'Count Folder "og observere Vælg Register dialogboksen. Vælg den mappe, der skal tælles ennd vente til den er færdig.
   2. Hver tælles-prøve føjes automatisk til hovedtabellen. Vigtige kolonner er "Count", "kvalitet" og "Kalibrer?«.
      BEMÆRK: un-kalibrerede Grev er antallet af partikler pr membran i området vises i kolonnen »Område rækkevidde«.
      BEMÆRK: Kvalitet spænder fra ca. -0,8 til 1,7; Q ≥ 0,5 er acceptabel.
      1. Overhold et flueben i "Kalibrer?" kolonne, hvis et billede er markeret til kalibrering baseret på dens lighed med de ideelle målinger.
         BEMÆRK: Både kvalitet og kalibrering kan antyde, at de aktuelle indstillinger er muligvis utilstrækkelig. Hvis der efter en ordentlig 'Farve Thresholding "og" Størrelse Ranges "er blevet udvalgt og kalibrering stadig foreslået, inspektion af det originale og tælles billederne skal være den endelige faktor for et gyldigt tæller.
   3. Marker alle prøverne i tabellen Markeret for kalibrering.
      1. Højreklik på than bord og vælge fintælling> 'Foreslået størrelse «. Dette vil fortælle billeder med en foreslået minimum partikel område.
      2. Højreklik igen og vælg "Vis Plot". Overhold hyppigheden scatter plot af partikel områder. En ideel billede vil have en graf der ligner en lang højre-tailed normalfordeling, dvs. bell kurve. Se figur 3B.
      3. Juster lavere Size Range, hvis det kræves, ved at udvælge stikprøven, højreklikke og vælge fintælling> "Manuelle indstillinger '. Overhold den manuelle indstillingsdialogen. Indtast de ønskede indstillinger, og klik Tæl at fortælle billedet med de nye indstillinger.
   4. For at justere tæller manuelt, skal du vælge prøverne, højreklikke på tabellen, og vælg 'Åbn billede med tæller'. Overhold det oprindelige billede med røde markører, der repræsenterer hver partikel tælles af plugin.
      BEMÆRK: fintælling> 'Vis tælles binært billede' kan være nyttigt at kontrollere, hvor godt jegndividual celler bliver løst af farve tærskling.
      1. For at tilføje en optælling, holde 'Ctrl' og venstre klik. Overhold en markør på markørens placering, der vil blive tilføjet til prøverne i alt tæller. For at fjerne en markør, skal du højreklikke på billedet. Dette plugin vil fjerne markøren nærmest markøren.
      2. For at fjerne en gruppe af markører, skal du bruge et markeringsværktøj i ImageJ at vælge et område af interesse (ROI). Mens du holder "Ctrl", højreklik på billedet, og alle markeringer inde i ROI vil blive fjernet. Overhold celle nummer i kolonnen »Count«.

   11. Lagring / Åbning Resultater og Eksport til CSV

   1. I TC, gå til menulinjen og klik på 'File ">" Gem resultater «. Overhold Gem dialogboksen Results kassen. Vælg et navn og destination, og klik på "Gem".
      1. Brug 'Filer ">" Åbn resultater' for at indlæse en fil, der indeholder alle de data, der vises i hovedtabellen, including plottet.
         BEMÆRK: Resultaterne fil gemmer mapper billederne er gemt i Hvis de originale billeder flyttes efter lagring, 'Åbn originale billede "og" Åbn billede med tæller' funktioner vil mislykkes..
      2. For at nulstille billedet biblioteket, vælge prøverne, højreklikke på tabellen, og vælg 'Nulstil billedmappe'. Overhold Vælg Register dialogboksen. Vælg den nye mappe, og hvis der findes billederne, vil mapperne blive nulstillet. Re-gemme resultaterne filen.
   2. For at gemme en kommaseparerede værdier (CSV) fil, i menulinjen gå til "Filer"> "Eksporter til .csv". Dette frembringer en fil med prøver organiseret i statistiske grupper med middelværdien tæller og standard fejl af middelværdien; dets layout er designet til hurtig grafer i almindelige grafiske programmer.
      BEMÆRK: De statistiske grupper er baseret på de grupper, der er oprettet inden for TC.
      1. Hvis prøverne følge den generelle navngivning skabelon, skal du vælge prøverne at være grouped, højreklikke og vælge 'Auto gruppering «. Dette tilføjer prøver med den samme 'Navn' til den samme gruppe. Brug af eksempel Kontrol - 1, kontrol - 2, behandling - 1, behandling - 2: begge kontroller vil blive tilføjet til gruppen "Control 'og behandlinger til" behandling ".
      2. Føj prøver manuelt til grupper ved at dobbeltklikke på prøvens »Gruppe 'celle og skrive i gruppenavnet. Vælg de prøver, der skal føjes til denne gruppe, højreklikke og vælge "Tilføj til gruppe«.

