Summary
Questo protocollo presenta un metodo per il recupero morfologica dei neuroni rattoppati durante le registrazioni elettrofisiologiche utilizzando riempimento biocitina e successiva postprocessing immunoistochimica. Abbiamo dimostrato che spesse sezioni biocitina-riempita che erano macchiate e coprioggetto possono essere ricolorate con un secondo giorni di anticorpi primari o mesi dopo.
Abstract
registrazioni elettrofisiologiche di cellule utilizzando la tecnica del patch clamp hanno permesso l'identificazione di diversi tipi neuronali basate su modelli di cottura. L'inclusione di biocitina / neurobiotin nel elettrodo di registrazione permette il recupero post-hoc dei dettagli morfologici, che sono necessari per determinare la arborizzazione dendritiche e le regioni interessate dagli assoni dei neuroni registrati. Tuttavia, data la presenza di neuroni morfologicamente simili con identità distinte neurochimiche e funzioni, colorazione immunoistochimica per le proteine-specifica delle cellule-tipo è essenziale per identificare definitivamente i neuroni. Per mantenere la connettività di rete, sezioni di cervello per le registrazioni fisiologiche sono preparati ad uno spessore di 300 micron o superiore. Tuttavia, questo spessore spesso ostacola la post-elaborazione immunoistologiche causa di problemi con la penetrazione degli anticorpi, che richiede la resezione del tessuto. Resezione di fette è un'arte difficile, spesso Resulting nella perdita di tessuto e la morfologia delle cellule da cui sono stati ottenuti i dati elettrofisiologici, rendendo i dati inutilizzabili. Poiché il recupero della morfologia limiterebbe perdita di dati e guida nella scelta dei marcatori neuronali, abbiamo adottato una strategia di recuperare morfologia cellulare prima, seguita da immunocolorazione secondaria. Introduciamo un approccio pratico per biocitina riempimento durante le registrazioni fisiologiche e successiva immunostaining seriale per il recupero di morfologia, seguita dalla restaining delle sezioni per determinare l'identità neurochimico. Si segnala che le sezioni che erano pieni di biocitina, fissate con paraformaldeide (PFA), macchiati, e coprioggetto possono essere rimossi e ricolorate con un secondo anticorpo primario giorni successivi. Questo restaining comporta la rimozione del vetrino, il lavaggio delle sezioni in una soluzione tampone, e l'incubazione di anticorpi primari e secondari per rivelare l'identità neurochimico. Il metodo è vantaggioso per eliminare datuna perdita a causa di una incapacità di recuperare la morfologia e per restringendo i marcatori neurochimici da sottoporre a test sulla base di morfologia.
Introduction
Il cervello è noto per la diversità nelle caratteristiche strutturali e funzionali dei singoli elementi neuronali. La comprensione dei ruoli di tipi neuronali distinti in funzione del cervello e patologia richiede caratterizzazione e identificazione univoca dei neuroni. Strutturalmente, le caratteristiche morfologiche definite dalla posizione somato-dendritiche determinare il potenziale di input che riceve un dato neurone, mentre il modello di arborization assonale identifica potenziali obiettivi post-sinaptici. La diversità strutturale dei neuroni è stato apprezzato fin dai tempi di seminali studi istologici di Ramon y Cajal 1. L'avvento di tecniche di registrazione unicellulari ha rivelato che i neuroni strutturalmente distinti mostrano anche differenze nei modelli di cottura e le caratteristiche sinaptiche. La diversità nella struttura e la fisiologia è particolarmente evidente nei neuroni inibitori GABAergici 2,3. Inoltre, è diventato sempre più evidente che strutturalmentey neuroni simili possono esprimere diversi marcatori neurochimici e spettacolo corrispondenti differenze funzionali 4. Analogamente, neuroni con gli stessi marcatori neurochimici possono avere strutture e funzioni 5-10 distinte. Pertanto, in pratica, l'analisi delle caratteristiche funzionali dei neuroni e il loro ruolo nella rete comporta che definisce sia le identità morfologici e neurochimici. Anche con l'avvento di linee di topo giornalista targeting specifici marcatori neurochimici, spesso è necessario determinare la morfologia e all'identità sottotipo basato su immunoistologia 11.
Il metodo standard utilizzato per caratterizzare le cellule registrati in fettine di cervello acuto è di riempirli con biocitina o neurobiotin durante la registrazione, fissare le sezioni in paraformaldeide (PFA) seguendo le registrazioni, e utilizzare immunoistochimica per rivelare la morfologia e la neurochimica. Dal momento che lo spessore delle sezioni per fetta fisiologia sono in genere a 300 microno più, e perché la maggior parte degli anticorpi non riescono a penetrare fino in quella profondità, le fette devono essere ri-sezionato a 60 micron o meno per consentire immunostaining simultaneo per biocitina e marcatori neurochimici 12-14. Purtroppo, resezione è laboriosa; rischia la perdita di tessuto durante il sezionamento; e può portare a differenziale restringimento dei tessuti, complicando ricostruzioni morfologiche. Inoltre, la conoscenza preventiva della morfologia potrebbe aiutare a restringere i marcatori candidati che sono suscettibili di essere espressa dalle cellule. Abbiamo modificato i protocolli biocitina Immunoistologia standard per consentire l'elaborazione seriale sezioni prima per il recupero della morfologia e poi per l'identificazione di potenziali marcatori neurochimici.
