Summary
Denne protokollen presenterer en metode for den morfologiske gjenvinning av nerveceller lappet under elektrofysiologiske opptak ved hjelp biocytin fylling og etterfølgende immunhistokjemisk postprosessering. Vi viser at tykke biocytin fylte seksjoner som var farget og coverslipped kan restained med en andre primære antistoff dager eller måneder senere.
Abstract
Elektrofysiologiske registreringer av celler ved bruk av plasteret klemmen teknikk har gjort det mulig for identifisering av forskjellige neuronale typer basert på avfyring mønstre. Inkludering av biocytin / neurobiotin i innspillingen elektrode tillater post-hoc utvinning av morfologiske detaljer som er nødvendige for å avgjøre dendrittiske arborization og regionene målrettet av aksonene av de registrerte nevroner. Imidlertid, gitt nærvær av morfologisk liknende nerveceller med forskjellige nevrokjemiske identiteter og funksjoner, immunohistokjemisk farging av celletypespesifikke proteiner som er nødvendig for å identifisere definitivt neuroner. For å opprettholde nettverkstilkoblingen blir hjerne seksjoner for fysiologiske opptak fremstilt ved en tykkelse på 300 um eller større. Men denne tykkelsen hindrer ofte immunhistokjemi postprosessering på grunn av problemer med antistoff penetrasjon, nødvendiggjør resectioning av vevet. Resectioning skiver er en utfordrende kunst, ofte Resulting i tap av vev og morfologien av cellene fra hvilke elektrofysiologiske data ble oppnådd, slik at dataene ubrukelig. Siden utvinning av morfologi ville begrense tap av data og veiledning i valg av nevrale markører, har vi vedtatt en strategi for å utvinne celle morfologi først, etterfulgt av sekundær immunfarging. Vi introduserer en praktisk tilnærming til biocytin fylling under fysiologiske opptak og etterfølgende serie farging for utvinning av morfologi, etterfulgt av restaining seksjoner å bestemme nevrokjemiske identitet. Vi rapporterer at deler som var fylt med biocytin, faste med Paraformaldehyde (PFA), farget, og coverslipped kan fjernes og restained med en andre primære antistoff dager senere. Dette restaining omfatter fjerning av dekkglass, vasking av seksjoner i en bufferoppløsning, og inkubering av primære og sekundære antistoffer for å vise nevrokjemiske identiteten. Fremgangsmåten er fordelaktig for å eliminere datet tap på grunn av en manglende evne til å gjenopprette morfologi og for innsnevring ned nevrokjemiske markører som skal testes basert på morfologi.
Introduction
Hjernen er kjent for diversitet i de strukturelle og funksjonelle karakteristika for de enkelte neuronale elementer. Forstå rollene til forskjellige nevronale typer i hjernens funksjon og patologi krever karakterisering og entydig identifisering av nerveceller. Strukturelt, de morfologiske funksjoner definert av somato-dendrittiske plassering bestemme mulige innganger som en gitt nevron mottar, mens mønsteret av aksonal arborization identifiserer potensielle postsynaptiske mål. Det strukturelle mangfoldet av nevroner har blitt verdsatt siden dagene av Ramón y Cajal banebryt histologiske undersøkelser 1. Ankomsten av encellede opptak teknikker viste at strukturelt forskjellige neuroner viser også forskjeller i avfyringsmønster og synaptiske egenskaper. Mangfoldet i struktur og fysiologi er spesielt tydelig i gabaergic hemmende nerveceller 2,3. I tillegg har det blitt stadig klarere at strukturelty lignende nevroner kan uttrykke ulike nevrokjemiske markører og viser tilsvarende funksjonelle fire forskjeller. På samme måte kan nerveceller med samme nevrokjemiske markører har forskjellige strukturer og funksjoner 5-10. Således, i praksis, analysen av de funksjonelle egenskaper av nerveceller og deres rolle i nettverket medfører definerer både de morfologiske og neurokjemiske identiteter. Selv med bruk av reporter mus linjer rettet mot spesifikke nevrokjemiske markører, er det ofte nødvendig å bestemme morfologi og subtype identitet basert på immunohistologi 11.
Standarden metode som brukes for å karakterisere cellene innspilt i akutte hjerneskiver er å fylle dem med biocytin eller neurobiotin under innspillingen, fikse delene i paraformaldehyde (PFA) etter opptakene, og bruke immunhistokjemi å avsløre morfologi og neurochemistry. Siden tykkelsen av seksjonene for skive fysiologi er omkring 300 umeller mer, og fordi de fleste antistoffer som ikke klarer å trenge inn i hele veien gjennom den dybde, skivene må re-seksjonert til 60 um eller mindre for å muliggjøre samtidig farging for biocytin og nevrokjemiske markører 12-14. Dessverre er resectioning arbeidskrevende; risikerer tap av vev under seksjonering; og kan føre til differensial vev krymping, kompliserer morfologiske rekonstruksjoner. I tillegg kan forkunnskaper i morfologi å innskrenke søker markører som sannsynligvis vil bli uttrykt av cellene. Vi har modifisert standard biocytin immunohistologi protokoller for å tillate seriell behandling av delene først for gjenvinning av morfologi og deretter for identifisering av potensielle nevrokjemiske markører.
