Summary
We presenteren drie nieuwe en efficiëntere protocollen voor differentiatie humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in cardiomyocyten, endotheelcellen en gladde spiercellen en bezorg- de engraftment van getransplanteerde cellen verbetert door het combineren celinjectie met patch-gemedieerde cytokine.
Abstract
Human geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) moet volledig worden onderscheiden in specifieke celtypen voorafgaand aan toediening, maar de conventionele protocollen voor differentiëren hiPSCs in hartspiercellen (iPSC-CMS), endotheelcellen (iPSC-EC), en gladde spiercellen (SMC) zijn vaak beperkt door de lage opbrengst, zuiverheid, en / of slechte fenotypische stabiliteit. Hier presenteren we nieuwe protocollen voor het genereren iPSC-CM, -ECs en -SMCs die aanzienlijk efficiënter dan conventionele methoden, alsmede een werkwijze voor het combineren celinjectie met cytokine-bevattende pleister gemaakt via toedieningsplaats. De patch verbetert zowel de retentie van de geïnjecteerde cellen bij het afdichten van de naald weg te voorkomen dat de cellen van wordt geperst uit het myocardium en celoverleving, door het vrijgeven van insulineachtige groeifactor (IGF) over een langere periode. In een warkensmodel van myocardiale ischemie-reperfusieschade, het percentage enting was meer dan twee keer groter is vancellen werden toegediend met cytokine-bevattende pleister vergelijken met de cellen zonder patch, en behandeling met zowel de cellen en de pleister, maar niet de cellen alleen werd geassocieerd met een significante verbetering in hartfunctie en infarctgrootte.
Introduction
Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) behoren tot de meest veelbelovende middelen voor regeneratieve celtherapie omdat ze kunnen worden onderscheiden in een potentieel onbeperkte waaier en de hoeveelheid cellen die niet worden afgewezen door het immuunsysteem van de patiënt. Echter, hun capaciteit voor zelf-replicatie en differentiatie leiden tot tumorvorming en derhalve dient hiPSCs volledig worden onderverdeeld in specifieke celtypen, zoals hartspiercellen (CM), endotheelcellen (ECs) en gladde spiercellen (SMC ), voor toediening. Een van de eenvoudigste en meest voorkomende methoden cel toediening directe intramyocardiale injectie, maar het aantal getransplanteerde cellen die zijn geënt met de natieve myocardiaal weefsel uitzonderlijk laag. Veel van dit verloop kan worden toegeschreven aan de cytotoxische omgeving van het ischemische weefsel; wanneer echter muriene embryonale stamcellen (SER) werden direct geïnjecteerd in het myocardium van niet-beschadigde harten, only ~ 40% van de 5.000.000 cellen geleverd werden behouden gedurende 3-5 uur 1, hetgeen suggereert dat een aanzienlijk deel van de toegediende cellen verlieten de toedieningsplaats, misschien omdat zij uitgeknepen door de naald weg door de hoge drukken die tijdens myocardiale contractie.
Hier presenteren we nieuwe en aanzienlijk efficiëntere werkwijzen voor het genereren iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM) 2, endotheliale cellen (EC-iPSC) 3 en gladde spiercellen (SMC) 4. Met name deze iPSC SMC-protocol is de eerste die de uiteenlopende morfologische en functionele kenmerken waargenomen in somatische SMC's 5 door het richten van de cellen naar een overwegend synthetisch of SMC contractiele fenotype nabootsen. Wij ook een werkwijze voor aflevering cel die de engraftment percentage geïnjecteerde cellen verbetert door een cytokine-bevattende fibrine patch op de injectieplaats. De pleister blijkt zowel celretentie verbeteren door het afdichten van de naald weg te voorkomen dat de cellen van het verlaten van het myocardium en celoverleving, door het vrijgeven van insulineachtige groeifactor (IGF) gedurende ten minste drie dagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures worden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Animal Universiteit van Alabama in Birmingham.
1. Differentiatie hiPSCs in iPSC-CMs
- Smeer de putjes van een 6-well plaat met pre-gekoelde groeifactor-gereduceerde geleiachtige eiwitmengsel bij 4 ° C voor de overnachting. Zuig het gelatineuze proteïnemengsel voor gebruik. Zaad de hiPSCs op de vooraf beklede platen en kweken van de cellen (1 x 10 5 cellen per putje) bij 5% CO2 en 37 ° C in mTeSR1 mediumsupplement met 10 pM ROCK inhibitor.