Immunoistochimica è lo studio della distribuzione dell'antigene nei tessuti o cellule e possono essere visualizzati con un enzima, etichette fluorescenti, elementi radioattivi, o particelle colloidali in oro 15. La Proceduranvolves utilizzando anticorpi primari per etichettare specificamente e amplificare uno o più specifici antigeni, seguito dall'uso di anticorpi secondari fluorescenti rivolte l'anticorpo primario per la visualizzazione. A causa della necessità di distinguere gli spettri di fluorescenza di ciascun anticorpo secondario senza sovrapposizione, solo un numero limitato di antigeni può essere esaminato contemporaneamente. Così, la conoscenza preventiva della morfologia potrebbe essere utile nella scelta dei candidati marcatori neurochimici per la classificazione delle cellule. Concettualmente, la logica alla base di elaborazione di serie di sezioni già colorate si basa sulla premessa che immunomarcatura per una proteina o peptide non dovrebbe interferire con antigenicità e successiva immunomarcatura per un peptide strutturalmente indipendente 16. Questa mancanza di interferenza è dovuta al legame di anticorpi ad un specifico epitopo della proteina su un antigene e consente la colorazione simultanea di più antigeni nello stesso tessuto conseguenza. Il numero di antigeni Revealed mediante immunocolorazione è limitata dalla necessità di spettri non sovrapposizione degli anticorpi secondari fluorescenti e dalla necessità di indirizzare i singoli antigeni con anticorpi in specie diverse in modo da eliminare reattività crociata 17,18. Mentre questo è il ragionamento che sta dietro l'etichettatura di serie, piuttosto che simultaneamente con due anticorpi distinte che possono interagire, a nostra conoscenza, immunocolorazione per un secondo l'antigene non è stata riportata dopo il completamento del immunomarcatura per uno o più antigeni sulle sezioni montate. Qui, descriviamo un metodo per immunocolorazione serie di sezioni precedentemente colorate e montati. Mentre dettaglio questo processo per una procedura immunomarcatura seriale per il recupero della morfologia seguita dalla colorazione per i marcatori di proteine / peptidi in sezioni spesse, le stesse procedure possono essere utilizzati in serie, sottili sezioni istologiche pure. Inoltre, si descrive un approccio pratico per riempire neuroni registrati con biocitina e il processo per rimuovere laelettrodo dalla cella al termine di registrazioni per ottimizzare il riempimento del assonale e arbors dendritiche di neuroni, come presentato nel nostro recente 6,8 lavoro.
Il vantaggio più importante del procedimento qui descritto è che la morfologia della cellula registrato può essere completamente recuperato e ripreso prima di tentare di resezione o immunostain le fette. Anche se possono rendere necessario fette di resezione per immunostaining secondaria problemi con la penetrazione di alcuni anticorpi, le procedure descritte qui eliminerebbe la necessità di ricostruire i neuroni complessi da più sezioni e sarebbe evitare problemi dovuti alla perdita di tessuto ed il restringimento del differenziale, che possono compromettere la ricostruzione dopo resezione. Un ulteriore vantaggio è che il processo sarà ridurre i costi, tempo, fatica, e gli anticorpi costosi limitando immunoistochimica e ri-sezionamento a fette in cui vengono recuperati i neuroni biocitina-riempita. L'aspetto più pratico è la pubblicitàimmunostaining dizionale che può essere eseguita su sezioni colorate mesi prima di utilizzare la tecnica di cui sopra. In particolare, il recupero della morfologia ridurrebbe considerevolmente il potenziale che i dati fisiologici dalle cellule vengono scartati a causa dell'impossibilità di ottenere una caratterizzazione morfologica di base del tipo di cellula.
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Protocol
1. riempimento biocitina durante Elettrofisiologia
NOTA: I lettori possono fare riferimento a fonti alternative per le tecniche di base di patch-clamp registrazione e strumentazione 19-22, che non sono elaborati su qui. I passi descritti qui si presuppone che l'apparecchiatura e le procedure per le registrazioni di patch-clamp sono già stabiliti, e la descrizione saranno limitati ai dettagli relativi alla biocitina-riempimento e immunocolorazione post-hoc. Tutti gli esperimenti descritti in questo manoscritto sono stati eseguiti su ratti.
- Utilizzando un vibratomo, preparare sezioni di cervello vivi della regione desiderata in uno spessore 300 - 350 micron 23.
- Preparare una soluzione interna contenente 0,2% biocitina con l'aggiunta di 2 mg di biocitina a 1 ml di soluzione interna 6. Per ottenere risultati ottimali, sonicare la soluzione interna per 10 - 15 minuti fino a quando la biocitina scioglie completamente. Successivamente, caricare la soluzione interna in una siringa da 1 ml con 0,2 &# 160; micron pori del filtro dimensione polipropilene punta attaccato ad un microloader. Tenere questo loading siringa su un impacco freddo per mantenere la stabilità del Mg-ATP e Na-GTP nella soluzione interna.
NOTA: Una gluconato di potassio soluzione interna contenente (126 mM K-gluconato, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP, e 10 mM fosfocreatina) è ottimale per il recupero di alcuni marcatori neurochimici, compresi parvalbumina, durante immunomarcatura. Nella nostra esperienza, utilizzando cesium- e delle soluzioni interne basate cloruri riduce la capacità di recuperare immunocolorazione per alcuni marcatori neurochimici. Neurobiotin o, risolvibile, tracciante polare cellule impermeant combinando un Alexa Fluoroforo con biocitina possono essere utilizzati come alternativa al biocitina. - Sotto infrarossi contrasto interferenziale differenziale, visualizzare la cella appropriata per la registrazione. Per minimizzare le perturbazioni dell'assone, avvicinarsi al corpo cellulare abbassando la pipetta lungo il suo asse mediante il "metodo" funzione disponibile nella maggior parte dei micromanipolatori. Stabilire registrazioni cellule intere sotto differenziale a raggi infrarossi contrasto interferenziale utilizzando protocolli fisiologia patch-clamp 19-22.