Representative Results

Cell Koncentration Calculator

Figur 1 viser den overordnede proces med CCC kalibrering og tællelig billede erhvervelse. Figur 1A og 1B afbilder P-square kalibrering image og beregning af P-square længde i pixel. CCC bestemmer celle koncentration i et givet volumen ved hjælp af formlen:

Et hæmocytometer s P-square har et volumen på 100 NL (1 mm x 1 mm x 0,1 mm) og givet denne konstant, kan den samlede billedvolumen beregnes efter konvertering pixel til mm. Figur 1C er en ideel tællelig billede med i-fokus celler viser den karakteristiske fase belysning og ingen baggrund hæmocytometer gradueringer. Endelig scatter plot af Figure 1D viser en højt korreleret, manuel versus automatiseret optælling af celler fra 57 billeder taget over forskellige eksperimenter og celletyper, herunder HTR8, ES-2, og Swan71. Af note, den øvre del af fusionen ~ 5,6 x 10 ⁶ celler / mL med en lave ende af ~ 2,3 x 10 ³ celler / ml (≈ 5 celler pr billede). Det foreslås, at hvis tæller er under 10-15 celler pr billede, bør prøven suspenderes i en mindre volumen at øge statistisk styrke.

Køb og behandling af billeder for Migration Assay Counter

Hundredvis af migration assay membraner blev afbildet over mange eksperimenter, som alle blev podet med den menneskelige trofoblasten cellelinie HTR8, Swan71 eller ovariecancer cellelinie ES-2. Af disse billeder, flere blev valgt til at repræsentere en række kategorier fra meget dårlig til fremragende kvalitet baseret på lysstyrke, klarhed og farve staineD-celler, og graden af ​​baggrundsfarvning og uønskede partikler (støj). Ved hjælp af disse billeder, standard RGB Threshold farveindstillinger de (≈ 150, 120, 0) blev bestemt (figur 2C) og bruges som udgangspunkt i alle efterfølgende udviklinger af algoritmen. Målet var at maksimere den nukleare farve til samlet farve-forhold, dvs., bør størstedelen af farvede pixler være inden cellekerner. Det øverste panel i figur 2A viser det ideelle billede lysstyrke, celle kerner klarhed og farve, og ubetydelig baggrundsstøj. Lysstyrken af ​​billedet er vigtigt at der er en stor nok kontrast mellem celle og baggrund for at fremstille et sort og hvidt binære billede.

Hvis denne forskel ikke er opfyldt, kan store eller uforudsigelige arealer regnes af ImageJ Analyser Partikler funktion; bedste fald er en helt hvid baggrund. I opposition, det nederste panel af Figur 2A har ekstrem baggrundsfarvning og celler, der er næsten umulig at skelne. Membraner med denne grad af farvning vil sandsynligvis producere upålidelige resultater fra migration assay tælleren.

I nogle tilfælde kan øge lysstyrken til det ideelle niveau påvirker billedet troskab ved at overeksponere billedet. Tilsvarende kan høj eksponering eller lysstyrke giver systemiske kromatiske effekter med progressiv eller uregelmæssig lyse og mørke områder. Med flatfield korrektion, kan disse virkninger minimeres eller fjernes helt, som vist i figur 2B (øvre vs. nedre panel). Endvidere flatfield korrektion er en god måde at udjævne lysstyrken af ​​multiple membran billeder.