- Vernieuw de medium dagelijks tot de cellen te bereiken 90% samenvloeiing; vervolgens toevoegen groeifactor verminderde gelatineuze eiwitmengsel aan het medium (0,5 mg gelatineuze eiwitmengsel per 6-well plaat, 2 ml medium per putje) en de cellen te kweken voor 5% CO2 en 37 ° C nog twee dagen.
- Om het medium te vervangen, zachtjes zuigen het medium uit de petrischaal via vacuüm metuit het aanraken van de cellen, en voeg nieuwe medium met behulp van een overdracht pipet.
- Initiëren differentiatie door het vervangen van het medium RPMI1640 medium aangevuld met groeifactor-gereduceerde gelatineuze eiwitmengsel, B27 zonder insuline en 100 ng / ml activine A; kweken van de cellen bij 5% CO2 en 37 ° C gedurende 24 uur.
- Vervang het medium RPMI1640 medium dat is aangevuld met B27 zonder insuline, 10 ng / ml botmorfogeen eiwit 4 (BMP-4) en 10 ng / ml basische fibroblastgroeifactor (bFGF); kweken van de cellen bij 5% CO2 en 37 ° C gedurende 96 uur.
- Vervang het medium RPMI1640 medium aangevuld met B27 en verder kweken van de cellen bij 5% CO2 en 37 ° C; Vernieuw de medium om de 3 dagen.
- Observeer clusters van de aanbesteding van de cellen onder de microscoop ~ 3 dagen na aanvang van differentiatie. Verzamel de clusters ~ 7 dagen na de eerste observeren weeën en was ze in Hanks Balanced Salt Solution.
- Distantiëren de geclusterde-cellen in de plaat door te incuberen in Hanks buffer bevattende 100 U / ml collagenase IV gedurende 10 min bij 37 ° C onder zacht schudden; Vervolgens, voeg 0,25% trypsine in ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) gedurende 5 min.
- Neutraliseer de enzymoplossing met 10% foetaal runderserum aan RPMI / B27 medium en resuspendeer de cellen in RPMI / B27 medium.
- Tel het aantal cellen door hemocytometer. Cultuur van de cellen op 10 cm schalen bij 5% CO2 en 37 ° C gedurende ten minste 3 uur, waardoor het niet-cardiomyocyt cellen hechten aan het oppervlak van de kweekschaal.
- Verzamel de celsuspensie, waarbij het iPSC-CMs bevat en onderhouden van de cellen (ongeveer 1 x 10 6 cellen per 10 cm schaal) door ze te kweken op een gelatine-achtig eiwitmengsel gecoate oppervlak.
2. Differentiatie hiPSCs in iPSC-EC
- Distantiëren de iPSC populatie in enkele cellen door incubatie them met chelaterende middel met 5% CO2 en 37 ° C gedurende 5 minuten. Overdracht van de cellen om een 15 ml centrifugebuis met vers medium mTeSR1.
- Spin down de cellen bij 200 g gedurende 5 min. Resuspendeer de cellen in mTeSR1 medium aangevuld met 10 pM ROCK inhibitor. Bepaal de celdichtheid met een hemocytometer.
- Voeg 250 ul van 20 NIH eenheden / ml thrombine-oplossing een putje van een 24-wells plaat.
- Voeg 1 x 10 6 hiPSCs tot 250 ui van een 12,5 mg / ml fibrinogeenoplossing. En voeg 250 pl celbevattende fibrinogeenoplossing de trombine-geladen goed. Let op de mengsel stollen tot een iPSC bevattende fibrine scaffold binnen de min te vormen.
- Breng de gestolde, celbevattende scaffolds in de putjes van een 6-wells plaat met het dekglas forceps en initiëren differentiatie door kweken van de steigers 2 ml EBM2 medium aangevuld met 2% B27 zonder insuline, activine-A (50 ng / ml) en BMP-4 (25 ng / ml) gedurende 24 uur bij 5% CO
- Vervang het medium door voorzichtig te zuigen uit de oude medium via vacuüm, zonder het aanraken van de cellen. Toevoegen EBM2 medium aangevuld met B27 zonder insuline, vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF, 50 ng / ml), erythropoïetine (EPO, 100 ng / ml) en transformerende groeifactor β1 (TGFB1, 10 ng / ml) en cultuur steigers bij 5% CO2 en 37 ° C gedurende 48 uur.
