Summary
Presentamos tres protocolos nuevos y más eficientes para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidos por el hombre en cardiomiocitos, células endoteliales, y células del músculo liso y un método de entrega que permite mejorar el injerto de las células transplantadas mediante la combinación de la inyección de células con la entrega de citoquinas parche mediada.
Abstract
Las células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs) deben estar completamente diferenciadas en tipos específicos de células antes de la administración, pero los protocolos convencionales para diferenciar hiPSCs en cardiomiocitos (hiPSC-CM), células endoteliales (hiPSC-ECS), y células musculares lisas (CML) son a menudo limitado por bajo rendimiento, la pureza, y / o una pobre estabilidad fenotípica. A continuación, presentamos nuevos protocolos para la generación de hiPSC-CM, -ECs y -SMCs que son sustancialmente más eficiente que los métodos convencionales, así como un método para la combinación de la inyección de células con un parche que contiene citoquinas creado sobre el sitio de administración. El parche mejora tanto la retención de las células inyectadas, sellando el trayecto de la aguja para evitar que las células de ser exprimido hacia fuera del miocardio, y la supervivencia celular, mediante la liberación de factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) durante un período prolongado. En un modelo porcino de la lesión por isquemia-reperfusión del miocardio, la tasa de injerto era más de dos veces mayor cuando lalas células se administraron con el parche que contiene citoquinas en comparación con las células sin parche, y el tratamiento tanto con las células y el parche, pero no con las células solas, se asoció con una mejora significativa en la función cardíaca y el tamaño del infarto.
Introduction
células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs) están entre los agentes más prometedores para la terapia de células regenerativas, ya que pueden ser diferenciadas en una gama potencialmente ilimitado y la cantidad de células que no son rechazadas por el sistema inmune del paciente. Sin embargo, su capacidad de auto-replicación y diferenciación también puede conducir a la formación de tumores y, en consecuencia, hiPSCs necesitar ser totalmente diferenciado en tipos celulares específicos, tales como los cardiomiocitos (CMS), las células endoteliales (EC), y células de músculo liso (SMCs ), antes de la administración. Uno de los métodos más simples y más comunes de administración de las células es la inyección intramiocárdica directa, pero el número de células trasplantadas que se injerta el tejido miocárdico nativa es excepcionalmente bajo. Gran parte de este desgaste se puede atribuir al medio ambiente citotóxica del tejido isquémico; sin embargo, cuando eran células madre embrionarias murinas (CES) inyectados directamente en el miocardio del corazón no lesionados, oólo ~ 40% de los 5 millones de células entregadas fueron retenidas para 3-5 hr 1, lo que sugiere que una proporción sustancial de las células administradas salió del sitio de administración, tal vez porque se exprimen a través del trayecto de la aguja por las altas presiones que se producen durante contracción del miocardio.
A continuación, presentamos los métodos novedosos y sustancialmente más eficientes para la generación de cardiomiocitos derivados de hiPSC (hiPSC-CM) 2, las células endoteliales (hiPSC-ECS) 3, y las células musculares lisas (CML) 4. En particular, este protocolo hiPSC-SMC es la primera para imitar la amplia gama de características morfológicas y funcionales observados en somático SMCs 5 por la dirección de las células hacia un fenotipo predominantemente SMC sintético o contráctil. También proporcionamos un método de suministro de células que mejora la tasa de injerto de las células inyectadas por la creación de una que contiene citoquinas fibrina patch sobre el sitio de inyección. El parche parece mejorar tanto la retención de células, mediante el sellado del trayecto de la aguja para evitar que las células salgan del miocardio, y la supervivencia celular, mediante la liberación de factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) durante un período de al menos tres días.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las Directrices de Animales de la Universidad de Alabama en Birmingham.
1. Diferenciar hiPSCs en hiPSC-CM
- Escudo los pocillos de una placa de 6 pocillos con una reducción del factor de crecimiento pre-enfriado mezcla de proteína gelatinosa a 4 ° C durante la noche. Aspirar la mezcla de proteína gelatinosa antes de su uso. Sembrar las hiPSCs sobre las placas pre-recubiertas, y cultivar las células (1 x 10 5 células por pocillo) en 5% de CO2 y 37 ° C en mTeSR1 suplemento de medio con el inhibidor de Rock 10 mM.
- Refrescar el medio todos los días hasta que las células alcanzan el 90% de confluencia; a continuación, añadir la reducción del factor de crecimiento mezcla de proteína gelatinosa al medio (0,5 mg mezcla gelatinosa proteína por placa de 6 pocillos, 2 ml de medio por pocillo), y cultivar las células durante 5% de CO2 y 37 ° C dos días más.