Kalibrering og validering af Migration Assay Counter

For at hjælpe osis i bedre afgøre, om migration assay membran billeder opfylder de nødvendige kriterier for præcis optælling blev to kvalifikationsturneringer designet, kaldet billedkvalitet (Q), og kalibrering anbefaling (CR). Vigtigt er det, begge kvalifikationsturneringer, som navnet CR antyder, er anbefalinger kun og fungerer som guider snarere end absolutte dommere ved ansvarlighed af hvert billede. Både Q og CR er baseret på målinger af frekvensen scatter plot af partikel-området (10.3.2). For forenkling, kan en metric anses for de forskellige former af kurven, der udgør frekvens plot. Den ønskede målestok for en passende Q (≥0.5) blev bestemt ved den observerede omtrentlige normale fordeling af cellestørrelse. Sædvanligvis celler, som er uløselig fra hinanden, over-farves, eller bare særlig stor, flytte skewedness til en højre-tailed normalfordeling (figur 3B). Som sådan er dette den ideelle metrik af en typisk kalibreret billede. Medtilsætning af baggrundsstøj, dette normalt fører til et stort antal partikler i 1-5 pixelområde interval (figur 3A). For at beregne de plot målinger, er de data, monteret med ti Savitzky-Golay udglattede kurver af forskellig polynomium grader produceret af Dr. Michael Thomas Flanagan Java Scientific Library (http://www.ee.ucl.ac.uk/~mflanaga / java /). Væsentlige, det skaber flere punkter i den omtrentlige region hver ekstremum. Gennem en række tæthed klynge kort over lokale minima og maksima, kan et generelt billede af plottet målinger beregnes som en ordnet liste, dvs. minimum, maksimum, minimum / maksimum overlap, ..., n ^th ekstremum. Kort fortalt, i hvilken grad de udglattede kurver passer frekvensen data bestemmer, hvor tæt pakket det ekstrema punkter. Jo større gruppering af ikke-overlappende ekstrema, bliver større Q. I teorien, Q betegner generelle billedskarphed baseret på than distribution af forskellige partikelstørrelser.

Hvorvidt Boolean CR er sandt eller ej, afhænger af rækkefølgen af ekstrema. Af figur 3A, vil den ordnede liste være minimum, maksimum, og en sekvens af overlappende ekstrema baseret på egenskaberne af Savitzky-Golay kurve. Da 3A repræsenterer en ukalibreret billede, denne generelle sekvens af Extrema flag CR som sande, tyder til brugeren, at billedet kan have brug for kalibrering. Fremover kan det ses, at fra figur 3B, vil denne liste være identiske, men med undtagelse af den første minimum. Således de målinger af ideelle kalibrerede og kalibreret billeder blev bestemt. Afvigelser fra disse målinger vil generelt flag et billede til kalibrering og reducere Q ≤ 0, hvilket er tilfældet med den høje baggrundsstøj membran i figur 3C. Anvendelse af disse kvalifikationskampe til et udvalgaf beskeden til fremragende billeder, med hensyn til lysstyrke og baggrundsstøj, er det klart, at kalibreret billeddata tæller er betydeligt tættere på manuelle tællinger end ukalibrerede (1,9% ± 0,3 vs. 21,7% ± 2,9, henholdsvis, figur 3D, E). I betragtning af den samlede høje kvalitet af billeder, der er valgt til analyse (ukalibrerede = 0,71 ± 0,04; gennemsnit ± SE), var der en forventet beskeden stigning kun i Q efter kalibrering ( = 0,90 ± 0,04). Tilsammen Q foreslår den samlede ansvarlighed potentiale af et billede mens CR er en stærk indikator for, om kalibreringen er vellykket eller ej.

Timing Sammenligninger af begge Cell Koncentration Tæller og Migration Assay Counter

Figur 4A sammenligner CCC kalibrering tid mellem User 1 og 2. Som forventet, Bruger 1 var væsentligt hurtigere end Bruger 2 sammen, idet der i gennemsnit cirka fem minutter for CCC kalibrering. For at kunne sammenligne manuel hæmocytometertælling og automatiserede satser, blev den manuelle hastighed på tælling under anvendelse af en taelleinstrument forhold til den tid det tog at tage ni billeder af hæmocytometeret kammer og talt i CCC (figur 4B). En typisk cellekoncentration på 1,15 x 10 ⁶ celler / ml blev anvendt til at sammenligne tider, hvilket fører til et gennemsnit på 1x stigning i gennemløb. Denne hastighed vil variere afhængigt af antallet af celler fyldt ihæmocytometer som det samlede tid, det tager at tage billeder og behandle dem er uafhængig af celle nummer.