Immunhistokjemi er studiet av antigen fordeling i vev eller celler, og kan visualiseres ved hjelp av et enzym, fluorescerende markører, radioaktive elementer, eller gull kolloidpartikler 15. Fremgangsmåten involves ved hjelp av primære antistoffer for spesifikt å merke og forsterke en eller flere spesifikke antigener, etterfulgt av anvendelse av fluorescerende sekundære antistoffer målrettet mot det primære antistoff for visualisering. På grunn av behovet for å skille den fluorescens-spektrene for hvert sekundært antistoff uten overlapping, kan bare et begrenset antall antigener undersøkes samtidig. Således kan forhåndskjennskap til morfologi være nyttige i å velge kandidatnevrokjemiske markører for celle klassifisering. Konseptuelt, er begrunnelsen bak serie behandling av allerede farget seksjoner basert på premisset om at immunolabeling for ett protein eller peptid bør ikke forstyrre antigenisitet og påfølgende immunolabeling for et strukturelt uavhengig peptid 16. Denne mangel på interferens er på grunn av binding av antistoff mot et spesifikt protein epitop på et antigen, og derfor gjør det mulig for samtidig farging av multiple antigener i det samme vev. Antallet antigener revealed ved farging er begrenset av behovet for ikke-overlappende spektra av de fluorescerende sekundære antistoffer og av behovet for å målrette individuelle antigener med antistoffer dannet i forskjellige arter, slik som å eliminere kryssreaktivitet 17,18. Selv om dette er begrunnelsen bak serie stedet for samtidig merking med to forskjellige antistoffer som kan samhandle, til vår kunnskap, farging for en andre antigen har ikke blitt rapportert etter ferdigstillelse av immunolabeling for ett eller flere antigener på monterte deler. Her beskriver vi en metode for serie farging av tidligere beiset og montert seksjoner. Selv om vi detalj denne prosessen for en seriell immunolabeling fremgangsmåte for utvinning av morfologi, etterfulgt av farging for protein / peptid markører i tykke seksjoner, kan samme fremgangsmåte anvendes i standard, tynne histologiske snitt i tillegg. I tillegg beskriver vi en praktisk tilnærming til å fylle registrerte nevroner med biocytin og prosessen for å løsneelektrode fra cellen ved gjennomføring av opptak for å optimalisere fylling av aksonal og dendrittiske arbors av neuroner, som presentert i vår siste arbeid 6,8.
Det mest avgjørende fordel med fremgangsmåten som er beskrevet her er at morfologien til de registrerte celle kan være fullt gjenvinnes og avbildes før man forsøker å reseksjon eller immunfarging av skivene. Selv om problemer med inntrengning av visse antistoffer, kan gjøre det nødvendig å reseksjon skiver for sekundær immunofarging, vil prosedyrene som er beskrevet her eliminerer behovet for å rekonstruere komplekse nerveceller fra flere seksjoner og ville unngå problemer på grunn av vev tap og differensiert krymping, noe som kan kompromittere rekonstruksjon følgende resectioning. En ekstra fordel er at prosessen vil redusere kostnader, tid, krefter og dyre antistoffer ved å begrense farging og re-seksjonering til skiver der biocytin fylt nevroner utvinnes. Det mest praktiske aspektet er annonsennelle immunofarging som kan utføres på seksjonene farget måneder før bruk av den ovennevnte teknikk. Spesielt ville utvinning av morfologi betraktelig redusere potensialet som fysiologiske data fra cellene blir forkastet på grunn av en manglende evne til å oppnå en grunnleggende morfologisk karakterisering av celletype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Biocytin Fylling under Elektro
MERK: Leserne kan referere til alternative kilder for grunnleggende patch-clamp opptak teknikker og instrumentering 19-22, som ikke er utdypet her. Trinnene er beskrevet her anta at utstyr og prosedyrer for patch-clamp opptakene er allerede etablert, og beskrivelsen vil være begrenset til detaljer knyttet til biocytin-fylling og post-hoc farging. Alle forsøk beskrevet i dette manuskriptet ble utført på rotter.
- Ved hjelp av en vibratome, fremstille levende hjerne deler av det ønskede område med en tykkelse på 300-350 mikrometer 23.
- Fremstille en innvendig oppløsning inneholdende 0,2% biocytin ved å tilsette 2 mg biocytin til 1 ml av intern oppløsning 6. For best resultat, sonikere intern løsning for 10 - 15 min før biocytin oppløses fullstendig. Deretter legger du den interne løsningen i en 1 ml sprøyte utstyrt med en 0,2-# 160; um porestørrelse polypropylen filtertuppen er festet til en microloader. Holde dette lasting sprøyte på en kald pakke for å opprettholde stabiliteten av Mg-ATP og Na-GTP i den interne oppløsning.
MERK: En intern oppløsning inneholdende kalium-glukonat (126 mM K-glukonat, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP, og 10 mM fosfokreatin) er optimalt for gjenvinning av visse nevrokjemiske markører, inkludert parvalbumin under immunolabeling. I vår erfaring, ved hjelp av cesium- og klorid-baserte interne løsninger reduserer evnen til å gjenopprette farging for visse nevrokjemiske markører. Neurobiotin eller en celle-impermeant, kan låses, polart tracer som kombinerer en Alexa fluorofor med biocytin kan brukes som et alternativ til biocytin. - Under infrarød differensial interferens kontrast, visualisere den aktuelle cellen for opptak. For å minimere avbrudd av aksonet, nærmer cellen kroppen ved å senke pipetten langs aksen ved hjelp av "approach" function tilgjengelig i de fleste micromanipulators. Etablere hel-celle opptak i henhold infrarød differensial interferens kontrast med patch-clamp fysiologi protokoller 19-22.
MERK: Unngå nærmer cellen fra retningen av den antatte axon, som det vil kutte axon, visualisert som et bleb ved den kappede enden (grønn pil i figur 1). Unngå også å bruke høye overtrykk på opptaket pipetten mens nærmer cellen for å redusere utslippet av biocytin, noe som vil resultere i høy bakgrunnsfarging.