NOTA: Evitare avvicina la cella dalla direzione dell'assone putativo, come sarà recidere l'assone, visualizzato come una bozza al fine taglio (freccia verde in figura 1). Inoltre, evitare di applicare l'alta pressione positiva alla pipetta di registrazione mentre si avvicina alla cella di ridurre al minimo la fuoriuscita di biocitina, che si tradurrà in background ad alto colorazione.
Figura 1. suggerito aereo per l'avvicinamento cellule per biocitina riempimenti. L'immagine illustra una cella granuli (GC) riempire con biocitina durante la registrazione che è stato elaborato per rivelare biocitina (in rosso con streptavidina 594-coniugato). Il GC ha i suoi dendriti orientati nel piano XY. Si noti la cella di granuli recisoassone (freccia verde) dovute al movimento pipetta lungo il piano XY. Si noti che è ideale per avvicinarsi a questo neurone lungo il piano XZ. barra della scala: 50 micron.
- Nella configurazione morsetto di tensione, determinare la capacità whole-cell e resistenza serie in risposta a piccolo (5 mV), breve (30 ms) di isolamento procedura utilizzando il utilizzando la funzione di test a membrana in modalità bagno in un acquisizione dati elettrofisiologia e software di analisi. Ciò garantirà la creazione di condizioni di registrazione a cellule per consentire biocitina riempimento.
- Condurre registrazioni fisiologiche in modalità sia current- o tensione-clamp, se necessario. Un tempo minimo di registrazione> 10 min a 34 ° C è ideale.
NOTA: più lunghi tempi di registrazione possono essere necessari per gli studi eseguiti a temperatura ambiente. - Al termine delle registrazioni fisiologiche, ristabilire la configurazione patch-clamp muovendo lentamente la pipetta di registrazione a piccoli passi, alternando alto (lungo l'asse Z) everso l'esterno (lungo l'asse X) in modo tensione-clamp.
- Contemporaneamente monitorare la resistenza capacità e di ingresso utilizzando la funzione di "test a membrana" per visualizzare la perdita di transienti capacitivi e il crollo delle risposte attuali a una linea retta, che indica la ri-sigillatura della cella e la creazione di un fuori-uscita rattoppare sulla punta della pipetta. Tenendo il cellulare ad un potenziale depolarizzata (-40 mV) faciliterà il processo di ri-sigillatura.
NOTA: Questa procedura per la rimozione di una cella assicura tipicamente il completo recupero del soma e dendriti. Non applicare pressione positiva alla pipetta registrazione durante questa procedura o mentre staccando la cella dalla pipetta. Visualizzazione della soma della cellula registrata nella fetta indica disimpegno successo. La presenza di detriti cellulari o di una patch membrana all'estremità della punta distaccata indica tipicamente dislocazione del soma e non produrrà completa morfologia cellulare. - A poppaer staccare la pipetta dalla cella, mantenere la fetta nella camera di registrazione da 3 - 5 minuti per assicurare il trasporto del colorante dendritica distale e processi assonale.
- Trasferire le fettine di un 24-pozzetti contenente 4% PFA per il fissaggio.
ATTENZIONE: PFA è cancerogeno, e dispositivi di protezione adeguati, compresi i guanti e una mascherina, deve essere utilizzato per evitare l'irritazione della pelle e l'inalazione. PFA è infiammabile e deve essere tenuto fuori dalla portata di fuoco. PFA non è mai smaltiti nello scarico e deve essere raccolto come rifiuti chimici. PFA fissazione deve essere isolato dalle aree utilizzate per la preparazione fetta vivo per evitare la contaminazione del setup fisiologia, tra pipette. - 24 - 48 ore dopo la fissazione in PFA, trasferire le fette di 0,1 Saline M fosfato-tamponata (PBS) per lo stoccaggio prima dell'immunocolorazione.
NOTA: Idealmente, biocitina recupero e immunostaining sono meglio se effettuata subito dopo la fissazione, anche se per la colorazione formata entro 7 d dei rendimenti di fissaggio buoni risultati. Fette possono essere mantenuti in PBS con 0,02 - sodio azide 0,05% per la colorazione eseguita fino ad oltre 90 giorni dopo la fissazione. Sebbene fissaggio notte in PFA funziona bene per la maggior parte degli anticorpi, è possibile che alcuni anticorpi funzionano meglio quando la durata dell'incubazione nel fissativo è ridotta. Fissazione in PFA per oltre 48 ore riduce la disponibilità di antigeni e diminuisce le probabilità di successo immunostaining secondario per i marcatori neurochimici.
ATTENZIONE: Il sodio azide è estremamente pericolosa e irritante al contatto con la pelle o con gli occhi o su ingestione o inalazione. Grave sovraesposizione può causare la morte. La cancerogenicità e mutagenicità del composto non sono noti. Utilizzare dispositivi di protezione adeguati compresi guanti, occhiali antispruzzo, un camice da laboratorio, e un respiratore polvere. La sodio azide è mai smaltiti nello scarico e deve essere raccolto come rifiuti chimici.