Endelig blev tider der omfatter erhvervelse af membraner, kvantificering inden TC, og manuelle justeringer af disse billeder billede målt i figur 4C. Især blev 12 migration assay membraner med lavt celletal (Total = 10,571 celler) og en væsentlig baggrund farvning og celleaffald valgt for at lette den værst tænkelige situation, som ville kræve manuelle justeringer celle nummer. Dette afspejles i figur 4C justering (Adj) kolonne, hvor det tog i gennemsnit 13 min at fjerne uønskede tæller og tilføje ubesvarede celler. Til sammenligning til manuel optælling blev optimale celletælling satser bestemt med Cell Counter; høj kvalitet membran billeder med høj celledensitet blev anvendt (resultater ikke vist). Dette gav en gennemsnitlig maksimal hastighed mellem User 1 og 2 på 9,1 x 10 ³ celler / h(~ 2,5 celler / s). Ved hjælp af disse tal blev membranerne fra figur 4C tælles 4,4x hurtigere med TC end man ville forvente ved maksimal manuel sats. Tidsbesparelsen er direkte afhængig af celleantal og billedkvalitet, ved at tælle migration membraner, der kræves lidt eller ingen justering og høj celledensitet (~ 7.000 celler / membran), TC genereret celletal 1,395x hurtigere end den maksimale manuel sats.

Figur 1: Cell Koncentration Calculator. (A) Fasekontrastmikrografi af den centrale primære kvadratet af hæmocytometeret taget ved 40X total forstørrelse. Scale bar repræsenterer 200 um. (B) En beskåret version af billedet fra (A) skildrer, hvad længde til at måle på hæmocytometeret. Længde Kolonnen Resultater Vinduet blev fremhævet for nem identifikation. Gul bar= 1 mm. (C) En ideel mikrograf af et hæmocytometer indeholder HTR8 celler efter mikroskop og software kalibrering ved 40X total forstørrelse med en opløsning på 1600 x 1200 px. Scale bar = 200 um. (D) En scatter plot sammenligne manuelle optællinger ved hjælp af ImageJ plugin Cell Counter forhold til automatiserede tællinger af de samme billeder ved hjælp af Cell Koncentration Calculator. n = 57 billeder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Migration assay counter repræsentative billeder. (A) Den øverste panel er en en ottendedel del af et samlet membran afbilder en ideel billede med minimal baggrund; Scale bar = 200 um. Detnederste panel indeholder et billede med betydelig baggrund farvning, som er stærkt påvirker nøjagtigheden af ​​den automatiske optælling; Scale bar = 585 um. (B) Den øvre panel repræsenterer et mørkt billede af god kvalitet, som producerede unøjagtige tæller. Den nederste panel er en tællelig version af det samme billede efter flatfield korrektion. Scale barer = 593 um. (C) Den øverste panel repræsenterer en zoomet-med henblik på en typisk membran. Den nederste panel er det samme billede efterfulgt af den ønskede ImageJ farve tærskelværdiansættelse (RGB Threshold = 150, 120, 0) til fjernelse intercellulær baggrund og størstedelen af ​​synligt farvede cytoplasma. Alle billeder blev taget ved 1,35x total forstørrelse med et kalibreret dissekering omfang med en opløsning på 2592 x 1944 px fra flere migration assay invasioner af HTR8 farvet med hæmatoxylin. Scale barer = 100 um. Klik her for at viewa større version af dette tal.

Figur 3: Kalibrering og validering af migration assay c ounter. (A) Typisk eksempel på et kalibreret billede af høj kvalitet. (B) Den kalibrerede version af (A) ved hjælp af migration assay tæller s fintælling> "Foreslået størrelse«. (C) En typisk frekvens plot af en lav billedkvalitet membran med betydelig baggrund plet eller samlet mørke. (D) En scatter plot sammenligne manuelle optællinger ved hjælp af ImageJ plugin Cell Counter og migration assay tæller automatiserede tæller. (E) en søjlediagram, der viser den gennemsnitlige procentvise forskel af kalibreret versus kalibrerede automatiserede tæller. Dataene er gennemsnit ± SE. P <0,0001, n = 30, uparret t-test med Welch korrektion. De samme billeder blev brugt til D og E. Kalibrering af begge blev gjort med den fintælling> 'Foreslåede størrelse "og fintælling>' Manuelle indstillinger 'for yderligere at forfine den mindste størrelse tælles og farve tærskel. Ingen manuelle tæller justeringer blev foretaget ved hjælp af 'Åbn billede med tællinger' funktion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Timing af Cell Koncentration Tæller og migration assay counter brug. (A) Sammenligning af CCC kalibrering gange (trin 1 og 2) mellem User 1 (CCC / TC ekspert) og Bruger 2 (CCC / TC novice). (B) Manuelle celletælling gange blev gennemsnit over fem forsøg og udtrykkes i celler talt pr min. automac tællinger blev beregnet som gennemsnittet gange at fange ni billeder af et hæmocytometer kammer og talt med CCC. Celle anvendte koncentration var ~ 1.15 x 10 ⁶ celler / ml. Dataene er gennemsnit ± SE. n = 5. (C) Transwell Counter tider blev sammenlignet over tre kategorier: erhvervelse (ACQ; trin 7 og 8), kvantificering (QNT; trin 10.1-10.3.3 med indstillinger standardkonfigurationsindstillinger) og manuel indstilling (Adj; skridt 10,4 -1.4.2). Membranerne kvantificeres havde en høj grad af baggrundsfarvning og snavs for at nødvendiggøre betydelige manuel justering for nøjagtige tæller. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Kritiske Steps, fejlfinding og begrænsninger