Figur 1. Forslag Plane for Nærmer Cells for Biocytin Fyller. Bildet illustrerer en Granule Cell (GC) fylles med biocytin under opptak som har blitt behandlet for å avsløre biocytin (i rødt ved hjelp av 594-konjugert streptavidin). GC har sine dendritter orientert i XY-planet. Legg merke til den avkuttede granulat mobilaxon (grønn pil) på grunn av pipette bevegelse langs XY-planet. Merk at det er ideelt å nærme seg dette nevron langs XZ planet. Skala: 50 mikrometer.
- I spennings-klemme-konfigurasjon, bestemme helcelle-kapasitans og seriemotstand som svar på små (5 mV), korte (30 ms) spenningen trinn ved hjelp av ved hjelp av membranen testfunksjonen i bad modus i en elektro datainnsamling og analyse-programvare. Dette vil sikre etableringen av hel-celle opptaksforhold for å tillate biocytin-fylling.
- Gjennomføre fysiologiske opptak i enten strømføren- eller spenning-klemme-modus etter behov. Et minimum registreringstid på> 10 min ved 34 ° C er ideell.
MERK: Lengre opptakstid kan være nødvendig for studier utført ved romtemperatur. - Ved ferdigstillelse av de fysiologiske innspillinger, re-etablere patch-clamp konfigurasjon av sakte beveger innspillingen pipetten i små skritt, alternerende oppover (langs Z-aksen) ogutover (langs X-aksen) i spennings-klemme-modus.
- Samtidig overvåke kapasitans og inngangsmotstanden ved hjelp av funksjonen "membrantest" for å visualisere tap av kapasitive transienter og sammenbruddet av de nåværende respons på en rett linje, som angir den gjen forsegling av cellen og etablering av en ekstern-ut- lappe på pipettespissen. Hold celle om depolarized potensial (-40 mV) vil lette re-forsegling prosess.
MERK: Denne prosedyren for fjerning av en celle sikrer vanligvis fullstendig gjenoppretting av soma og dendritter. Ikke påfør positivt press på opptaket pipetten i løpet av denne prosedyren, eller mens du demonterer cellen fra pipetten. Visualisering av soma av den innspilte celle i stykket indikerer vellykket frakobling. Tilstedeværelsen av cellulært avfall eller en membran lapp ved enden av den frittliggende spissen indikerer typisk forvridning av soma og vil ikke gi fullstendig cellulær morfologi. - After løsne pipetten fra cellen, beholde skive i opptakskammeret i 3 - 5 minutter for å sikre transporten av fargestoffet for å distale dendrittiske og aksonale prosesser.
- Overfør skivene til en 24-brønners plate inneholdende 4% PFA for fiksering.
FORSIKTIG: PFA er kreftfremkallende, og egnet personlig verneutstyr, inkludert hansker og munnbind, må brukes for å unngå hudirritasjon og innånding. PFA er brannfarlig og må holdes utenfor rekkevidde for brann. PFA er aldri kastes i avløpet og må hentes som kjemisk avfall. PFA fiksering må isoleres fra områder som brukes for live skive forberedelse til å unngå forurensning av fysiologi oppsett, inkludert overføring pipetter. - 24 - 48 timer etter PFA fiksering, overføring skivene til 0,1 M fosfatbufret saltvann (PBS) for lagring før farging.
MERK: Ideelt biocytin utvinning og farging er best når utført kort tid etter fiksering, selv om farging per dannet i løpet av 7 dager av fiksering gir gode resultater. Skiver kan holdes i PBS med 0,02 til 0,05% natriumazid for farging utført opp til og over 90 dager etter fiksering. Selv om natten fiksering i PFA fungerer godt for de fleste antistoffer, er det mulig at noen antistoffer fungerer best når varigheten av inkuberingen i fikseringsmiddel blir redusert. Fiksering i PFA i over 48 timer reduserer tilgjengeligheten av antigener og reduserer sjansene for vellykket sekundær farging for nevrokjemiske markører.
FORSIKTIG: Natriumazid er ekstremt farlig og irriterende ved kontakt med hud eller øyne eller ved inntak eller innånding. Alvorlig overeksponering kan føre til døden. Den kreftfremkallende og arvestoffskadelige for forbindelsen er ikke kjent. Bruk egnet personlig verneutstyr, inkludert hansker, beskyttelsesbriller, labfrakk og støvmaske. Natriumazid er aldri kastes i avløpet og må hentes som kjemisk avfall.
(Dag 1)
MERK: Følgende prosedyre er immunofarging for frittflytende seksjoner og krever kontinuerlig risting ved lav hastighet (2 omdreininger / min, rpm) på en rister i alle ruge trinn.
- Vask vevet 3x i 10 minutter hver i 0,1 M PBS (pH = 7,4).
MERK: 0,1 M PBS kan kommersielt innkjøpt eller fremstilt i laboratoriet som følger (som gjør en L): 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2 HPO 4, og 0,24 g KH 2PO 4 i ett L av dH 2 0.
MERK: Hvis den ønskede nevrokjemiske markør er kjent, farging for et protein / peptid kan utføres samtidig med biocytin farging (trinn 2.2 til 2.4). Hvis farging for biocytin bare, fortsett til trinn 2.5. - EKSTRA: Blokk med 10% Blokkering Serum (BS; normalt geiteserum (NGS) fortynnet i 0,3% Triton X-100 i PBS i 1 time ved RT).