(Giorno 1)
NOTA: La seguente procedura immunocolorazione è per le sezioni free-floating e richiede agitazione continua a bassa velocità (2 giri / min, rpm) su un agitatore per tutte le fasi di incubazione.
- Lavare 3x tessuto per 10 minuti ciascuno in PBS 0,1 M (pH = 7,4).
NOTA: 0,1 M PBS può essere commercialmente acquistato o realizzato in laboratorio come segue (fa 1 L): 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na 2 HPO 4, e 0,24 g di KH 2 PO 4 in 1 L di dH 2 0.
NOTA: Se il marker neurochimici desiderato è noto, la colorazione per una proteina / peptide può essere effettuata contemporaneamente alla biocitina colorazione (passi 2,2-2,4). Se la colorazione per biocitina solo, passare al punto 2.5. - OPTIONAL: blocco con 10% siero di blocco (BS; siero di capra normale (NGS) diluito in 0,3% Triton X-100 in PBS per 1 ora a RT).
NOTA: Ogni bene dovrebbericevere lo stesso volume della soluzione; il volume consigliato è tra i 250 - 500 microlitri / pozzetto. La selezione del siero di blocco si basa sulla specie nelle quali vengono sollevate gli anticorpi secondari (ad esempio, NGS è utilizzato per tinture capra coniugato anti- (specie corrispondenti anticorpo primario)). In caso di necessità di utilizzare anticorpi secondari sollevati in diverse specie immunostain sezioni, comprendono il 10% di ciascun siero normale nel bloccare stadio (2) e 3% di ciascun siero normale per i passaggi di incubazione anticorpi primari e secondari. - (FACOLTATIVO) Incubare le sezioni in anticorpo primario, CB 1 R (policlonale, cavia) con 0,3% Triton X-100, e il 3% in BS 0,1 M PBS a RT O / N. CB 1 R viene utilizzato per identificare cannabinoidi recettore di tipo 1 di espressione.
NOTA: questo passaggio è facoltativo e non necessario per rivelare il ripieno biocitina. La figura 2 illustra una sezione denominata per biocitina e CB 1 R durante il primo processo di colorazione. O / N incubation a RT è sufficiente per la maggior parte degli anticorpi primari; tuttavia, alcuni anticorpi primari, comprese CB 1 R, richiedono 3 - 5 d dell'incubazione. Se l'incubazione deve essere superiore a 1 d, si raccomanda di incubare a 4 ° C perché Triton X-100 può permeabilize fette e può portare alla disintegrazione del tessuto durante l'incubazione prolungata a temperatura ambiente. Includere un controllo negativo privo anticorpo primario in almeno una sezione per ogni serie di esperimenti come controllo per la specificità dell'anticorpo secondario. Per controlli negativi, l'anticorpo primario viene omesso, ma si aggiungono 0,3% Triton X-100 in PBS 0,1 M e BS.
Figura 2. Il successo CCK colorazione 1 settimana dopo il recupero di biocitina colorazione e C annabinoid recettore di tipo 1 (CB 1 R) - <strong> etichettatura. (A - C) immagini confocale a 60X mostrano il neurone biocitina-riempita (A) e CB 1 R immunoreattività (B), indicato dalla freccia. La stessa sezione è stato elaborato per CCK immunocolorazione dopo 1 settimana (C). La sovrapposizione delle immagini è mostrato in D. CCK immunoreattività è stato rivelato con estrema rosso ed è stato pseudo-colorato in ciano. (E) la ricostruzione morfologica della cellula biocitina pieno in A. Si noti che il biocitina e CB 1 R colorazione sono evidenti anche dopo la seconda immunocolorazione CCK. Da notare anche la distribuzione prevista di CB 1 R e modelli di immunoistochimica CCK. (F - H) immagine ingrandita della assone dalla cella, come in A, spettacolo stretta co-localizzazione di biocitina e CB 1 R a assoni (punte di freccia). Barra della scala: 50 micron (A - D), 100 micron (E), e 10 micron (
(Giorno 2)
- Lavare il cervello sezioni 3x per 10 minuti ciascuno in 0,1 M PBS (pH = 7.4).
- Incubare le sezioni in streptavidina coniugato con colorante rosso (concentrazione: 1: 1.000; eccitazione: 594 nm con emissione nello spettro visibile rosso) con 0,3% Triton X-100 e 3% BS in 0.1 M PBS a 4 ° CO / N nel scuro (avvolto in un foglio di alluminio) per rivelare il biocitina. OPTIONAL: Includere un anticorpo secondario, capra porcellino d'India anti-(concentrazione: 1: 500; eccitazione: 488 nm ed emissione in verde), con l'incubazione di cui sopra, se a seguito di incubazione primaria opzionale al punto 2.3.
NOTA: Anticorpo secondario sarà necessario solo se viene eseguita la colorazione anticorpo primario opzionale (passo 2.3). Per visualizzare biocitina, un streSi raccomanda coniugato ptavidin-fluoroforo con uno spettro di emissione in rosso, in quanto aiuta a visualizzare gli assoni sottili in dettaglio e con una migliore contrasto (figure 1 - 3). Durante immunostaining doppia o tripla, al fine di evitare la cross-reattività di anticorpi secondari con l'altro, aggiungere anticorpi secondari uno dopo l'altro in modo seriale (2 h intervallo tra le aggiunte seriali degli anticorpi è sufficiente). La figura 3A illustra una cella biocitina pieno elaborati senza l'opzionale colorazione anticorpo primario e ripreso prima resezione.
