Summary
我々は、心筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞およびパッチ媒介性サイトカインの送達と細胞注射を組み合わせることにより、移植細胞の生着を改善する配送方法に、ヒト人工多能性幹細胞を分化するための3つの新規かつより効率的なプロトコルを提示します。
Abstract
ヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）が完全に投与する前に、特定の細胞型に分化されなければならないが、心筋細胞（hiPSC-CMS）にhiPSCsを区別するための従来のプロトコル、内皮細胞（hiPSC-ECS）、および平滑筋細胞（平滑筋細胞）は、しばしば低収量、純度、および/または貧弱な表現型の安定性によって制限されます。ここで、我々は、新規hiPSC-のCMを生成するためのプロトコル、-ECs、実質的に従来の方法よりも効率的です-SMCs、ならびに投与のサイト上で作成されたサイトカインを含むパッチで細胞注入を組み合わせるための方法を提示します。パッチは、長期間にわたってインスリン様成長因子（IGF）を放出することにより、心筋から絞り出されてから細胞を防ぐために、針の軌道、及び細胞生存を封止することにより、注入された細胞の保持の両方を改善します。心筋虚血再灌流傷害のブタモデルにおいて、生着率が時より2倍大きかったです細胞は、細胞とパッチの両方を有するサイトカイン含有貼付せずに細胞に比べ、パッチ、および治療を投与したが、一人ではない細胞を用いて、心機能および梗塞サイズの大幅な改善と関連していました。
Introduction
ヒトの人工多能性幹細胞（hiPSCs）は、患者の免疫系によって拒絶されていない細胞の潜在的に無限の範囲と量に分化させることができるので、再生細胞療法のための最も有望な薬剤の一つです。 （平滑筋細胞を但し、自己複製および分化のための能力はまた、腫瘍形成につながる可能性があり、その結果、hiPSCsは、完全にこのような心筋細胞（CMS）、内皮細胞（EC）、および平滑筋細胞などの特定の細胞型に分化することが必要）、投与前。細胞投与の最も簡単で最も一般的な方法の1つは、直接心筋内注射であるが、本来の心筋組織により生着された移植細胞の数が非常に低いです。このスレの多くは、虚血組織の細胞毒性環境に起因することができます。しかし、マウスの胚性幹細胞（ESC）は、O、無傷心臓の心筋に直接注入しました。NLY〜配信500万細胞の40％は、それらが中に製造された高圧力によって針トラックを通って絞り出されたせいか、投与された細胞のかなりの割合は、投与部位を終了したことを示唆している3-5時間1、のために保持しました心筋収縮。
ここでは、（SMCの）4 hiPSC由来の心筋細胞（hiPSC-CMS）2、内皮細胞（hiPSC-ECS）3、および平滑筋細胞を生成するための新規かつ、実質的に、より効率的な方法を提示します。注目すべきは、このhiPSC-SMCプロトコルは、主に合成または収縮SMC表現型に向かって細胞を向けることによって、体細胞のSMC 5で観察された形態学的および機能的特性の広い範囲を模倣する最初のものです。我々はまた、サイトカインを含むフィブリンPを作成することにより、注入された細胞の生着率を改善細胞送達の方法を提供します注射部位の上にATCH。パッチは、少なくとも3日間の期間にわたってインスリン様成長因子（IGF）を放出することにより、心筋から出るセルを防止する針トラック、及び細胞生存を封止することにより、両方の細胞保持を改善するように見えます。
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Protocol
全ての実験手順は、アラバマ大学バーミンガム校の動物ガイドラインに従って行われています。
1. hiPSC-のCMにhiPSCsの区別
- 一晩4℃で予め冷却した成長因子低減ゼラチン状タンパク質混合物でコート6ウェルプレートのウェル。使用前にゲル状のタンパク質混合物を吸引。 10μMのROCK阻害剤とのmTeSR1培地補充で5％CO 2、37℃で細胞（ウェル当たり1×10 5細胞）プレコーティングしたプレート上にhiPSCsをシードし、文化。
- 細胞が90％コンフルエンスに達するまで毎日培地をリフレッシュ。その後、5％CO 2、37℃2日分以上の細胞成長因子低減ゼラチン状タンパク質培地への混合物（6ウェルプレート当たり0.5 mgのゼラチン状のタンパク質混合物、ウェルあたり2 mlの培地）、および文化を追加します。
- 培地を交換するには、静かにして真空を経由してペトリ皿から培地を吸い出します細胞をタッチアウト、および転送ピペットを使用して、新しいメディアを追加します。