MERK: Hver brønn børmotta det samme volum av oppløsningen; det anbefalte volumet er mellom 250-500 mL / brønn. Valget av den blokkerende serum er basert på de artene i hvilke sekundære antistoffer er hevet (som er NGS brukes for fargestoff-konjugert geite-anti- (respektive primære antistoffarter)). Dersom det oppstår behov for å bruke sekundære antistoffer dannet i forskjellige arter for å immunfarging av seksjoner, omfatter 10% av hver normalt serum i blokkeringstrinn (2) og 3% av hver normalt serum for de primære og sekundære antistoff ruge trinn. - (VALGFRITT) Inkuber seksjoner i primær antistoff, CB en R (polyklonale, marsvin) med 0,3% Triton X-100, og 3% BS i 0,1 M PBS ved RT O / N. CB 1 R brukes til å identifisere cannabinoid reseptor type 1 ekspresjon.
MERK: Dette trinnet er valgfritt og ikke nødvendig å avsløre biocytin fylling. Figur 2 illustrerer en seksjon som er merket for biocytin og CB 1 R i løpet av den første fargingsprosessen. O / N incuvestand ved RT er tilstrekkelig for de fleste av de primære antistoffer; imidlertid visse primære antistoffer, inkludert CB 1 R, krever 3-5 d av inkubasjon. Dersom inkubasjon må være lengre enn en d, anbefales det å inkubere ved 4 ° C på grunn av Triton X-100 kan permeabilize skiver og kan føre til nedbrytning av vevet under langvarig inkubasjon ved romtemperatur. Omfatte en negativ kontroll som mangler primær antistoff i minst en seksjon for hver serie av forsøk som en kontroll for spesifisiteten av det sekundære antistoff. For negative kontroller, er det primære antistoff utelates, men 0,3% Triton X-100 i 0,1 M PBS og BS tilsettes.
Figur 2. Vellykket CCK Farging en uke etter utvinning av Biocytin Farging og C annabinoid reseptor type 1 (CB 1 R) - <strong> merking. (A - C) Confocal bilder på 60X viser biocytin fylte nevron (A) og CB en R immunoreaktivitets (B), indikeres av pilspissen. Den samme delen ble behandlet for CCK immunfarging etter 1 uke (C). Den overlegg av bilder er vist i D. CCK immunoreaktivitets ble avslørt ved hjelp av langt-rødt og ble pseudo-farget i cyan. (E) Morfologiske rekonstruksjon av biocytin fylte celle i A. Legg merke til at biocytin og CB 1 R-farging er tydelig selv etter den andre CCK immunofarging. Legg også merke til den forventede fordelingen av CB en R og CCK farging mønstre. (F - H) Forstørret bilde av aksonet fra cellen, som i A, viser tett samlokalisering av biocytin og CB en R i aksoner (piler). Skala: 50 um (A - D), 100 nm (E), og 10 um (
(Dag 2)
- Vask hjernen seksjoner 3 x i 10 minutter hver i 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Inkuber delene i streptavidin rødt fargestoff konjugat (konsentrasjon: 1: 1000, eksitasjon: 594 nm med emisjon i det synlige røde spektrum) med 0,3% Triton X-100 og 3% BS i 0,1 M PBS ved 4 ° CO / N i mørk (innpakket i aluminiumsfolie) for å avsløre biocytin. Valgfritt: et sekundært antistoff, geite anti-marsvin (konsentrasjon: 1: 500, eksitasjon: 488 nm og emisjon i grønt), med den ovennevnte inkubering hvis etter valgfri primær inkubering i trinn 2,3.
MERK: Sekundær antistoff vil være nødvendig bare hvis den ekstra primære antistoff farging (trinn 2.3) er utført. For å visualisere biocytin, en streptavidin-fluorophore konjugat med en emisjonsspekteret i rødt anbefales, da det bidrar til å visualisere finere axoner i detalj og med bedre kontrast (figur 1 - 3). Under dobbel eller trippel immunofarging, for å unngå kryss-reaktivitet av sekundære antistoffer med hverandre, legge til sekundære antistoffer ene etter den andre i en serie måte (2 h intervallet mellom serielle tilsetninger av antistoffene er tilstrekkelig). Figur 3A illustrerer en biocytin fylt celle behandles uten den ekstra primære antistoff farging og avbildes før resectioning.
Figur 3. Vellykket Second Farging etter Gjenoppretting av Biocytin morfologi og Resectioning. (A1) Confocal bilde av en 300 um skive som viser utvinning av dendrittiske morfologien til en biocytin fylt celle. (<strong> A2) Membran spennings spor av nervecellen som svar på +500 og -100 pA nåværende injeksjoner. (B) Utvinning av den biocytin fylte soma i en 50 um seksjon oppnådd etter resectioning 300 um seksjonen (i A1) etter montering og avbildning. (B2) Etterfølgende farging av den tynne delen avslørte colocalization av biocytin fylte soma (høyre panel) med CCK (midtre panelet). Den sammenslåtte bildet er illustrert i panelet til høyre. Skala: 50 mikrometer. Panel A2 er gjengitt med tillatelse fra Yu et al. I presse 25. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
(Dag 3)
- Vask hjerneseksjoner 3 x i 10 minutter hver i 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- For å beskytte fluorescensen og for å lette re-farging i fremtiden, montere seksjoner i et vannbasert medium montering og forsegle kantene av dekkglass med klar neglelakk.
MERK: Det er best å restain seksjoner så tidlig som mulig for å unngå vanskeligheter i å fjerne neglelakk fra raset, mold infestation, og dehydrering av vev på grunn av lekkasje av monteringsmedium fra glass-slide. Mikrobiell forurensning kan unngås ved å bruke 0,02% natriumazid i PBS.