Figura 3. Il successo secondo Immunocolorazione a seguito della ripresa di biocitina Morfologia e resezione. (A1) confocale immagine di una fetta di 300 micron che mostra il recupero della morfologia dendritica di una cella biocitina-riempita. (<strong> A2) tracce di tensione membrana del neurone in risposta a +500 e -100 pA iniezioni di corrente. (B) Il recupero del soma biocitina pieno in una sezione di 50 micron ottenuto dopo resezione della sezione 300 micron (in A1) dopo il montaggio e l'imaging. (B2) immunocolorazione successiva della sezione sottile rivelato colocalization del soma biocitina-riempita (pannello di destra) con CCK (pannello centrale). L'immagine fusa è illustrato nel pannello di destra. barra della scala: 50 micron. Pannello di A2 è riprodotto con il permesso di Yu et al. , In corso di stampa 25. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
(3 ° giorno)
- sezioni di cervello Lavare 3x per 10 minuti ciascuno in 0,1 M PBS (pH = 7.4).
- Per proteggere la fluorescenza e per facilitare la nuova colorazione in futuro, montare il seczioni in un mezzo di montaggio a base acquosa e sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente.
NOTA: E 'meglio restain sezioni più presto possibile per evitare difficoltà nel rimuovere lo smalto dalla diapositiva, muffa infestazione, e la disidratazione dei tessuti a causa di perdite della soluzione di montaggio dal vetrino. La contaminazione microbica può essere evitato utilizzando lo 0,02% di sodio azide in PBS.
ATTENZIONE: Sodio azide è altamente tossico e infiammabile quando è in contatto con l'acqua. Si prega di fare riferimento alle procedure operative standard per la manipolazione e lo smaltimento di sostanze chimiche pericolose.
(Giorni 4 - 7) - Eseguire confocale con eccitazione a 594 e 488 nm e con un ingrandimento di 20X o 40X per rivelare i neuroni biocitina e indimenticabile a indicatori rossi e neurochimici (CB 1 R) in verde. Valutare colabeling (Figura 2).
- Impostare la esposizione della fotocamera per meno di 100 ms per evitare photobleaching e obtain pile di immagini confocali dei mandrini assonale e dendritiche dell'intero neurone. Utilizzare pile di immagini confocale e neurone tracciamento pacchetti software per ricostruire la morfologia neuronale.
3. La colorazione del secondo anticorpo primario
NOTA: Mentre il secondo passo immunocolorazione può essere eseguita 90 d dopo la prima colorazione, colorazione ottimale si ottiene quando il secondo colorazione anticorpo primario viene eseguita nei 7 - 10 d.
(Dopo 7-90 d)
- Applicare acetone per un batuffolo di cotone e spogliare lo smalto off del vetrino.
- Rimuovere il vetrino con cura utilizzando una pinza sottile-punta e mettere un paio di gocce di 0,1 M PBS sulle sezioni.
- Rimuovere con attenzione le sezioni dal vetrino utilizzando un pennello fine e lavarli in 0,1 M PBS per 24 - 48 h su un agitatore ricoperto di un foglio di alluminio in condizioni di scarsa luce a 4 ° C.
NOTA: E 'fondamentale per coprire le sezioni con unstagnola luminum per evitare photobleaching. - Per garantire la completa rimozione del mezzo di montaggio, lavare sezioni 1 - 2x il giorno successivo in 0.1 M PBS per 10 minuti ciascuno.
- Procedere con incubazione nel secondo anticorpo primario (ad esempio, colecistochinina, un neuropeptide presente in alcuni interneuroni GABAergici (CCK; concentrazione: 1: 1.000; anticorpi monoclonali di topo)) per 1 d (Figura 2).
NOTA: Questa procedura è simile al punto 2.3, ma utilizza un anticorpo diverso. Inoltre, la fase di bloccaggio viene omesso durante ri-colorazione. - Lavare le sezioni di cervello tre volte per 10 minuti ciascuno in 0.1 M PBS (pH = 7,4).
- Macchia con l'anticorpo secondario di capra anti-topo fluoroforo coniugato (concentrazione: 1: 500; eccitazione lunghezza d'onda: 647 nm), facendo in modo che gli spettri di eccitazione-emissione della anticorpo secondario non si sovrappongono con streptavidina (concentrazione: 1: 1.000; eccitazione lunghezza d'onda: 594 nm) e prima immunofluorescenzamacchie.
- Montare le sezioni in mezzo di montaggio acquoso e sigillare i bordi del vetrino con smalto trasparente.
NOTA: Salva le sezioni a 4 ° C in un bauletto opaca per proteggere la fluorescenza.