- Vernieuw de medium en de cultuur van de steigers bij 5% CO 2 en 37 ° C voor nog eens 48 uur; Laat dan de cellen van het skelet door toevoeging van 200 U collagenase IV (100 U / ml) aan het medium.
- Spin down de cellen nadat ze zijn vrijgelaten. Vervang het medium met 2 ml EGM2 MV-medium aangevuld met 2% B27, VEGF-A (50 ng / ml) en SB-431.542 (10 uM); Vernieuw de medium om de twee dagen.
- Ongeveer 10 dagen later (dat is op ~ Dag 14 na differentiatie ingeleid), dissociëren de cellen met 100 U / ml collagenase IV, isoleren hiPSC-EC uit de populatie van gedifferentieerde cellen via flow cytometrie analyses voor de expressie van EG-specifieke marker-eiwitten (bijvoorbeeld CD31, CD144) 3.
- Vouw de geïsoleerde iPSC-EC's via een vooraf vastgesteld protocol 3.
3. Differentiatie hiPSCs in iPSC-SMC's
- Zaad de hiPSCs op platen die zijn bekleed met gelatineuze proteïnemengsel toegevoegd en de cellen te kweken in mTeSR1 medium bij 5% CO2 en 37 ° C, met dagelijkse mediumveranderingen tot samenvloeiing (~ 2 dagen).
- Initiëren differentiatie in mesodermale-lineage cellen door kweken van de cellen met CHIR99021 (5 uM) en BMP-4 (10 ng / ml) in RPMI1640 medium en 2% B27 plus insuline gedurende 3 dagen.
- Om iPSC-SMC's te produceren met een overwegend synthetisch fenotype:
- Cultuur van de cellen met VEGF-A (25 ng / ml), fibroblast groeifactor β (FGFβ, 5 ng / ml) in RPMI1640 me dium en 2% B27 minus insuline bij 5% CO2 en 37 ° C gedurende 4 dagen.
- De cellen te kweken in VEGF-A (25 ng / ml), FGFβ (5 ng / ml) in RPMI1640 medium en 2% B27 plus insuline bij 5% CO2 en 37 ° C gedurende 2 dagen.
- Cultuur van de cellen in plaatjes afgeleide groeifactor β (PDGFβ, 10 ng / ml), TGFp (3 ng / ml) in RPMI 1640 en 2% B27 plus insuline bij 5% CO2 en 37 ° C gedurende 4 dagen.
- Om iPSC-SMC's te produceren met een overwegend contractiele fenotype:
- Kweken van de cellen gedurende 4 dagen met VEGF-A (25 ng / ml) en FGFβ (5 ng / ml) in RPMI 1640 en 2% B27 minus insuline.
- Kweken van de cellen gedurende 7 dagen met PDGFβ (5 ng / ml) en TGFp (2,5 ng / ml) in RPMI 1640 en 2% B27 plus insuline.
- Zuiver het uiteindelijke iPSC SMC-populaties door het kweken van de cellen in lactaat (4 mM) bevattend RPMI1640 medium voor metabole ~ 6 dagen.
- Verhit olijfolie tot 45 ° C in een waterbad.
- Verhit 5 ml 10% gelatineoplossing tot 50 ° C.
- Voeg de gelatine aan de olijfolie, roer, en vervolgens snel afkoelen tot 5 ° C door het toevoegen van ijs om het waterbad.
- Vijfentwintig minuten later, voeg gekoeld (4 ° C) aceton de olijfolie microsfeervorming induceren.
- Handhaaf de temperatuur op 5 ° C gedurende 1 uur; Verzamel dan de microsferen, wassen 5 maal met voorgekoeld aceton olijfolie verwijderen en laten drogen bij 4 ° C.
- Resuspendeer de microsferen in een oplossing van 70% ethanol en 0,25% glutaaraldehyde gedurende de nacht bij 4 ° C verknoping induceren, en daarna werd het mengsel met 100 mM glycine neutraliseren.