FORSIKTIG: Natriumazid er svært giftig og brannfarlig når den er i kontakt med vann. Vennligst referer til standard operasjonsprosedyrer for håndtering og avhending av farlige kjemikalier.
(Dag 4 - 7) - Utføre konfokalt avbildnings med eksitasjon ved 594 og 488 nm og ved en forstørrelse på 20X eller 40X for å avsløre biocytin fylte nevroner i rødt og nevrokjemiske markører (CB 1 R) i grønt. Vurdere colabeling (figur 2).
- Still inn kameraet eksponering for mindre enn 100 ms for å unngå fotobleking og obtai confocal bildestakker av aksonal og dendrittiske arbors av hele nervecellen. Bruk confocal bildestakker og nevroner sporing programvarepakker for å rekonstruere neuronal morfologi.
3. Farging av andre primære antistoff
MERK: Mens andre farging trinnet kan utføres 90 d etter den første farging, er optimal farging oppnås dersom den andre primære antistoff-farging blir utført i løpet av 7-10 d.
(Etter 7-90 d)
- Påfør aceton til en bomullsdott og stripe neglelakk ut av glass-slide.
- Fjern dekkglass forsiktig med fin-tip pinsett og sette et par dråper av 0,1 M PBS på seksjonene.
- Fjern forsiktig seksjoner fra raset med en fin pensel og vaske dem i 0,1 M PBS i 24 - 48 timer på en shaker dekket i aluminiumsfolie i dårlig lys ved 4 o C.
MERK: Det er viktig å dekke deler med enLuminum folie for å unngå fotobleking. - For å sikre fullstendig fjerning av montering medium, vaske delene 1 - 2x dagen etter i 0,1 M PBS i 10 minutter hver.
- Fortsett med inkubasjon i den andre primære antistoffet (for eksempel, cholecystokinin, et neuropeptid som finnes i visse GABAergiske interneuroner (CCK; konsentrasjon: 1: 1 000; mus-monoklonalt antistoff)) i 1 d (figur 2).
MERK: Denne fremgangsmåten er lik til trinn 2.3, men bruker en annen antistoff. I tillegg er blokkeringstrinn utelates under re-farging. - Vask hjerneseksjoner tre ganger i 10 minutter hver i 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Flekken med fluoroforen-konjugert sekundært antistoff geit anti-mus (konsentrasjon: 1: 500, eksitasjon bølgelengde: 647 nm), noe som gjør at eksitasjon utslipp spektra av sekundære antistoff ikke overlapper med streptavidin (konsentrasjon: 1: 1000; eksitasjon bølgelengde: 594 nm) og før immunfluorescensflekker.
- Monter delene i vandig montering medium og forsegle kantene av dekkglass med klar neglelakk.
MERK: Oppbevar seksjonene ved 4 ° C i en ugjennomsiktig oppbevaringsboks for å beskytte fluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter fullført, seksjonene beholde biocytin fyll og den immunolabeling utført i trinn 2, og kan avbildes med confocal eller epifluorescence mikroskopi. I tillegg vil de behandlede seksjoner også viser immunofarging for antigenet merket i løpet av den etterfølgende behandling i trinn 3. I delen vist i figur 2, var morfologien til en biocytin fylt neuron i en tykk seksjon (300 um) viste ved hjelp av streptavidin visualisert i rødt og den første primære (CB 1 R) visualisert i grønt. Den første farging ble utført innen 7 dager fra PFA fiksering. Stykket ble montert i et vandig monteringsmedium, avbildes ved hjelp av et konfokalt mikroskop, og lagres i en periode på to måneder før fornyet farging for CCK-antistoff. Merk morfologi av innspilte nervecellen, inkludert aksonale lysthus (figur 2E), ble rekonstruert fra confocal bilder obtained etter den første fargeprosedyre. Colocalization av axon med CB en R immunoreaktivitets (Figur 2 F - H) var forventet basert på fysiologiske studier. Den andre farging for CCK ble utført på seksjonene to måneder etter den første fargeprosedyre. CCK ble fotografert i langt-rødt og ble pseudo-farget i cyan for visualisering. På samme måte, Figur 3 viser et eksempel på en celle hvor biocytin-merking ble åpenbart og avbildes i en tykk seksjon (figur 3A1). Den iboende fysiologi av nervecellen er illustrert i figur 3A2. Stykket ble gjen delt på 50 mikrometer, og selv om enkelte deler som inneholder dendrittiske prosesser gikk tapt, den delen som inneholder soma gjenvunnet (figur 3b1). Etterfølgende CCK farging av den tynne delen viste CCK uttrykk i grønt i biocytin merkede soma. Montering av tykk skive i et vandig medium forhindrer excessive vev krymping. I gjennomsnitt, 300 mikrometer seksjoner montert med vandig medium krympe med om lag 25,67 ± 3,14% (n = 5 stykker) målt en uke etter montering. Således, de tykke seksjoner montert ved hjelp av det vandige medium er ~ 225 mikrometer, slik at for resectioning. I flere kontrollstudier ble det bekreftet at prosessen med immunolabeling for andre gang, ikke førte til ikke-spesifikk merking av antistoffet. For eksempel er det kjent at parvalbumin (PV) og CCK-immunreaktivitet er gjensidig utelukkende i hippocampus-neuroner. Kontroller i hvilken den første immunolabeling trinn (2) for biocytin (rød) og CCK (grønn) ble etterfulgt av den andre merking for parvalbumin (med eksitasjon ved 405 nm og emisjon i blått) viste ikke-overlappende uttrykk mønstre (figur 4). I tillegg er karakteristiske Laminar aksonal flekker mønstre av nerveceller som uttrykker spesifikke nevrokjemiske markører (PV, CCK, CB 1 R) ble ikke endret ved serial re-flekker prosedyrer (figur 2 - 4). Videre sekundære flekker gående viste ko-merking av biocytin fylte neuroner med nevrokjemiske markører som forventes på grunnlag av de fysiologiske opptak. Dermed er vi sikre på at restaining prosedyren ikke fører til tap av spesifisitet i merking.