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Representative Results
In caso di superamento, sezioni mantengono il riempimento biocitina e il immunomarcatura eseguite nella fase 2 e può essere ripreso con confocale o epifluorescenza. Inoltre, sezioni trasformati mostrerà anche immunostaining per l'antigene marcato durante la successiva trasformazione nel passaggio 3. Nella sezione illustrata nella figura 2, la morfologia di un neurone biocitina pieno in una sezione di spessore (300 micron) è stato rivelato utilizzando streptavidina visualizzati in rosso e il primo primario (CB 1 R) visualizzati in verde. Il primo immunocolorazione è stata effettuata entro 7 d di PFA fissazione. La fetta è stato montato in un mezzo di montaggio acquoso, ripreso con un microscopio confocale, e immagazzinato per un periodo di due mesi prima di ri-colorazione per l'anticorpo CCK. Nota la morfologia del neurone registrati, comprese mandrini assonale (Figura 2E), è stato ricostruito dalle immagini confocali obtained dopo la prima procedura di colorazione. Colocalizzazione dell'assone con CB 1 R immunoreattività (Figura 2 F - H) è stato previsto sulla base di studi fisiologici. La seconda colorazione per CCK è stata eseguita su sezioni due mesi dopo la prima procedura di colorazione. CCK è stato ripreso nel lontano-rosso ed è stato pseudo-colorato in ciano per la visualizzazione. Analogamente, la figura 3 illustra un esempio di una cella in cui biocitina etichettatura è stato rivelato e ripreso in una sezione di spessore (Figura 3A1). La fisiologia intrinseca del neurone è illustrato in Figura 3A2. La fetta è stato ri-sezionato a 50 micron e, anche se alcune sezioni contenenti processi dendritiche sono stati persi, la sezione contenente il soma recuperato (Figura 3B1). La successiva CCK immunocolorazione della sezione sottile ha mostrato espressione CCK nel verde nel soma biocitina marcato. Montaggio della fetta spessa in un mezzo acquoso impedisce erestringimento del tessuto xcessive. In media, sezioni 300 micron montati usando il mezzo acquoso ridursi di circa 25,67 ± 3,14% (n = 5 fette), misurata una settimana dopo il montaggio. Così, le sezioni spesse montati usando il mezzo acquoso sono ~ 225 micron, consentendo resezione. In diversi studi di controllo, è stato confermato che il processo di immunomarcatura per la seconda volta non ha portato a marcatura non specifica l'anticorpo. Ad esempio, è noto che parvalbumina (PV) e CCK immunoreattività sono mutuamente esclusive nei neuroni ippocampali. Controlli in cui il primo passo immunomarcatura (2) per biocitina (rosso) e CCK (verde) è stata seguita dal secondo di etichettatura per parvalbumina (con eccitazione a 405 nm ed emissione in blu) hanno mostrato pattern di espressione non sovrapposti (Figura 4). Inoltre, i distintivi laminare assonale pattern di colorazione dei neuroni che esprimono specifici marcatori neurochimici (PV, CCK, CB 1 R) non sono stati alterati dalla Seriaprocedure l ri-colorazione (figure 2 - 4). Inoltre, la colorazione secondario costantemente rivelato co-etichettatura dei neuroni biocitina-riempita con i marcatori neurochimici attesi sulla base delle registrazioni fisiologiche. Così, siamo fiduciosi che la procedura restaining non comporta la perdita di specificità in materia di etichettatura.
Figura 4. La mancanza di sovrapposizione tra i marcatori si esclude reciprocamente sulla seconda Immunocolorazione seguito Immunocolorazione Priore e di montaggio delle sezioni. (A - C) immagini confocale a 10X mostra un neurone biocitina-riempita (A) in rosso, indicato da una freccia, e CCK immunoreattività in verde (B), indicato dalla freccia. Nota la mancanza di sovrapposizione. La stessa sezione è stato elaborato per parvalbumina (PV) immunocolorazione in azzurro dopo più di 2 mesi (C). l'overlay delle immagini è mostrato in D. Si noti che gli assoni fotovoltaici sono distribuiti in strato cellulare granuli, con CCK nello strato molecolare nel modello non sovrapposte previsto. Da notare anche la mancanza di colocalizzazione dei due marcatori in somata neuronale. Le immagini ingrandite a destra illustrano che il neurone biocitina marcato esprime PV (punta di freccia) e non CCK (freccia). Barra della scala: 100 micron (A - D), 20 micron (pannelli a destra). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Un motivo comune per biocitina sub-ottimale riempie è la rottura accidentale dei processi neuronali con la pipetta di registrazione mentre si avvicina alla cella. Una appendice perduto della cella appare come una bozza di biocitina alla fine di un assone, come illustrato in figura 1 (freccia verde). Assonale blebs unri spesso visualizzato quando patching cellule superficiali, la cui assoni siano separabili durante le procedure di taglio. Tuttavia, l'ottimizzazione del piano di tranciatura e la conoscenza del modello di distribuzione assonale della classe cellula bersaglio può aiutare ad evitare avvicina soma dalla direzione dell'assone putativo, che può anche separare l'assone, con conseguente comparsa di una vescichetta assonale . Nella maggior parte dei tipi di cellule, è preferibile avvicinarsi al corpo cellulare lungo l'asse Z (freccia bianca con punto). Un secondo problema riguarda l'applicazione di eccessiva pressione positiva alla pipetta mentre si avvicina alla cella. Questo non solo può danneggiare la cellula e le sue connessioni ma provoca anche la soluzione interna contenente biocitina versare intorno alla cella, portando a sfondo ad alta fluorescenza. Sfondo colorazione aumenta anche quando il tempo necessario per avvicinarsi alla cella viene prolungato o quando la qualità fetta non è ottimale, che può compromettere la capacità di definire morfologia cellulare (Figura 5A). E 'possibile estrarre la soma fuori mentre sloggiare la pipetta. Questo si tradurrà in una mancanza di morfologia somatica (Figura 5B). Per evitare di tirare fuori la cella, spostare la pipetta e fuori a piccoli passi utilizzando le impostazioni di movimento "fine" del manipolatore. Se sembra essere attaccato alla pipetta attraverso l'estensione lunga della membrana, toccare / flick il manipolatore della cellula delicatamente per rimuovere la pipetta dalla cella. Evitare di utilizzare le impostazioni manipolatore grossolana fino a quando la cella è completamente staccato.