- 成長因子低減ゼラチン状タンパク質混合物、インスリンなしB27および100ng / mlのアクチビンAを補ったRPMI1640培地で培地を交換し、分化を開始します。 24時間の培養を5％CO 2、37℃で細胞。
- インスリンなしB27を補充されたRPMI1640培地、10ng / mLの骨形成タンパク質4（BMP-4）、および10ng / mLの塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）を含む培地を交換し、 96時間培養を5％CO 2、37℃で細胞。
- B27を補充したRPMI1640培地で培地を交換し、培養を5％CO 2、37℃で細胞を続けます。 3日ごとに培地を更新します。
- 分化を開始した後3日〜、顕微鏡下で細胞を収縮のクラスターを観察します。最初の収縮を観察した後〜7日のクラスタを収集し、ハンクス平衡塩溶液でそれらを洗います。
- 穏やかに振盪しながら37ºCで10分間100 U / mlのコラゲナーゼIVを含むハンクスバッファーでそれらをインキュベートすることによってプレートにクラスタ化された細胞を解離させます。その後、5分間、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）中の0.25％トリプシンを加えます。
- RPMI / B27培地中で、10％ウシ胎児血清を酵素溶液を中和した後、RPMI / B27培地中で細胞を再懸濁。
- 血球計数器により細胞数をカウントします。培養非心筋細胞は、培養皿の表面に付着することを可能にする、少なくとも3時間、5％CO 2、37℃で10cmの皿に細胞。
- hiPSC-のCMが含まれている細胞懸濁液を、収集し、ゲル状のタンパク質混合物でコーティングされた表面上でそれらを培養することによって細胞（10cmディッシュあたり1×10の周りに6個の細胞）を維持します。
2. hiPSC-ECのにhiPSCsの区別
- 目をインキュベートすることにより単一細胞にhiPSC集団を解離5分間、5％CO 2、37℃でのキレート剤とEM。新鮮なmTeSR1培地を含む15ミリリットルの遠心チューブに細胞を移します。
- 5分間、200×gで細胞をスピンダウン。 10μMのROCK阻害剤を補充したmTeSR1培地で細胞を再懸濁します。血球計数器を用いて細胞密度を決定します。
- 24ウェルプレートの1ウェルに20 NIH単位/ mlのトロンビン溶液の250μlのを追加します。
- 12.5 mg / mlでフィブリノゲン溶液の250μlに1×10 6 hiPSCsを追加します。そして、トロンビンロードウェルに細胞含有フィブリノーゲン溶液の250μlを添加します。混合物を分以内hiPSC含有フィブリン足場を形成するために固化観察します。
- カバーガラスをピンセットで6ウェルプレートのウェルに凝固、細胞を含む足場を転送し、インスリンなしで2％のB27を補充した2 mlのEBM2培地で足場を培養することによって分化を開始し、アクチビンA（50ngの/ミリリットル）、及びBMP-4（25 ngの/ ml）を、5％CO 2で24時間
- 細胞を穏やかに触れることなく真空を介して、古い培地を吸引して培地を交換してください。インスリンなしB27を補充した新しいEBM2培地、血管内皮増殖因子（VEGF、50ngの/ mlで）、エリスロポエチン（EPO、100ng / mlの）、およびトランスフォーミング増殖因子β1（TGFβ1、を10ng / ml）を、培養に追加48時間、5％CO 2、37℃で足場。
- さらに48時間、5％CO 2、37℃で培地および培養足場を更新します。その後、培地に200 UのコラゲナーゼIV（100U / ml）を添加することによって、足場から細胞を放出します。
- 彼らがリリースされた後に細胞をスピンダウン。 B27、VEGF-A（50 ngの/ mlの）、およびSB-431542（10μM）の2％を補充した2ミリリットルEGM2-MV培地で培地を交換してください。 2日毎に培地を更新します。
- 約10日後（ すなわち 、分化が開始された後に14〜日に）、Hを分離、100 U / mlのコラゲナーゼIVで細胞を解離フローサイトメトリーを介した分化細胞の集団からIPSC-のECは、EC特異的マーカータンパク質の発現について解析する（ 例えば 、CD31、CD144）3。
- 確立されたプロトコル3を介して、単離されたhiPSC-のECを展開します。
3. hiPSC-のSMCにhiPSCsの区別
- コンフルエント（〜2日）まで、毎日培地交換で、5％CO 2、37℃でゲル状のタンパク質の混合物でコーティングされたプレート、および文化へのhiPSCs mTeSR1培地中で細胞をシード。
- 3日間RPMI1640培地と2％のB27プラスインスリンでCHIR99021（5μM）およびBMP-4（10ng / ml）で細胞を培養することにより、中胚葉系細胞への分化を開始します。