- Laad IGF in de microsferen door 5 mg microsferen met 15 gl gedestilleerd H2O met 5 ug IGF en 0,1% bovine serum albumine gedurende 30 minuten.
5. Het creëren van de Patch over de plaats van het letsel en het injecteren van de Cellen
- Hang de iPSC-afgeleide cm (2 miljoen), SMC (1 miljoen euro), en EC (1 miljoen) samen in 1 ml Minimum Essential Medium (MEM).
- Suspendeer 5 mg van microsferen in 1 ml fibrinogeenoplossing (25 mg / ml).
- Vul een spuit met het cel bevattende oplossing, een spuit met de fibrinogeen / microsfeer oplossing, en een derde spuit met 1 ml trombine oplossing (80 NIH eenheden / ml, aangevuld met 2 ui 400 mM CaCl2 en 200 mM ε-aminocapronzuur zuur).
- Operatief induceren myocardinfarct bij varkens hart via ligatie van de linker voorste dalende kransslagader zoals eerder beschreven 2.
Opmerking: In het kort, vrouwelijke Yorkshire varkens (~ 13 kg, 45 dagen oud) worden verdoofd met een intramusculaire injectie van Telazol / xylazine (4,4 mg / kg), geïntubeerd en onder algehele anesthesie met isofluraan (0,5-5%). Een 4e intercostal thoracotomie wordt uitgevoerd en liet anterieure dalende kransslagader wordt blootgesteld. De kransslagader wordt afgesloten door een ligatuur van 60 min en vervolgens de ligatuur wordt verwijderd. Directe elektrische defibrillatie wordt uitgevoerd bij ventriculaire fibrillatie. - Plaats een steriele plastic ring (~ 2,5 cm) op het epicard van het infarct gebied van varkens harten, en vervolgens gelijktijdig injecteren de microbolletjes / fibrinogeen en trombine-oplossingen in de ring.
- Laat het mengsel te stollen (~ 30 sec), en steek de naald van de cel met spuit door het gestolde mengsel in het infarct myocardium en injecteer de cellen. Sluit de spier lagen, onderhuids weefsel, en de borstwand met 3-0 of 2-0 Monocryl hechting, afhankelijk van grootte van het dier. Buprenorfine 0,01-0,02 mg / kg intramusculair injectie elke 8 uur worden gebruikt om pijn te controleren voor de eerste 3 dagen na de operatie.
- Evalueer hartfunctie met een cardiale magnetische resonantieimaging (MRI) voor operatie, een week tot vier weken na de operatie 2, 3, 4. Na de laatste MRI studies, offeren het dier en verwerkt voor histologie hun hart en moleculaire analyse 2, 3, 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering van gedifferentieerde iPSC-cms, -ECs en -SMCs
De differentiële capaciteit van hiPSCs geëvalueerd 2, 3, 4. Flow cytometrie analyse van cardiale troponine T (cTnT) expressie suggereert dat de zuiverheid van het uiteindelijke iPSC-CM populatie 90% (Figuur 1A, 1B, paneel B1) kan overschrijden. Bijna alle cellen tot expressie langzame myosine zware keten (Figuur 1B, paneel A1), α-sarcomeer actine (Figuur 1B, paneel A2), terwijl ongeveer 25% sprak de 2v isovorm van myosine lichte keten (MLC2v) (Figuur 1B, panel B2), die pas in ventriculaire CM 4 gevonden. De efficiëntie van de iPSC-EC differentiatie protocol (dat wil zeggen, het percentage van CD31 + cellen) werd substantially hoger wanneer deze wordt uitgevoerd met hiPSCs van de grepen lijn (45,6%, figuur 1C, paneel C2) dan bij PCBC16iPS cellen (31,3%, figuur 1C, paneel D2); populaties van> 95% zuiverheid werden bereikt door selectie voor CD31 expressie, en> 90% van de geselecteerde cellen blijven CD31 of CD144 tot 4 weken drukken indien gekweekt in EGM2-MS medium (zonder FBS) aangevuld met B27, VEGF, en SB431542 (figuur 1D) 3. Meer dan 94% van de gezuiverde iPSC-SMC's tot expressie gladde spier actine (SMA), maar synthetische iPSC-SMC's werden vaker dan contractiele iPSC-SMC's collageen 1, connexine 43 of vimentine (figuur 1E) drukken. De migratie en proliferatie vermogen van iPSC-SMC's werden geëvalueerd 4. Synthetische iPSC-SMC's waren ook trek- en proliferatieve dan contractiele iPSC-SMC (figuur 1F, panels I en II), terwijl contractiele SMC gecontracteerde sterker in respons op carbachol behandeld (Figuur 1F, panelen iii, iv en v).