Figur 4. Mangel på overlapp mellom gjensidig utelukkende Markører på andre Farging Etter Før Farging og montering av §§. (A - C) Confocal bilder på 10X viser en biocytin fylt nevron (A) i rødt, angitt med en pilspiss, og CCK immunoreaktivitets i grønt (B), angitt med pilen. Legg merke til mangelen på overlapping. Den samme delen ble behandlet for parvalbumin (PV) farging i blått etter mer enn 2 måneder (C). den overlay av bilder er vist i D. Legg merke til at PV aksoner er fordelt i granulen celle laget, med CCK i den molekylære lag i den forventede-overlappende mønster. Legg også merke til mangelen på colocalization av de to markørene i neuronal somata. De bilder som er zoomet til høyre illustrerer at biocytin merkede nevron uttrykker PV (pilspiss) og ikke CCK (pil). Skala: 100 um (A - D) og 20 um (panelene til høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
En vanlig årsak til sub-optimal biocytin fyller er utilsiktet adskillelse av de nevrale prosesser med innspillingen pipette mens nærmer cellen. En tapt vedheng av cellen ser ut som en bleb av biocytin ved enden av en axon, som illustrert i figur 1 (grønn pil). Aksonal blebs enre ofte visualisert når patching overfladiske celler, hvis axoner kan bli kuttet under slicing prosedyrer. Imidlertid kan optimalisering av planet for kutting og kunnskap om aksonal fordelingsmønsteret av den målsøkte celle klassen hjelpe til i å unngå nærmer soma fra retningen av den antatte axon, som også kan klippe av axon, noe som resulterer i fremkomsten av en aksonal bleb . I de fleste celletyper, er det fordelaktig å nærme cellekroppen langs Z-aksen (hvit pil med merket). Et annet problem gjelder påføringen av overdreven positivt trykk til pipetten mens nærmer cellen. Dette kan ikke bare skade på cellen og dens forbindelser, men også bevirker den interne oppløsning inneholdende biocytin søler rundt cellen, noe som fører til høy bakgrunnsfluorescens. Bakgrunnsfarging øker også når den tiden det tar å nærme cellen blir forlenget eller når skive kvalitet ikke er optimal, noe som kan svekke muligheten til å definere cellulær morfologi (figur 5A). Det er mulig å trekke soma ut mens løsner pipetten. Dette vil resultere i en mangel på somatisk morfologi (figur 5B). For å unngå å trekke ut cellen, flytte pipetten opp og ut i små trinn ved hjelp av de "fine" bevegelse innstillingene for manipulator. Hvis cellen ser ut til å være knyttet til pipetten gjennom en lang membran forlengelse, trykk / flick manipulatoren forsiktig for å løsne pipetten fra cellen. Unngå å bruke de grove manipulator innstillinger inntil cellen har fullt forskyves.
Figur 5. Bildene viser mislykkede Biocytin Fyller. (A) Bildet viser høy bakgrunnsfluorescens grunn av overdreven overtrykk i opptaket pipette, noe som resulterer i dårlig sikt celle. Finere strukturer av nevrale prosesser, herunder axoner, er visualisert utover regionen the utslipp. Legg også merke til at Soma har blitt trukket ut. (B) En nervecelle med soma trukket ut i løpet av pipette løsrivelse. Pilene viser vellykkede fills av aksonet og dendritter, mens soma og supplement proksimale til pilene har ikke kommet til rette. (C) En celle lappet i et overfladisk lag av skiven (<50 um fra overflaten) resulterer i fylte celler som utviser snitt axon og dendritter (pilspisser). Legg merke til beading (piler) av granulat celle dendritter, indikerer dårlig celle helse (C). Skala: 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Til slutt, for å gjenopprette komplett mobilnettet morfologi uten avkuttede aksoner eller dendritter, er det best å målrette celle> 50 mikrometer dypt til stykket overflaten. Overfladiske celler kan ha prosesser som harblitt kuttet og kan mangle normal bemanning av synaptiske innganger.