- 主に合成表現型とhiPSC-たSMCを生成するには：
- 培養RPMI1640私におけるVEGF-A（25ngの/ ml）を、線維芽細胞成長因子β（FGFβ、5 ngの/ mlで）を有する細胞 dium、4日間、5％CO 2、37℃で2％のB27マイナスインスリン。
- 5％CO 2、37℃で培養VEGF-A（25ngの/ ml）でのセル、FGFβ（5 ngの/ ml）をRPMI1640培地中で、2％のB27プラスインスリン 2日間Cを°。
- 培養血小板由来成長因子β（PDGFβ、を10ng / ml）を、TGFβ、5％CO 2、37℃でRPMI1640（3 NG / ml）を、2％のB27を加えたインスリンのセル 4日間Cを°。
- 主に収縮表現型とhiPSC-たSMCを生成するには：
- RPMI1640および2％のB27のマイナスインスリンにおけるVEGF-A（25 ngの/ ml）及びFGFβ（5 ngの/ ml）で培養4日間細胞を。
- RPMI1640および2％B27プラスインスリンにおけるPDGFβ（5ng / ml）およびTGFβ（2.5 ngの/ ml）で7日間培養細胞を。
- 〜6日間RPMI1640代謝培地を含有する乳酸（4ミリモル）で細胞を培養することにより、最終的なhiPSC-SMC集団を精製します。
- 水浴中で45℃にオリーブオイルを加熱します。
- 加熱を50℃に10％ゼラチン溶液5ml。
- オリーブオイル、攪拌にゼラチンを追加し、水浴に氷を添加することにより、5℃に、その後急速に冷却します。
- 25分後に、マイクロスフェアの形成を誘導するためにオリーブオイルを冷蔵（4℃）アセトンを追加します。
- 5の温度を維持します 1時間°C;その後、オリーブオイルを除去するために、予め冷却したアセトンでそれらを5回洗浄し、マイクロスフェアを収集し、4℃で空気乾燥し、それらを可能にします。
- 架橋を誘導するために、一晩4℃で70％エタノールおよび0.25％グルタルアルデヒド溶液でマイクロスフェアを再懸濁し、次いで、100mMグリシンとの混合物を中和します。
- 5μgのIGFの30分間、0.1％ウシ血清アルブミンを含有するH 2 Oを蒸留15μlの5 mgの微小球を混合してマイクロスフェアに負荷IGF。
5.損傷部位の上にパッチを作成し、細胞を注入
- 1ミリリットル最小必須培地（MEM）で一緒にhiPSC由来のSMC（100万）のCM（2百万円）と、電気部品（100万）を一時停止します。
- 1ミリリットルフィブリノゲン溶液（25 mg / mlで）中の微小球の5ミリグラムを一時停止します。
- 細胞含有液、フィブリノーゲン/マイクロスフェア溶液と別の注射器、およびトロンビン溶液1mlを有する第3シリンジで1注射器を記入（80 NIH単位は/ミリリットル、2μlの400 mMの塩化カルシウムおよび200mMのεアミノカプロンを補っ酸）。
- 外科2の前に説明したように左冠動脈前下行枝の結紮を介し豚の心に心筋梗塞を誘発します。
注：簡単な、女性ヨークシャーブタ（〜13キロ、年齢の45日）でテラゾール/キシラジン（4.4ミリグラム/キログラム）の筋肉内注射で鎮静され、およびイソフルラン（0.5から5パーセント）で全身麻酔下挿管。 4 番目の intercostal開胸を行い、左前下降冠状動脈を露出しています。冠状動脈を60分間結紮によって閉塞され、次いで、結紮を除去します。即時の電気的除細動は、心室細動の場合に行われます。 - 豚の心臓の梗塞領域の心外膜上の位置滅菌プラスチックリング（〜2.5センチメートル）、その後、同時にリングにマイクロスフェア/フィブリノゲンとトロンビンのソリューションを注入します。
- 混合物は、（〜30秒）固化することを許可し、その後、梗塞心筋に固化した混合物を介して細胞含有注射器の針を挿入し、細胞を注入します。動物の大きさに応じて、3-0または2-0モノクリル縫合糸で筋肉層、皮下組織、および胸壁を閉じます。ブプレノルフィン0.01〜0.02ミリグラム/ kgの筋肉内注射の8時間ごとに、手術後の最初の3日間、疼痛を制御するために使用されます。
- 心臓磁気共鳴を用いた心機能を評価します外科手術、一週間、手術手順2、3、4後4週間前にイメージング（MRI）。最終的なMRI研究の後、動物を犠牲にし、組織学および分子解析2、3、4のための彼らの心を処理します。
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Representative Results
差別hiPSC-CMを、-ECs、および-SMCsのキャラクタリゼーション
