ImageJ에 플러그인을 사용하여 셀 카운팅 절차의 자동화 된 정량 및 분석

이 프로토콜의 전반적인 목표는 디지털 분석 도구를 사용하여 현탁액 또는 침입 분석 멤브레인의 이동에 있는 세포의 정확한 계수를 신속하게 수행하는 것입니다. 이 프로토콜은 연구자가 일반적인 기술 및 체외 세포 운동성 분석에 필요한 세포 수를 정량화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 여러 필터와 분석 도구를 포함하면서 빠르고 정확한 세포 계수를 제공한다는 것입니다.

시작하려면 현미경 조명을 최대로 설정하십시오. 4x 대물렌즈로 전환하고 위상차 필터가 사용 중인지 확인합니다. 그런 다음 현미경 소프트웨어 내에서 이미지 캡처 설정을 기본값으로 설정합니다.

이제 표준 혈구계를 현미경 스테이지에 놓고 이미지 볼륨 보정 단계를 위해 이미지를 캡처합니다. 필요에 따라 노출 시간을 조정합니다. ImageJ의 세포 농도 계산기에서 이미지를 열고 이미지 차원 가져오기 버튼을 클릭합니다.

이 작업은 이미지 너비 및 높이 텍스트 상자를 이미지 해상도(픽셀)로 채웁니다. 그런 다음 직선 도구를 선택하고 커서를 클릭하고 드래그하여 혈구계의 기본 p-제곱의 전체 길이에 걸쳐 직선을 그립니다. 그런 다음 M 키를 눌러 결과 창을 표시합니다.

이제 길이 열의 값을 셀 농도 계산기의 p-square length 텍스트 상자에 입력합니다. 그런 다음 이미지 볼륨 계산 버튼을 클릭하여 이미지 볼륨을 이미지 볼륨 텍스트 상자에 출력합니다. 마지막으로 저장 버튼을 클릭하여 플러그인 보정을 완료합니다.

샘플 분석을 위해 혈구계 슬라이드의 양쪽 챔버에 10마이크로리터의 세포를 로드하고 세포 내부가 세포막보다 어둡도록 초점을 조정하여 극이 아닌 세포의 중앙 단면 내에서 초점을 제공합니다. 그런 다음 세포가 과도하게 노출되지 않도록 노출을 추가로 조정합니다. 약간 보이는 혈구계 선은 허용됩니다.

이제 혈구계의 중앙 영역에 대한 5-10개의 겹치지 않는 이미지를 캡처합니다. 각 이미지의 해상도와 배율은 부피 보정 이미지와 동일해야 합니다. 그런 다음 세포 농도 계산기에서 Count Cells를 클릭하고 팝업 창에서 계산할 폴더를 선택합니다.

그런 다음 샘플 번호 입력 상자에 챔버당 촬영된 이미지 수를 입력하고 OK를 클릭합니다. 이제 플러그인이 데이터를 수집합니다. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. 시작하려면 현미경 소프트웨어 내에서 이미지 캡처 설정을 기본값으로 설정합니다.

해부 범위의 s의 경우 단색 흰색 배경을 사용하고 무대 위의 광원, 가급적이면 두 개의 유연한 LED 조명을 사용하십시오. 이제 완료된 마이그레이션 분석 멤브레인 슬라이드를 스테이지에 놓습니다. 소프트웨어에 의해 표시되는 실시간 이미지를 보고 단일 멤브레인의 가장자리가 카메라의 시야 내에 있도록 배율을 수동으로 조정합니다.

그런 다음 광원 위치와 노출 시간을 조정하여 이상적인 이미지를 최대한 가깝게 재현합니다. 최소한의 배경색과 균일하게 조명된 멤브레인이 있습니다. 세포 계수의 정확도는 고품질 이미지 획득에 따라 달라집니다.

따라서 플러그인을 가장 효율적으로 사용하려면 사용자의 카메라에서 얻을 수 있는 최상의 이미지를 캡처하는 것이 중요합니다. 이제 현미경 소프트웨어에서 슬라이드를 제거하고 이미지를 화이트 밸런스하여 보정을 완료합니다. 이미징 직전에 커버 슬립에 압력을 가하여 각 멤브레인을 평평하게 하여 갇힌 기포를 최대한 많이 제거합니다.

이제 소프트웨어 내에서 캡처 폴더 위치를 설정합니다. 그런 다음 멤브레인당 하나의 이미지를 캡처하고 샘플 001의 명명 규칙을 사용하여 이미지 파일을 TIF로 저장하고 각 이미지의 수를 점진적으로 증가시킵니다. 이 명명 규칙은 플러그인이 파일을 찾는 데 필요합니다.

플랫필드 보정이 필요한 경우 각 슬라이드에 대해 빈 영역을 찾아 빈 이미지를 가져옵니다. 파일을 샘플 이름으로 공백으로 저장합니다. 그런 다음 ImageJ에서 TC 플러그인을 엽니다.