Groeifactor release van gelatine microsferen
ELISA metingen van IGF-1 niveaus in het medium van gekweekte celvrije pleisters aangegeven dat de groeifactor werd uit de microsferen vrijgemaakt gedurende een periode van tenminste 3 dagen (Figuur 2A) 2. De analyses werden uitgevoerd door het laden 5 mg IGF-bevattende microsferen met 5 ug IGF-1. Een pleister werd geproduceerd door mengen van de microbolletjes met 1 ml fibrinogeen oplossing en 1 ml thrombine. De patch werd gekweekt in 2 ml MEM. Eén ml van het medium werd verzameld en vervangen door 1 ml vers MEM elke dag (figuur 2B). De gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SEM.
Waarnemingen van een IR-blessure Model
2. Een totaal van 6.000.000 iPSC-cms, -ECs en -SMCs (2 miljoen van elk type cel) werden direct geïnjecteerd in de gewonde hartspierweefsel. Voor dieren in de CELL + Patch groep, een patch uit fibrine en IGF-1-bevattende microsferen werd gemaakt over de plaats van letsel voor injectie, terwijl dieren in de celgroep behandeld met dezelfde dosis cel zonder de patch; beide behandelingen werden ingehouden van dieren in de MI-groep. Vier weken na verwonding en behandeling, 9% van de aan dieren in de CELL + Patch groep cellen werden behouden en bleef overleven op de plaats van toediening, vergeleken met slechts 4% van de cellen toegediend aan dieren in de celgroep (fig 3A). Behandeling met zowel de cellen en de pleister, maar niet de cellen alleen, was ook Associated met aanzienlijke verbeteringen in metingen van de hartfunctie en infarctgrootte (Figuur 3B).
Figuur 1: Differentiatie van hiPSCs in cardiomyocyten, endotheelcellen en gladde spiercellen. Hartspierceldifferentiatie en de zuiverheid van iPSC-CM's werden geëvalueerd via stroomcytometrie (A) en met verschillende histologie hartmerkers (B). De differentiatie van endotheliale iPSC werd bepaald met flowcytometrie (C). Het onderhoud van de endotheliale fenotype van iPSC-EC werd bepaald via analyse van de expressie van CD31 en CD144 op 2, 3 en 4 weken na de zuivering door flowcytometrie (D). De gladde spiercellen differentiatie van iPSC werd gemeten door verschillende merkers (E). En de migratie en proliferatie potentieelsynthetische gladde spiercellen versus contractiele gladde spiercellen afkomstig van hiPSCs werd beoordeeld (F). Kernen werden tegengekleurd met DAPI in de immunofluorescentiekleuring. Schaal bar = 100 urn (B) en 200 urn (E en F). De migratie en proliferatie vermogen van synthetische iPSC-SMC werden geëvalueerd (F panel i en ii). En inkrimping van contractiele SMC in respons op carbachol behandeling werd beoordeeld (F, panel iii-v). * P <0,05, synthetische iPSC-SMC vs. contractiele iPSC-SMC's. A en B werden gewijzigd ten opzichte van Ye L, et al. 2. C en D werden gewijzigd ten opzichte van Zhang S, et al. 3. E en F zijn aangepast van Yang L, et al. 4. De gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Vergelijking tussen twee groepen werd geëvalueerd via T-test van de student, en vergelijking tussen verschillende groepen werd bepaald via one-way ANOVA. p <0,05 werd beschouwd significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Afgifte van groeifactoren uit microsferen. IGF-bevattende microsferen werd gesynthetiseerd (A). IGF-1 afgifte uit microsferen werd gemeten op 1, 3, 5 en 7 dagen na gesynthetiseerd (B). Schaal bar = 200 micrometer. Paneel A werd gemodificeerd van Ye L., et al. 