Figura 5. Immagini illustrano senza successo biocitina riempimenti. (A) Immagine che mostra alta fluorescenza di fondo a causa di un'eccessiva pressione positiva nella pipetta di registrazione, con conseguente scarsa visibilità cellule. strutture più sottili di processi neuronali, tra cui gli assoni, sono visualizzate al di là della regione di The fuoriuscita. Inoltre, si noti che il soma è stato tirato fuori. (B) Un neurone con il soma tirato fuori durante la pipetta distacco. Le frecce indicano riempimenti di successo del assoni e dendriti, mentre il soma e appendici prossimale alle frecce non sono stati recuperati. (C) Una cella patch in uno strato superficiale della fetta (<50 micron dalla superficie) si traduce in celle piene espositrici taglio assoni e dendriti (frecce). Si noti la bordatura (frecce) dei dendriti delle cellule dei granuli, che indica cattive condizioni di salute delle cellule (C). barra della scala: 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Infine, al fine di recuperare completa morfologia cellulare senza assoni o dendriti mozzate, è meglio indirizzare cellule> 50 micron profondità alla superficie della fetta. cellule superficiali possono avere processi che hannostato tagliato e può mancare la normale dotazione di ingressi sinaptici.
Gli errori più comuni nelle procedure restaining sono associati con la rimozione del vetrino e il recupero della sezione senza danneggiare il tessuto. Una seconda questione riguarda la penetrazione degli anticorpi in tessuto spesso, soprattutto quando incubate durante la notte. In molti casi, una migliore penetrazione è stato realizzato incubando nella anticorpo primario per 72 ore a 4 ° C in un agitatore orbitale collocato in una camera fredda. Sebbene ri-sezionando il tessuto è la procedura più efficace per garantire la penetrazione anticorpo, prolungando la durata dell'incubazione in anticorpo primario o aumentando la concentrazione di detersivo a 0,5 - 1% Triton-X100 può anche aiutare anticorpo penetrazione 24. Poiché la maggior parte dei neuroni registrati si trovano a 50 - 100 micron dalla superficie della sezione, troviamo che la colorazione delle sezioni spesse è sufficiente per etichettare biocitinasomata -filled o processi a questo livello. Tuttavia, si raccomanda che il grado di etichettatura anticorpo è controllato su ogni sezione prima di interpretare i risultati co-localizzazione negativi.
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Discussion
I passaggi critici all'interno del protocollo
Riempire la cella patchato con biocitina è il passo più importante per garantire il pieno recupero della morfologia. Per il recupero completo della cella, è essenziale selezionare un orientamento ottimale fetta di minimizzare la rottura dei processi durante affettatura. Questo orientamento può variare in base al tipo di circuito e la cella in esame. Quindi, è essenziale per dare il tempo sufficiente per la biocitina di diffondere ai dendriti e assoni. Alcuni coloranti, come neurobiotin, possono anche penetrare i neuroni accoppiati alla cella registrata attraverso giunzioni. La dimensione della punta della pipetta ha anche bisogno di essere ottimizzato, come il soma tende ad essere tirato fuori quando l'apertura è grande e biocitina carico è compromessa quando la punta della pipetta è troppo piccolo. Inoltre, procedure appropriate mentre disimpegno dalla modalità whole-cell sono essenziali per recuperare il soma. Dopo aver registrato per 24 ore, l'incubazione successivadelle fette in 4% PFA seguita da PBS assicura che la reticolazione dei tessuti è ridotta, che è critica per immunoistochimica. Stoccaggio delle fette a 4 ° C è fondamentale anche per mantenere l'integrità fetta. Tuttavia, lo stoccaggio prolungato in PFA riduce eventuale successo con le procedure di anticorpi-etichettatura. Ottimizzazione della concentrazione e della durata dell'incubazione anticorpo primario è importante, in quanto questi differiranno per anticorpi individuali, e alcuni anticorpi possono esigere da 3 - 5 d di incubazione per la migliore penetrazione nel tessuto spesso. Per garantire che le fette siano danneggiati prima della colorazione secondario anticorpo primario, è necessaria un'adeguata attenzione durante la rimozione del vetrino.
Modifiche e risoluzione dei problemi
Abbiamo osservato che non c'è tempo impostato tra la prima e la seconda macchia. Le sezioni sono stati ri-macchiato mesi più tardi lo stesso tessuto e con più di una macchia. Ini nostri ultimi lavori, abbiamo confrontato le sezioni processati con il metodo ri-colorazione con quelli che utilizzano i protocolli di immunoistochimica standard e trovano nessuna differenza evidente nei modelli di marcatura o la robustezza di biocitina riempie 6,9,25,26.