hiPSCsの微分容量は2、3、4を評価しました。フローサイトメトリー心臓トロポニンT（cTnTの）の発現の分析は、最終的なhiPSC-CM集団の純度は90％（ 図1A、1B、パネルB1）を超えることができることを示唆しています。約25％がミオシン軽鎖（MLC2v）（ 図1B、パネルの2Vアイソフォームを発現したほぼすべての細胞のは、遅いミオシン重鎖（ 図1B、パネルA1）、α-筋節アクチン（ 図1B、パネルA2）で表さ唯一の心室のCM 4で発見されたB2）、。 hiPSC-ECの分化プロトコール（ すなわち 、CD31 +細胞の割合）の効率は物質でしたPCBC16iPS細胞（31.3パーセント、 図1C、パネルD2）よりもグリップライン（45.6パーセント、 図1C、パネルC2）からhiPSCsで行ったときLLY高いです。 、> 95％純度の集団は、CD31発現についての選択を介して達成された、および選択された細胞の> 90％の場合B27、VEGFを補充（FBSなし）EGM2-MV培地で培養し、最大4週間のCD31またはCD144を発現し続けおよびSB431542（ 図1D）3。精製されたhiPSC-のSMCの94％以上は、平滑筋アクチン（SMA）を発現したが、合成hiPSC-のSMCは、コラーゲン1、コネキシン43、またはビメンチン（ 図1E）を表現するために、収縮hiPSC-SMCがより可能性が高かったです。 hiPSC-のSMCの移動および増殖能力は4を評価しました。合成hiPSC-のSMCはまた、収縮hiPSC-SMCがより渡り鳥と増殖した（ 図1F、パネルIおよびII）、収縮のSMCは、より強く収縮しながら私nはカルバコール処理に応答した （ 図1F、パネルIII、IVおよびV）。
ゼラチンマイクロスフェアからの成長因子のリリース
培養し、無細胞のパッチからの培地におけるIGF-1レベルのELISA測定は、増殖因子が、少なくとも3日間（ 図2A）2かけて微小球から放出されたことを示しました。分析は、5μgのIGF-1とIGF-含有ミクロスフェア5mgをロードすることによって行いました。パッチを、1mlのフィブリノーゲン溶液および1mLのトロンビンとマイクロスフェアを混合することにより生成しました。パッチは、2ミリリットルMEM中で培養しました。培地の1mlを採取し、新鮮なMEM 1mlの毎日（ 図2B）と交換しました。データは、平均±SEMとして示しました。
IR-傷害モデルからの観察
2のブタモデルにおいて研究されてきました。 600万hiPSC-CMS、-ECs、および-SMCs（各細胞型の200万）の合計は、傷ついた心筋組織に直接注入しました。 CELL群の動物は、同じセルの用量ではなく、パッチなしで処理した一方でCELL +パッチ群の動物については、フィブリンおよびIGF-1を含有するマイクロスフェアで構成されるパッチは、注入前に傷害部位の上に作成されました。両方の処理は、MI群の動物から源泉徴収されました。四週間損傷および治療後、CELL +パッチ群の動物に送達する細胞の9％は、細胞群に動物に投与される細胞のわずか4％に比べて、保持され、投与部位で生存し続けた（ 図図3（a））。細胞およびパッチの両方を用いた治療ではなく、単独の細胞とは、またassociました心機能および梗塞サイズの測定値の有意な改善（ 図3B）でated。
図1：心筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞への分化hiPSCs。心筋細胞分化およびhiPSC-CMSの純度は、異なる心臓マーカー（B）を用いてフローサイトメトリー（A）および組織学によって評価しました。 hiPSCの内皮分化は、フローサイトメトリー（C）を用いて測定しました。 hiPSC-ECの内皮細胞表現型の維持は、フローサイトメトリー（D）による精製の後、2,3、および4週目にCD31およびCD144の発現を分析することによって評価しました。 hiPSCの平滑筋細胞の分化は、種々のマーカー（E）によって測定しました。との移動および増殖の可能性hiPSCs由来する収縮、平滑筋細胞対合成平滑筋細胞（F）を評価しました。核は、免疫蛍光染色にDAPIで対比染色しました。 （B）及び200μmの（EおよびF）における=100μmのスケールバー。合成hiPSC-のSMCの移動および増殖能力は（F、パネルIおよびII）を評価しました。およびカルバコールの治療に応答した収縮性のSMCの収縮（F、パネルIII-V）を評価しました。 * P <0.05、合成hiPSC-SMCの収縮hiPSC-SMCの対。 A及びBはイエL、 らから変更されました。 2。 C及びDは、チャンS らから変更されました。 3。 EとFはヤンL、 らから変更されました。 4。データは、平均±平均の標準誤差（SEM）として発表されました。両群間の比較は、スチューデントのt検定によって評価し、複数のグループ間の比較は一方向ANOVAによって評価しました。 P <0.05をsignifiと考えられましたカント。