TC 내에서 Flatfield 버튼을 클릭하고 Choose Directory 대화 상자에서 멤브레인 이미지가 저장된 폴더를 선택합니다. 이제 Migration Assay 멤브레인 이미지를 열고 Color Threshold를 선택합니다. 창에서 메서드를 Shanbhag로 설정합니다.

임계값 색상을 흰색으로 설정합니다. 색 공간을 RGB로 설정하고 어두운 배경 옵션을 선택 취소합니다. 그런 다음 위쪽 슬라이더를 0으로, 아래쪽 슬라이더를 255로 조정하여 이미지를 완전히 흰색으로 만듭니다.

흰색이 되면 핵만 보일 때까지 녹색 및 빨간색 슬라이더를 조정합니다. TC 플러그인에서 RGB 슬라이더의 값을 관련 구성 설정 RGB 임계값 텍스트 상자에 복사합니다. 그런 다음 Add/Modify(추가/수정) 버튼을 클릭하고 구성을 덮어씁니다.

구성 설정 패널에서 Save(저장)를 클릭하여 하드 드라이브에 설정을 씁니다. 이제 TC 플러그인으로 이미지를 계산하려면 Count Folder를 클릭하고 계산할 폴더를 선택하십시오. 그런 다음 프로그램은 이미지를 처리하고 기본 테이블에 데이터를 자동으로 추가합니다.

이제 기본 테이블에서 Calibrate? 이미지에 있는 경우 열은 이상적인 메트릭과의 유사성을 기반으로 보정을 위해 플래그가 지정됩니다. 보정을 위해 플래그가 지정된 모든 샘플을 선택합니다.

그런 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 Recount 및 Suggested Size를 선택합니다. 이렇게 하면 제안된 최소 입자 면적을 가진 이미지가 다시 표시됩니다. 그런 다음 다시 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 플롯 표시를 선택합니다.

이상적인 이미지에는 긴 오른쪽 꼬리 정규 분포와 유사한 그래프가 있습니다. 필요한 경우 샘플을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 다음 다시 계산하기 및 수동 설정을 선택하여 더 낮은 크기 범위 또는 RGB 임계값 설정을 조정합니다. 그런 다음 원하는 설정을 입력하고 개수를 클릭하여 이미지를 다시 계산합니다.

개수를 수동으로 조정하려면 샘플을 선택하고 테이블을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 개수가 있는 이미지 열기를 선택합니다. 원본 이미지는 플러그인에 의해 계수된 각 입자를 나타내는 빨간색 표시로 열립니다. 또한 Show counted binary image 옵션을 사용하여 색상 임계값에 의해 개별 셀이 얼마나 잘 분리되고 있는지 확인할 수 있습니다.

카운트를 수동으로 추가하려면 컨트롤 키를 누른 상태에서 마우스 왼쪽 버튼을 클릭합니다. 이렇게 하면 커서 위치에 마커가 추가되어 총 개수에 추가됩니다. 마커를 수동으로 제거하려면 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하면 플러그인이 커서에 가장 가까운 마커를 제거합니다.

마커 그룹을 제거하려면 관심 영역을 선택하고 Ctrl 키를 누른 상태에서 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 세포 농도 계산기의 프로세스는 p-square 보정 이미지와 p-square 길이 및 픽셀 계산에 따라 달라집니다. 혈구계의 p-square는 100나노리터의 부피를 가지며 이 상수를 감안할 때 픽셀을 밀리미터로 변환한 후 총 이미지 볼륨을 계산할 수 있습니다.

다양한 실험 및 세포 유형에서 얻은 57개 이상의 이미지에 대한 수동 및 자동 계수를 비교한 결과, 두 방법 간에 매우 밀접한 상관 관계가 있음을 알 수 있습니다. 밀리리터당 500만에서 2,000개 사이의 농도는 자동화된 프로세스를 사용하여 정확하게 계산되었습니다. 메트릭 Q는 뚜렷한 입자 크기의 분포를 기반으로 한 전체 이미지 선명도를 나타냅니다.

적절한 Q는 0.5보다 큽니다. 밝기 및 배경 노이즈와 관련하여 보통에서 우수한 이미지 선택에 이러한 한정자를 적용하면 보정된 이미지 수는 보정되지 않은 이미지 수보다 수동 수에 훨씬 더 가까웠습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 CCC 및 TC ImageJ 플러그인을 사용하여 현탁액 및 세포 운동성 분석에서 세포를 정확하고 효율적으로 계수하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

TC 플러그인이 마스터되면 세포 수의 수집, 정량화 및 조정이 한 시간 이내에 이루어질 수 있습니다. 두 플러그인 모두 ImageJ의 입자 계수 기능에 의존하며 ImageJ에서 사용하는 매크로를 편집하여 수정할 수 있습니다. 이는 사용자가 플러그인의 범위를 다른 파티클로 확장할 수 있는 더 큰 유연성을 제공합니다.