Mentre resta da testare, è possibile che ri-colorazione può essere eseguita più di una volta, con l'integrità del tessuto essere un fattore limitante per la movimentazione ripetuta. La disponibilità di fluorofori discreti pone anche un limite per il numero di antigeni che possono essere visualizzate. Pertanto, si raccomanda un accurato trattamento del tessuto. Un ulteriore processo che deve ancora essere testato è restaining utilizzando protocolli di recupero di antigeni (per i recettori di superficie). Dal momento che l'integrità del tessuto viene mantenuto dopo la rimozione dal vetrino, ci aspettiamo che la procedura dovrebbe funzionare anche in colorazione protocolli che raccomandano l'antigene-recupero. A questo proposito, le registrazioni fisiologiche spesso producono le celle con Non sono noti marcatori neurochimici
LIMITI DELLA TECNICA
Una limitazione associata eseguendo colorazione immunoistochimica su sezioni spesse è la penetrazione insufficiente dell'anticorpo attraverso lo spessore totale della sezione, in particolare con incubazione overnight standard nel anticorpo primario. Inoltre, diversi anticorpi e streptavidina, utilizzati per rivelare biocitina, possono avere la penetrazione nei tessuti differenziale. Pertanto, si raccomanda che i collaudi vengono eseguiti per valutare la profondità di penetrazione di anticorpi e di modificare i tempi di incubazione, le temperature, e l'anticorpo e Triton & #160; X-100 concentrazioni, al fine di realizzare la penetrazione fetta ottimale e colorazione per ogni anticorpo. Va inoltre notato che l'etichettatura successo con un anticorpo o con streptavidina-biocitina non implica che un secondo anticorpo penetrerà alla stessa altezza della sezione. Pertanto, occorre prestare attenzione per verificare la penetrazione di ciascun anticorpo al livello al quale i processi cellulari biocitina marcati vengono esaminati per la co-localizzazione con il marcatore neurochimico. Se la penetrazione è insufficiente, la fetta può essere nuovamente diviso a <60 micron per immunocolorazione. Si noti, tuttavia, che poiché le fette sono stati già trattati per biocitina, la morfologia della cellula può essere catturata da confocale per eliminare la possibile perdita di dati anatomici durante il rientro sezionamento e per facilitare la ricostruzione neuronale. Mentre è possibile che le specie età e animali possono alterare il grado di penetrazione anticorpi, abbiamo utilizzato con successo tali procedure nei tessuti di ratto da 30-diurna e oltre 60 giorni di età ratti e nei topi.
Una seconda limitazione è che biocitina non è intrinsecamente fluorescenti e non può essere utilizzata per l'imaging dal vivo e caratterizzazione morfologica in tempo reale durante la registrazione. Fluorofori non coniugati alternativi e Lucifero giallo sono stati utilizzati per l'imaging dal vivo delle cellule 27. Essi non sono permanenti e perdono fluorescenza su fissaggio, rendendo impraticabile per l'identificazione post-hoc neurochimico del neurone registrato. Recentemente, fluorofori con biocitina sono stati introdotti per superare questa limitazione e può essere utilizzata per l'imaging in tempo reale, nonché per l'elaborazione post-hoc in doppio o triplo-etichettatura, come dettagliato qui. È interessante notare che, fino ad oggi, riempimenti biocitina hanno portato a migliori proprietà elettriche e di colorazione per studi elettrofisiologici e anatomici combinati rispetto a Lucifero giallo 28.
Importanza della tecnica in materia d 'esistente /Metodi alternativi
I principali vantaggi di utilizzare il protocollo dettagliato qui è che, a differenza di resezione, la struttura ei processi delle cellule biocitina pieno rimangono intatti e non comportano la perdita permanente di tessuto, né la necessità di ricostruzioni laboriose da più sezioni. Così, un riempimento unicellulare seguita da immunocitochimica può aiutare nella ricostruzione morfologica e l'identificazione di marcatori specifici neurochimici.
Le applicazioni future o Indicazioni Dopo aver imparato questa tecnica
In tutto, vi presentiamo un approccio pratico romanzo per il recupero della morfologia e post-hoc doppio e triplo immunomarcatura dei neuroni in seguito registrazioni elettrofisiologiche. Il procedimento è particolarmente vantaggioso per trovare nuovi marcatori come conoscenza evolve, neuroni rivalutare precedentemente riempiti, visualizzabili, e ripreso. È particolarmente vantaggioso perché tsi immunoistochimica può essere eseguita settimane o anche mesi dopo, risparmiando tessuti e anticorpi. Il metodo non richiede prodotti chimici speciali e può tranquillamente essere eseguita in qualsiasi laboratorio.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno da NIH / NINDS R01 NS069861 e NJCBIR CBIR14IRG024 di VS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Immunostaining |
| KCl | Fluka | 60129 | Immunostaining |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Immunostaining |
| KH2PO4 | Sigma | 229806 | Immunostaining |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Immunostaining |
| Guinea pig anti CB1 | Sigma | Af530-1 | Immunostaining |
| Mouse anti CCK | CURE, UCLA | courtesy of G. Ohning | Immunostaining |
| Rabbit anti Parvalbumin | Swant | PV27 | Immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor conjugate | Molecular Probes | S11227 | Immunostaining |
| Normal goat serum (NGS) | Sigma | G9023 | Immunostaining |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Immunostaining |
| Secondary Antibodies | Invitogen Molecular probes | Alexa Fluor conjugated dyes | Immunostaining |
| Labnet orbit low speed shaker | Bioexpress | S-2030-LS | Immunostaining |
| Forceps | Dumont | 11231-30 | Immunostaining |
| Slide folders | EMS | 71520 | Immunostaining |
| Vibratome VT 1200 S | Leica | 14048142066 | Electrophysiology |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular devices | Multiclamp 700B | Electrophysiology |
| pCLAMP 10 Software | Molecular devices | pCLAMP 10 | Electrophysiology |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440 digitizer | Electrophysiology |
| Filter tips | Nalgene | 171-0020 | Electrophysiology |
| Sonicator | Fisher Scientific | 15-335-100 | Electrophysiology |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 | Electrophysiology |
| Biocytin | Sigma | B4261 | Electrophysiology |
References
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