- Para reemplazar el medio, con cuidado aspirar el medio de la placa de Petri con medio de vacíofuera de tocar las células, y añadir nuevo medio utilizando una pipeta de transferencia.
- Iniciar la diferenciación mediante la sustitución del medio con medio RPMI1640 suplementado con factor de crecimiento reducido mezcla de proteína gelatinosa, B27 sin insulina, y 100 ng / ml de activina A; cultivar las células en 5% de CO2 y 37 ° C durante 24 horas.
- Reemplazar el medio con medio RPMI1640 que ha sido suplementado con B27 sin insulina, 10 ng / ml de proteína morfogénica ósea 4 (BMP-4), y 10 factor de ng / ml de crecimiento fibroblástico básico (bFGF); cultivar las células en 5% de CO2 y 37 ° C durante 96 horas.
- Reemplazar el medio con medio RPMI1640 suplementado con B27 y continuar cultivar las células en 5% de CO2 y 37 ° C; refrescar el medio cada 3 días.
- Observe grupos de células bajo el microscopio contraer ~ 3 días después de iniciar la diferenciación. Recoge los grupos ~ 7 días después de observar primero las contracciones y lavarlos en solución salina equilibrada de Hanks.
- Disociar las células agrupadas en la placa mediante su incubación en tampón de Hanks que contiene 100 U / ml de colagenasa IV durante 10 min a 37 ºC con agitación suave; a continuación, añadir 0,25% de tripsina en ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) durante 5 min.
- Neutralizar la solución de enzima con suero bovino fetal al 10% en medio RPMI / B27 y luego volver a suspender las células en medio / B27 RPMI.
- Contar el número de células mediante un hemocitómetro. Cultivar las células en placas de 10 cm en 5% de CO2 y 37 ° C durante al menos 3 horas, lo que permitirá que las células no cardiomiocitos a que se adhieran a la superficie de la placa de cultivo.
- Recoger la suspensión celular, que contiene el hiPSC-CM, y mantener las células (alrededor de 1 x 10 6 células por placa de 10 cm) mediante el cultivo en una superficie recubierta mezcla de proteína gelatinosa.
2. Diferenciar hiPSCs en hiPSC-EC
- Disociar la población hiPSC en células individuales mediante la incubación de THem con el agente quelante en 5% de CO2 y 37 ° C durante 5 min. Transferir las células a un tubo de centrífuga de 15 ml que contenía medio mTeSR1 fresco.
- Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min. Resuspender las células en medio mTeSR1 suplementado con inhibidor de Rock 10 mM. Determinar la densidad celular con un hemocitómetro.
- Añadir 250 l de solución de trombina de 20 unidades NIH / ml a un pocillo de una placa de 24 pocillos.
- Añadir 1 x 10 6 hiPSCs a 250 l de una solución de fibrinógeno 12,5 mg / ml. Y añadir los 250 l de solución de fibrinógeno que contiene células de la trombina-cargado también. Observe que la mezcla se solidifique para formar una matriz de fibrina que contiene hiPSC-dentro min.
- La transferencia de los, andamios que contienen células solidificados en los pocillos de una placa de 6 pocillos con las pinzas de vidrio de cubierta, e iniciar la diferenciación mediante el cultivo de los andamios en 2 ml de medio EBM2 suplementado con 2% B27 sin insulina, activina-A (50 ng / ml), y BMP-4 (25 ng / ml) durante 24 horas a 5% de CO
- Vuelva a colocar suavemente el medio por aspiración de la media de edad a través del vacío sin tocar las células. Añadir nuevo medio EBM2 suplementado con B27 sin insulina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, 50 ng / ml), eritropoyetina (EPO, 100 ng / ml), y la transformación de β1 de factores de crecimiento (TGFß1, 10 ng / ml), y la cultura de la andamios en 5% de CO 2 y 37 ° C durante 48 horas.
- Refrescar el medio y la cultura de los andamios en 5% de CO2 y 37 ° C durante otras 48 horas; entonces, liberar las células de la andamio mediante la adición de 200 U de colagenasa IV (100 U / ml) al medio.
- Centrifugar las células después de que se liberan. Reemplazar el medio con 2 ml de medio EGM2-MV suplementado con 2% de B27, VEGF-A (50 ng / ml), y SB-431542 (10 mM); refrescar el medio cada dos días.
- Aproximadamente 10 días más tarde (es decir, en ~ Día 14 después de que se inició la diferenciación), disociar las células con 100 U / ml de colagenasa IV, aislar hIPSC-ECs de la población de células diferenciadas a través de citometría de flujo se analizan para la expresión de proteínas marcadoras EC-específicos (por ejemplo, CD31, CD144) 3.