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Evaluatie van de effectiviteit van celtherapie met iPSC-afgeleide trilineage CELls. De totale engraftment tarief voor de drie celpopulatie werd beoordeeld 4 weken na celtransplantatie (A). Hartfunctie (zoals aangegeven door ejectiefractie) en infarct werden geëvalueerd via cardiale MRI bij 1 en 4 weken na celtransplantatie (B). * P <0,05 versus MI; #p <0,05 versus Patch. A en B werden gewijzigd ten opzichte van Ye L., et al. 2. De gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Vergelijkingen tussen groepen werden geanalyseerd op significantie met ANOVA. p <0,05 werd als significant beschouwd. Resultaten geïdentificeerd als significant via ANOVA werden opnieuw geanalyseerd met de Tukey correctie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verbeterde Opbrengst / zuiverheid van iPSC-CM
Gebruikelijke protocollen voor het differentiëren van menselijke stamcellen in CM's zijn vaak beperkt door de lage opbrengst en zuiverheid; bijvoorbeeld, slechts 35-66% van de hESC-CM's verkregen via Percoll scheiding en cardiale vorming lichaam uitgedrukt langzaam myosine zware keten of cTnT 6. De zuiverheid van gedifferentieerde iPSC-CM populatie kan aanzienlijk worden verhoogd door het kiezen voor de expressie van een reportergen dat is gekoppeld aan de promotor van een CM-specifiek eiwit 7, 8, 9, maar deze techniek noodzakelijkerwijs het gebruik van genetisch gemodificeerde cellen, die minder wenselijk zijn, vooral voor klinisch onderzoek. Het protocol hier gepresenteerde 68% van de iPSC CM-expressie cTnT en de zuiverheid werd vervolgens tot> 90% via micro-dissectie en preplating verhoogd zonder genetische manipulatie of enkelvoudige-cel selectie. De totale opbrengst was ~ 3-5000000 iPSC-CM's per putje.
Verbeterde Opbrengst / Stabiliteit van iPSC-EC
De twee meest gebruikte iPSC-EC differentiatie protocollen gebaseerd op de co-kweek met murine stromale cellen 10, 11 en embryonale lichaam formatie 12, 13. De co-kweken methode kan leiden tot verontreiniging met xenogene muizen-afkomstcellen of eiwitten 10 en slechts ~ 15% of minder van de cellen geproduceerd via de embryonale lichaam methode uitgegaan van een EC-fenotype 10, 12, 13. De iPSC-EC differentiatie protocol hier gepresenteerde elimineert het risico van contaminatie en xenogene kan worden 3 maal efficiënter dan de methoden die embryonale organen (afhankelijk van iPSC lijn wordt gebruikt) gebruikt. Furthermerts, na zuivering via selectie voor CD31 expressie, ~ 90% van de EC-iPSC gehandhaafd EG fenotype gedurende ten minste 4 weken in vitro, vergeleken met slechts twee weken bij iPSC-EC geproduceerd volgens conventionele protocollen 12 differentiatie.
Fenotypische Specificatie van iPSC-SMC's
Het fenotype van een SMC (of een populatie van SMC's) is misschien het best beschreven als een balans tussen samentrekkende en overwegend synthetische kenmerken, wat kan leiden tot aanzienlijke verschillen in morfologie, marker expressie en activiteit. Aldus kan het nut van iPSC-SMC's voor een bepaalde toepassing afhankelijk van welk specifiek fenotype wordt gegenereerd. De iPSC SMC-differentiatie en zuiveringsvoorschriften hier gepresenteerde eerste overwegend contractiele of synthetische SMC populaties die ~ 95% zuiver in slechts 2-3 weken produceren, en de kans op besmetting xenogene minimaal, omdat de procedures niet requIre het gebruik van voedingscellen.