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：マイクロスフェアからの成長因子のリリース。 IGF含有ミクロスフェアを合成した（A）。彼らは（B）を合成した後にマイクロスフェアからのIGF-1放出は1、3、5、7日目に測定しました。スケールバー=200μmです。パネルAはイェL.、 らから変更されました。 2。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：hiPSC由来の3血球系セル画と細胞治療の効率の評価lsの。 3つの細胞集団の全体的な生着率は4週細胞移植（A）後に評価しました。心臓機能（駆出分画によって示される）および梗塞サイズは、細胞移植（B）の後1~4週目に心臓MRIを介して評価しました。 * MI対のp <0.05; #P <パッチ0.05対。 A及びBはイエL.、 らから変更されました。 2。データは、平均±SEMとして示しました。群間の比較は一方向ANOVAで有意性について分析しました。 P <0.05を有意とみなしました。 ANOVAを経由して有意であると同定された結果は、テューキー補正で再分析しました。
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Discussion
hiPSC-のCMの歩留まりの向上/純度
CMSにヒト幹細胞を分化するための従来のプロトコルは、多くの場合、低い収率および純度によって制限されます。例えば、ヒトES細胞-CMSのわずか35から66まで%は遅いミオシン重鎖またはcTnTの6を表明パーコール分離および心臓体形成を介して得られます。分化hiPSC-CM集団の純度は、実質的にCM特異的タンパク質7、8、9のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子の発現のために選択することによって増加させることができるが、この手法は必ずしも遺伝的に改変されたの使用を必要とします特に臨床研究のために、望ましくない細胞、。ここで紹介するプロトコルでは、hiPSC-CMSの68％は、cTnTのを表明し、純度はその後、遺伝子操作または単一ずに顕微解剖し、プレめっきを経由しての> 90％増加しました-cell選択。総収量はウェルあたり〜3から5000000 hiPSC-のCMでした。
hiPSC-ECの歩留まりの向上/安定性
二つの最も一般的に使用されるhiPSC-ECの分化プロトコルは、マウス間質細胞10、11及び胚体形成12,13との共培養に基づくものです。しかし、共培養法は、マウス系列細胞またはタンパク質10、およびのみ〜15％または胚体法EC表現型10、12、13を想定介して、産生された細胞の少ないと異種の汚染につながる可能性があります。ここで提示hiPSC-ECの分化プロトコルは、異種汚染のリスクを排除し、最大である（hiPSCラインが使用されるに応じて）は、胚体を使用する方法よりも効率3倍ことができます。 Furtherm鉱石は、CD31の発現のための選択を介して精製した後、〜hiPSC-ECの90％は、hiPSC-ECのは、従来の分化プロトコル12を介して生成されたわずか2週間に比べて、in vitroで少なくとも4週間EC表現型を維持しました。
hiPSC-のSMCの表現型の仕様
SMCの表現型（または平滑筋細胞の人口は）おそらく最高の形態学、マーカー発現、及び活性の実質的な違いにつながることができ、主に収縮および合成の特性、バランスとして記載されています。従って、特定のアプリケーションのためのhiPSC、平滑筋細胞の有用性は、特定の表現型が生成されるに依存し得ます。ここで提示hiPSC-SMC分化および精製プロトコルは、わずか2〜3週間で〜95％純粋である、主に収縮または合成SMC集団を生成するために最初のものである、と手続きがないのrequんので異種汚染の危険性は、最小限でありますフィーダー細胞の使用をIRE。
移植細胞の生着率を改善しました
有効な細胞治療に対する主要な障害の一つは、心筋14、15、16、17によって移植された投与された細胞の非常に少ない数であると考えられています。このようなIGF-1などのサイトカインは、より良い、虚血組織18、19、20で有毒な微小環境に耐えるように細胞を可能にすることによって、生着を向上させることができるが、収縮の間に誘起される高い圧力は、針トラックを通って、末梢循環に細胞を絞り出すことができます。このように、移植のかなり高い割合は、SAM観察された速度よりも2倍大きかったIGF-1含有フィブリンパッチを介して細胞を注入することによって達成しますE細胞用量は、パッチなしで投与された可能性心外膜空間に放出されることから細胞を防ぐ物理的障壁を形成し、パッチ自体、IGF-1の細胞保護効果及びの両方に起因し得ます。
重要なステップ