Selve karakteren af ​​automatiserede beregningsmetoder, navnlig vedrørende partikel analyse, nødvendiggør den matematiske evne til at definere disse partikler. Derfor nøjagtigheden af ​​både Cell Koncentration Lommeregner og migration assay tælleren er majorly afhængig af billedet troskab, det vil sige, hvor tæt det optagne billede ligner celleprøven eller migration assay membran. Det er derfor af den største betydning at følge mikroskop og tilhørende software kalibrering protokoller bedst muligt. Dette omfatter begrænsning baggrundsstøj, reducere uønskede partikler, opfange lys og ensartet i-fokus billeder, og gemme i ikke-lossy filformater som tiff. Således begge plugins er tilbøjelige til at producere fejlagtige resultater, hvis disse krav ikke er opfyldt. Derfor er det altid god praksis at dobbelttjekke celletal at afgøre, om de matcher visuelle forventninger, når i dobbt. Hvis ja resultatet er ikke ens, sammenligne det oprindelige billede med det binære billede kan hjælpe belyse problemet (10,4 note). I nogle tilfælde kan mørkere migration assay billeder indeholder store områder, der er blevet optalt grund pixelværdier falder inden for de tærskelværdier farve grænser. Generelt vil anvendelse af en flatfield billede fjerne mørke og blotchiness og forhindre de fleste uønskede tællinger grund kromatiske uregelmæssigheder.

På baggrund af disse mulige og relativt almindelige problemer, er det vigtigt at følge standard billede integritet retningslinjer som dem foreslået af Nature Publishing Group og andre ^13. For at holde tæller konsekvent, bør enhver justering et billede ligeledes anvendelse på alle andre. Dette omfatter, men er ikke begrænset til kontrast, mætning, lysstyrke, gain, filtre såsom udjævning og skarphed, og farvefiltre. Af gamma bør undgås, da den anvender en ikke-lineær ændring af pixel farve og så kan påvirke hvert billede forskelligly ^14. Ved anvendelsen af ​​en fælles eksponeringstiden for billeder med få celler (<1.000), dette kan føre til overeksponering og tab af billedgengivelse. Omvendt kan en membran med tusindvis af celler kræve højere eksponeringstider for at forhindre undereksponering. Følgelig er det bedste praksis for at justere billeder så lidt som muligt, og kun når det er nødvendigt, for at opretholde den højeste billedkvalitet troskab opnåelige.

Selv med en high fidelity billede, kan sande partikeltællinger blive alvorligt skæv af uønskede partikler. Ved brug cellekoncentration Lommeregner, hvis en prøve indeholder betydelige mængder af cellerester, specielt i områder svarende til dem af suspenderede celler, kan dette skew resultatet. I nogle tilfælde kan dette forhindre automatiserede analyse, hvis resterne ikke kan minimeres. Ligeledes migration assay membraner, der indeholder høje niveauer af baggrundsfarvning af samme farve farvede celler eller ikke-fjernede celler fra bagsiden af ​​membranen, vil sandsynligvis producere inSvarende resultater. Disse uønskede partikler kan normalt fjernes i et par måder: øget lyskilden lysstyrke eller eksponeringstid, ændre farven tærskling at være mere vidtgående, eller fjernes manuelt via "Åbn billede med tæller '(10,4). Det er vigtigt at bemærke, at denne protokol producerer den optimale kvalitet af billedet kræves til CCC og TC at opretholde nøjagtighed. Men TC er i stand til at tælle billeder af betydeligt mindre kvalitet, varierende forstørrelser, eller forskellige farve pletter, generelt kun kræver mere tid brugt på manuelle justeringer (10.4).