Verbeterde Engraftment Rate van getransplanteerde cellen
Een van de belangrijkste obstakels voor effectieve celtherapie wordt dat de extreem lage aantal toegediende cellen die geënt door het myocardium 14, 15, 16, 17 zijn. Cytokinen zoals IGF-1 kan enting verbeteren door de cellen beter bestand tegen de toxische micro in ischemische weefsels 18, 19, 20, maar de hoge drukken die optreden tijdens contractie kunnen de cellen knijp door de naald spoor en in de perifere circulatie. Dus de veel hogere implantatie verkregen door injectie van de cellen door een IGF-1-bevattende fibrine patch, die meer dan 2 maal hoger dan het aantal waargenomen wanneer de same celdosis werd toegediend zonder de patch kan waarschijnlijk worden toegeschreven aan zowel de cytobeschermende effecten van IGF-1 en de pleister zelf, die een fysieke barrière die de cellen voorkomen in de epicardiale ruimte worden uitgeworpen gevormd.
kritische stappen
De pluripotentie van de heupen cellen te waarborgen, moet het karyotype van de iPSC lijn voorafgaand aan differentiatie controleren, bepaalt de expressie van pluripotentie markers (Nanog, SSEA1 en Oct4, et al.) En bevestigen hun vermogen teratoma formatie . Er wordt voorgesteld om opnieuw controleren hun pluripotentie wanneer iPSC lijnen zijn gepasseerd voor meer dan 10 generaties. De status van ongedifferentieerde iPSC is ook van cruciaal belang voor de juiste differentiatie. Om de status van de iPSC voorafgaand aan het begin van differentiatie te waarborgen, is het raadzaam om: 1) Gebruik vers medium (minder dan twee weken oud), en de dagelijkse verfrissen het medium voor het begin van iPSC diffion; 2) vermindering van de enzymatische digestie (korter dan 5 min), en voorzichtig pipet op en neer de cellen om het onnodige schade aan de cellen te voorkomen; 3) replate de cellen bij een dichtheid van 1 x 10 5 cellen per putje van de 6-well plaat; 4) altijd de cellen in 37 ° C en 5% CO2 incubator en vermijden om de cellen uit de incubator gedurende langer dan 15 min.
Beperkingen van de Techniek
Het voornaamste nadeel van onze methode voor het combineren van geïnjecteerd-iPSC afgeleide hartcellen en patch administratie is de eis voor open-borst chirurgie; Daarom is deze benadering waarschijnlijk direct vertalen naar klinische toepassingen, behalve als adjuvante therapie voor patiënten die gelijktijdige coronaire revascularisatie chirurgie ondergaan worden. Meer wijdverbreid klinisch gebruik zal de ontwikkeling van een praktische en minimaal invasieve levermethode vereisen zoals een endoscope- en katheter gebaseerde benadering die mogelijk toeganghet hart via de buik en het middenrif. Bovendien is een van de meest kritische veiligheidsproblemen geassocieerd met cardiale celtherapie is de ontwikkeling van aritmogene complicaties, en als apen werden behandeld met intramyocardiale injecties van 1 miljard hESC afgeleide CM, alle vier de dieren ontwikkelde spontane aritmieën 21. Echter, zagen we geen bewijs van arrhythmogenic complicaties bij 10 miljoen-iPSC afgeleide CM's in de harten van varkens werden geïnjecteerd met IR letsel 2, misschien omdat de dosis cel was 100 maal kleiner.
Toekomstige toepassingen of richtingen
Afstoting speelt waarschijnlijk een belangrijke rol voor de lage innesteling tarief. De CRISPR / Cas-gen editing systeem kan onderzoekers in staat stellen om een lijn van "universele donor" hiPSCs door knock-out (KO) major histocompatibility complex (MHC) klasse I en klasse II te creëren. De iPSC MHC KO-afgeleide cellen en weefsels kunnen have aanzienlijk hogere tarieven van de implantatie. Als technieken te verbeteren, aanslaan tarieven zijn waarschijnlijk toenemen. Op bepaalde punt van de verhoging het transplantaat formaat is de grote transplantaat wordt naar de aritmie van het hart ontvanger verhogen. De vermindering van transplantaten geassocieerde aritmie kan worden bereikt door cellen met toename van gap junction eiwitten expressie van het gen voor het bewerken technologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol Section 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10 cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Protocol Section 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-β | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Protocol Section 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-β | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Protocol Section 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Protocol Section 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| ε-aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5 T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7 T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
References
- Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
- Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
- Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
- Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
- Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
- Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).
- Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
- Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
- Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
- Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
- Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