De mest vanlige fallgruver i restaining prosedyrer er forbundet med fjerning av dekkglass og utvinning av delen uten å skade vevet. Et annet problem gjelder antistoff penetrasjon inn tykk vev, spesielt når inkubert over natten. I flere tilfeller har bedre penetrasjon er oppnådd ved å inkubere i det primære antistoff i opptil 72 timer ved 4 ° C på en orbital-rystemaskin anbragt i et kaldt rom. Selv om gjen seksjonere vev er den mest effektive framgangsmåten for å sikre gjennomtrengning antistoff, forlenger varigheten av inkubasjon i primært antistoff eller øke vaskemiddelkonsentrasjonen til 0,5 - 1% Triton-X100 kan også hjelpe til antistoffet gjennomtrengning 24. Siden de fleste innspilte neuroner ligger innenfor 50-100 um fra overflaten av seksjonen, finner vi at farging av tykke seksjoner er tilstrekkelig å merke biocytin-filled somata eller prosesser på dette nivået. Imidlertid er det anbefalt at omfanget av antistoff merking er kontrollert på hver seksjon før tolke negative samlokalisering resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn i protokollen
Fylle lappet celle med biocytin er den mest avgjørende skritt for å sikre full gjenoppretting av morfologi. For full gjenoppretting av cellen, er det viktig å velge en optimal skive orientering for å redusere adskillelse av prosesser under kutting. Denne orienteringen kan variere basert på krets og celletypen under eksamen. Deretter er det viktig å gi tilstrekkelig tid for biocytin å diffundere til dendritter og aksoner. Noen fargestoffer, for eksempel neurobiotin, kan også trenge nevroner koblet til den innspilte cellen gjennom gap veikryss. Størrelsen på pipettespissen må også være optimalisert, som soma en tendens til å bli trukket ut når åpningen er stor og biocytin lasting er utsatt når pipettespissen er for liten. I tillegg hensiktsmessige rutiner mens utkobling fra hel-celle-modus er avgjørende for å gjenopprette soma. Etter opptak for 24 timer, den påfølgende inkubasjonav skivene i 4% PFA, etterfulgt av PBS sikrer at kryssbinding av vev blir redusert, noe som er kritisk for immunhistokjemi. Lagring av skivene ved 4 ° C er også viktig for å opprettholde skive integritet. Men langvarig lagring i PFA reduserer eventuell suksess med antistoff-merking prosedyrer. Optimalisering av konsentrasjonen og varigheten av det primære antistoff inkubasjon er viktig, da disse vil være forskjellig for de enkelte antistoffer, og noen antistoffer kan kreve 3-5 d av inkubasjon for optimal penetrasjon i tykt vev. For å sikre at skivene ikke er skadet før det sekundære primære antistoff-farging, er tilstrekkelig forsiktighet nødvendig under fjerning av dekkglass.
Modifikasjoner og feilsøking
Vi har observert at det ikke er satt varighet mellom den første og andre flekk. Seksjoner har blitt re-farget måneder senere på samme vev og med mer enn en flekk. Ivåre nyere arbeider, sammenlignet vi deler bearbeidet ved hjelp av re-fargemetode med disse ved hjelp av standard farging protokoller og finner ingen åpenbar forskjell i fargemønstre eller robustheten biocytin fyller 6,9,25,26.
Selv om det gjenstår å bli testet, er det mulig at gjen flekker kan bli utført mer enn en gang, med vev integritet å være en begrensende faktor for gjentatt håndtering. Tilgjengeligheten av diskrete fluorophores utgjør også en grense for antall antigener som kan visualiseres. Derfor er forsiktig håndtering av vevet rådet. En ytterligere prosess som gjenstår å bli testet blir restaining ved bruk av antigen gjenvinnings-protokoller (for overflatereseptorer). Siden integriteten av vevet bibeholdes etter fjerning fra dekkglass, vi forventer at prosedyren skal også arbeide i flekker protokoller som anbefalt antigen-utvinning. I denne forbindelse, fysiologiske opptak ofte gir celler med ingen kjente nevrokjemiske markører
Begrensninger av teknikken
En begrensning i forbindelse med å utføre immunhistokjemisk farging på tykke seksjoner er utilstrekkelig gjennomtrengning av antistoffet gjennom hele tykkelsen av delen, spesielt med standard inkubering over natten i det primære antistoff. Videre forskjellige antistoffer og streptavidin, som brukes for å avsløre biocytin kan ha differensial vevspenetrering. Således anbefales det at prøvekjøringer blir utført for å vurdere dybden av antistoff gjennomtrengning og for å modifisere inkubasjonstidene, temperaturer, og antistoff og Triton & #160, X-100-konsentrasjoner for å oppnå optimal skive gjennomtrengning og farging for hvert antistoff. Det bør også bemerkes at en vellykket merking med en antistoff eller med streptavidin-biocytin betyr ikke at et andre antistoff vil trenge gjennom til den samme dybden av seksjonen. Derfor må man sørge for å kontrollere inntrengningen av hvert antistoff til det nivå hvor biocytin-merkede celleprosesser blir kontrollert for ko-lokalisering med nevrokjemiske markør. Hvis penetrasjon er utilstrekkelig, stykket kan bli re-delt på <60 mikrometer for farging. Vær imidlertid oppmerksom på at siden skivene var allerede behandlet for biocytin kan morfologi av cellen bli fanget av confocal bildebehandling for å eliminere mulig tap av anatomiske data under re-seksjonering og legge til rette for nevronale gjenoppbygging. Mens det er mulig at alder og dyrearter kan forandre graden av antistoffet gjennomtrengning, har vi med hell brukt i disse fremgangsmåtene i rotte vev fra 30-dag- og over 60 dager gamle rotter og mus.
En annen begrensning er at biocytin er ikke iboende fluorescerende og kan ikke brukes for live bildebehandling og real-time morfologisk karakterisering under opptak. Alternative konjugerte fluorophores og Lucifer gule har blitt utnyttet for live avbildning av cellene 27. De er ikke permanent og mister fluorescens ved fiksering, noe som gjør det upraktisk for post-hoc nevrokjemiske identifisering av de registrerte nervecellen. Nylig, fluoroforer med biocytin har blitt introdusert for å overvinne denne begrensning og kan anvendes for levende avbildning samt for post-hoc behandling i dobbel- eller trippel-merking, som beskrevet her. Interessant, til dags dato, har biocytin fyll resultert i bedre elektriske og fargeegenskaper for kombinerte elektrofysiologiske og anatomiske studier sammenlignet med Lucifer gul 28.