HIPS細胞の多能性を確保するために、前の分化のhiPSCラインの核型を確認する多能性マーカー（Nanogの、SSEA1とOct4の、 ら ）の発現を決定し、テラトーマ形成する能力を確認する必要があります。 hiPSCラインが10以上の世代のために継代されたときに、その多能性を再確認することが示唆されています。未分化hiPSCのステータスも正しい分化に重要です。分化の開始に先立ってhiPSCの状態を確実にするために、それがすることをお勧めします：1））（2週間未満の古い新鮮な培地を使用し、hiPSCのdifferentiatの開始前、毎日培地をリフレッシュイオン; 2）酵素消化時間（5分未満）を低減し、穏やかにピペッティングアップ及び細胞下の細胞への不要な損傷を防止します。 3）の密度で6ウェルプレートのウェルあたり1×10 5個の細胞を細胞replate。 4）常に37℃、5％CO 2インキュベーター中で細胞を維持し、より長い15分間インキュベーターのうち、細胞を維持することは避けてください。
テクニックの制限事項
注入されたhiPSC由来の心筋細胞およびパッチ管理を組み合わせるための我々の方法の主な欠点は、開胸手術のための要件です。このように、このアプローチは、同時冠動脈血行再建術を受けている患者のための補助療法として除いて臨床応用への直接翻訳可能になることはほとんどありません。より広範な臨床使用は、アクセスすることができましたendoscope-とカテーテルベースのアプローチとして、実用的かつ低侵襲性の配送方法の開発が必要になります腹部および横隔膜を通して心。さらに、心臓の細胞療法に関連した最も重要な安全上の懸念の一つは、不整脈惹起性合併症の発症であり、サルは10億hESC由来のCMの心筋内注射で処理した場合、動物のすべての4つは、自発的な不整脈21を開発しました。しかし、我々は、細胞の投与量は100倍小さかったせいか千万hiPSC由来のCMは、IR傷害2と豚の心臓に注入した催不整脈性合併症の証拠は認められませんでした。
将来のアプリケーションや行き方
免疫拒絶はおそらく低い生着率に重要な役割を果たしています。 CRISPR / Casの遺伝子編集システムは、ノックアウト（KO）主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスIおよびクラスIIによって「普遍的ドナー」hiPSCsの行を作成するために、研究者を可能にすることができます。 hiPSC MHC KO由来の細胞や組織もよい時間移植の実質的に高い速度をaveの。技術が改善されるように、生着率が増加する可能性があります。増加グラフトサイズの特定の時点で、大規模な移植片は、レシピエントの心臓の催不整脈性を増加すると予想されます。移植関連催不整脈性の低減は、遺伝子編集技術によるギャップジャンクションタンパク質の発現の増加を有する細胞を使用することによって達成することができます。
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Disclosures
なし。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol Section 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10 cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Protocol Section 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-β | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Protocol Section 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-β | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Protocol Section 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Protocol Section 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| ε-aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5 T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7 T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
References
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