Under kalibreringen af ​​enhver migration assay membran billede er det vigtigt at tage hensyn til opløsning af billedet og den relative størrelse af cellerne. Som tidligere beskrevet Image Quality (Q) og kalibrering henstilling (CR) er afhængige af frekvensen plot målinger af partikel område. Af de analyserede billeder, hver celle optager i gennemsnit 1 / 100.000 af densamlede billede område. Ved brug billeder af blot millioner af pixels med en lille cellestørrelse ratio, variationen i cellestørrelse er også lille. Det vil sige, at variansen kan kun spænder 10-60 px. Men da cellen område af billedet arealforhold bliver større, fordelingen af ​​cellestørrelser stiger, reducerer kurtosis af cellestørrelsen normalfordeling ved at reducere frekvensen af ​​et givet område. Dette kan gøre automatiseret beregning af celle området mere vanskeligt eller umuligt, fordi en bestemt minimumsareal ikke kan bestemmes. Tilsvarende gælder dette også for billeder med få antal celler, hvor hyppigheden af ​​forskellige cellestørrelser kan være meget lav (<50). Som et resultat, når man analyserer billeder med forskellige opløsninger end dem, der anvendes i denne undersøgelse, eller forskellige fordelinger af cellestørrelsen, kan være nødvendig manuel identifikation af cellestørrelse interval (10.3.3).

Betydning og fremtidige vejvisning

Den ImageJ plugin Cell Counter blev oprindeligt released i 2001 af Dr. Kurt De Vos og har fungeret som et dagligt syn for manuel celletælling til denne dag. For at fortsætte tendensen med frit tilgængelige værktøjer til det biologiske samfund, Cell Koncentration Lommeregner og migration assay tæller tilbyde det næste skridt i gratis værktøjer til at hjælpe med at øge throughput og inter-eksperimentelle reproducerbarhed migration analyser. Slutresultatet af migration assays er meget afhængig af antallet af celler podet. Ergo en pålidelig celletal er en nødvendighed for reproducerbarhed. På denne måde, CCC tilbyder både forøget nøjagtighed på grund af højere statistisk sikkerhed på cellekoncentration og kortere tælletider bevare celle sundhed.

Desuden det endelige resultat af begge plugins er en optælling af antal celler og ikke en relativ indeks såsom fluorescens. Forskellige andre protokoller findes denne foranstaltning fluorescens efter farvning, men disse metoder lider af mangel på sensitivitet ^13. Adobes Photoshop tilbyder sin egen partikel analyse tOOL men programmet skal købes til brug og tilbyder ikke den post-optælling analyse fås fra migration assay tæller ^20. Begge plugins stole på funktionen partikeltælling fra ImageJ og dermed kan ændres af slutbrugeren ved at redigere makroer bruges af ImageJ. Dette giver større fleksibilitet for brugeren at udvide omfanget af de plugins til andre partikler ved at skabe nye makroer. Videreudvikling at øge bredden af ​​tællelige partikler og indarbejde slutbruger bidrag er det næste logiske skridt. Ved at kombinere de grundlæggende principper i Cell Counter med en automatiseret optælling algoritme og post-optælling analyse, dette øger den lethed, hvormed migration assays kan behandles uden tab af nøjagtighed. De plugins er frit tilgængelige for download med monteringsvejledning fra: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - With L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3002702	Cell culturing media
Fetal bovian serum (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Media suppliment
HTR8/SVneo trophoblast cell line	Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada)		Software is designed to work with any cell line.
Trypsin	GIBCO BRL	27250-018	Prepared as 0.20% (w/v) in 10 µM EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 cm cell culture plates	SARSTEDT	833902	Any tissue culture treated plates will be suitable
Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0 µm Pore size	Costar 3422 ordered from Fisher Scientific	7200150	For 24-well plates; Pore size: 8.0 µm; 6.5 mm diameter; 0.33 cm2 growth area
HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore and ordered from VWR	65044A, B, & C	Hemacolor stain set consists of three 500 ml (16.9 oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)
Cotton Tipped Applicator	Puritan Medical	806-WC
Single-edge industrial razor blades	VWR	55411 - 055	Thickness: 0.30 mm (0.012")
Microscope Slides - Precleaned/Plain	Fisher Scientific	12550A3	Dimentions: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1	Fisher Scientific	12-545E	Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo dissecting microscope	Leica Microsystems		The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:  LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90 mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303 mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293
Hemacytometer	Assistant Germany		0.100 mm Depth - 0.0025 mm2
Olympus inverted light microscope	Olympus Corporation	CKX41SF	The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2
Laminar flow cabinet 1300 Series A2	Thermo Scientific	Model: 1375	Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable
Cell culture incubator	Thermo Scientific	Model: 370	Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C
ImageJ	NIH	Version 1.50e	Minimum version required
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	Minimum version required