Betydningen av Technique For eksisterende /alternative metoder
De store fordelene ved anvendelse av protokollen beskrevet her er at, i motsetning resectioning, den biocytin fylt cellestruktur og prosesser forblir intakt og ikke fører til permanent tap av vev, og heller ikke til et behov for arbeidskrevende ombygginger fra flere seksjoner. Dermed kan en encellet fill etterfulgt av immunocytochemistry hjelpe i den morfologiske gjenoppbygging og identifisering av spesifikke nevrokjemiske markører.
Fremtidige søknader eller Veibeskrivelse Etter å mestre denne teknikken
I alle, presenterer vi en ny praktisk tilnærming for gjenvinning av morfologi og post-hoc dobbel- og trippel-immunolabeling av nevroner følgende elektrofysiologiske opptak. Prosessen er spesielt fordelaktig for å finne nye markører som kunnskap utvikler seg, re-evaluere nevroner som tidligere var fylt, visualisert og fotografert. Det er spesielt fordelaktig fordi than immunhistokjemi kan utføres uker eller måneder senere, sparer vev og antistoffer. Fremgangsmåten krever ingen spesielle kjemikalier, og kan trygt bli utført i en hvilken som helst laboratorium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke støtte fra NIH / ninds R01 NS069861 og NJCBIR CBIR14IRG024 til VS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Immunostaining |
| KCl | Fluka | 60129 | Immunostaining |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Immunostaining |
| KH2PO4 | Sigma | 229806 | Immunostaining |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Immunostaining |
| Guinea pig anti CB1 | Sigma | Af530-1 | Immunostaining |
| Mouse anti CCK | CURE, UCLA | courtesy of G. Ohning | Immunostaining |
| Rabbit anti Parvalbumin | Swant | PV27 | Immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor conjugate | Molecular Probes | S11227 | Immunostaining |
| Normal goat serum (NGS) | Sigma | G9023 | Immunostaining |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Immunostaining |
| Secondary Antibodies | Invitogen Molecular probes | Alexa Fluor conjugated dyes | Immunostaining |
| Labnet orbit low speed shaker | Bioexpress | S-2030-LS | Immunostaining |
| Forceps | Dumont | 11231-30 | Immunostaining |
| Slide folders | EMS | 71520 | Immunostaining |
| Vibratome VT 1200 S | Leica | 14048142066 | Electrophysiology |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular devices | Multiclamp 700B | Electrophysiology |
| pCLAMP 10 Software | Molecular devices | pCLAMP 10 | Electrophysiology |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440 digitizer | Electrophysiology |
| Filter tips | Nalgene | 171-0020 | Electrophysiology |
| Sonicator | Fisher Scientific | 15-335-100 | Electrophysiology |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 | Electrophysiology |
| Biocytin | Sigma | B4261 | Electrophysiology |
References
- Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. The histological slides and drawings of cajal. Front Neuroanat. 4, 9 (2010).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Petilla Interneuron Nomenclature, G., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
- Armstrong, C., Soltesz, I. Basket cell dichotomy in microcircuit function. J Physiol. 590 (4), 683-694 (2012).
- Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8 (8), e70553 (2013).
- Gupta, A., Elgammal, F. S., Proddutur, A., Shah, S., Santhakumar, V. Decrease in tonic inhibition contributes to increase in dentate semilunar granule cell excitability after brain injury. J Neurosci. 32 (7), 2523-2537 (2012).
- Fish, K. N., Hoftman, G. D., Sheikh, W., Kitchens, M., Lewis, D. A. Parvalbumin-containing chandelier and basket cell boutons have distinctive modes of maturation in monkey prefrontal cortex. J Neurosci. 33 (19), 8352-8358 (2013).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy. Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition. Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).
- Varga, C., et al. Functional fission of parvalbumin interneuron classes during fast network events. Elife. 3, (2014).
- Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Neural Circuits Revealed. , 109 (2015).
- Krook-Magnuson, E., Luu, L., Lee, S. H., Varga, C., Soltesz, I. Ivy and neurogliaform interneurons are a major target of mu-opioid receptor modulation. J Neurosci. 31 (42), 14861-14870 (2011).
- Szabadics, J., Soltesz, I. Functional specificity of mossy fiber innervation of GABAergic cells in the hippocampus. J Neurosci. 29 (13), 4239-4251 (2009).
- Iball, J., Ali, A. B. Endocannabinoid Release Modulates Electrical Coupling between CCK Cells Connected via Chemical and Electrical Synapses in CA1. Front Neural Circuits. 5, 17 (2011).
- Chen, X., Cho, D. -B., Yang, P. -C.
- Ranjan, A. K., et al. Cellular detection of multiple antigens at single cell resolution using antibodies generated from the same species. Journal of immunological. 379 (1), 42-47 (2012).
- Fuccillo, D. A., Sever, J. L. Concepts in Viral Pathogenesis II. , Springer. 324-330 (1986).
- Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochem. 107 (2), 143-148 (2005).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (95), e52358 (2015).
- Walz, W. Patch-clamp analysis : advanced techniques. 2nd edn. , Humana Press. (2007).
- Molnar, P. Patch-clamp methods and protocols. 403, Springer Science & Business Media. (2007).
- Martina, M., Taverna, S. Patch-clamp methods and protocols. , Humana Press. (2014).
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons). J Vis Exp. (91), e51706 (2014).
- Jinno, S., Kosaka, T. Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study. Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).
- Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms. Cereb Cortex. , (2015).
- Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations. Chaos. 23 (4), 046109 (2013).
- Scharfman, H. E. Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny 'fast-spiking' cells. Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).
- Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses. J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).