- Ampliar el aislado hiPSC-EC a través de un protocolo establecido 3.
3. Diferenciar hiPSCs en hiPSC-CML
- Sembrar el hiPSCs en placas que han sido recubiertas con la mezcla de proteína gelatinosa, y cultivar las células en medio mTeSR1 en 5% de CO2 y 37 ° C, con cambios de medio día, hasta la confluencia (~ 2 días).
- Iniciar la diferenciación en células de linaje mesodérmico-cultivando las células con CHIR99021 (5 M) y BMP-4 (10 ng / ml) en medio RPMI1640 y 2% B27 más insulina durante 3 días.
- Para producir hiPSC-CML con un fenotipo predominantemente sintético:
- Cultivar las células con VEGF-A (25 ng / ml), factor de crecimiento de fibroblastos (β FGFβ, 5 ng / ml) en RPMI1640 me Dium, y 2% B27 menos insulina en 5% de CO2 y 37 ° C durante 4 días.
- Cultivar las células en VEGF-A (25 ng / ml), FGFβ (5 ng / ml) en medio RPMI1640, y 2% B27 más insulina en 5% de CO2 y 37 ° C durante 2 días.
- Cultivar las células en derivados de las plaquetas del factor de crecimiento β (PDGFβ, 10 ng / ml), TGF (3 ng / ml) en RPMI1640, y 2% B27 más insulina en 5% de CO2 y 37 ° C durante 4 días.
- Para producir hiPSC-CML con un fenotipo predominantemente contráctil:
- Cultivar las células durante 4 días con VEGF-A (25 ng / ml) y FGFβ (5 ng / ml) en RPMI1640 y 2% de insulina B27 menos.
- Cultivar las células durante 7 días con PDGFβ (5 ng / ml) y TGF (2,5 ng / ml) en RPMI1640 y 2% B27 más insulina.
- Se purifica el finales poblaciones hiPSC-SMC cultivando las células en lactato (4 mM) que contenía medio RPMI1640 metabólica para ~ 6 días.
- aceite de oliva de calor a 45 ° C en un baño de agua.
- Heat 5 ml de solución de gelatina al 10% a 50 ° C.
- Añadir la gelatina para el aceite de oliva, remover, y luego enfriar rápidamente a 5 ° C mediante la adición de hielo en el baño de agua.
- Veinticinco minutos después, añadir acetona fría (4 ° C) para el aceite de oliva para inducir la formación de microesferas.
- Mantener la temperatura a 5 ° C durante 1 hora; a continuación, recoger las microesferas, ellos lavar 5 veces con acetona enfriada previamente para eliminar el aceite de oliva, y permitir que se seque al aire a 4 ° C.
- Resuspender las microesferas en una solución de 70% de etanol y 0,25% de glutaraldehído durante la noche a 4 ° C para inducir la reticulación y, a continuación neutralizar la mezcla con glicina 100 mM.
- Cargar IGF en las microesferas mediante la mezcla de 5 mg de microesferas con 15 l H 2 O destilada que contenía 5 mg de IGF y 0,1% de albúmina de suero bovino durante 30 min.
5. Creación del parche sobre el sitio de la lesión y inyectando las células
- Se suspende el derivado de hiPSC CM (2 millones), SMC (1 millón) y EC (1 millón), así como en 1 ml de medio esencial mínimo (MEM).
- Suspender 5 mg de microesferas en 1 ml de solución de fibrinógeno (25 mg / ml).
- Llene una jeringa con la solución que contiene células, otra jeringa con la solución de fibrinógeno / microesfera, y tercera jeringa con 1 ml de solución de trombina (80 unidades NIH / ml, suplementadas con 2 l 400 mM CaCl 2 y 200 mM ε-aminocaproico ácido).
- Quirúrgicamente inducir el infarto de miocardio en el corazón porcina a través de la ligadura de la arteria descendente anterior coronaria como se ha descrito antes 2.
NOTA: En breve, cerdos Yorkshire hembra (~ 13 kg, 45 días de edad) son sedados con una inyección intramuscular de zoletil / xilazina (4,4 mg / kg), y fue intubado bajo anestesia general con isoflurano (0,5-5%). Un 4º interctoracotomía ostal se lleva a cabo y se fue arteria coronaria descendente anterior se expone. La arteria coronaria se ocluye por una ligadura para 60 min y luego se elimina la ligadura. desfibrilación eléctrica inmediata se realiza en el caso de la fibrilación ventricular. - Coloque un anillo de plástico estéril (~ 2,5 cm) en el epicardio de la zona del infarto de corazón de cerdo, y luego inyectar simultáneamente las soluciones de microesferas / fibrinógeno y trombina en el anillo.
- Dejar que la mezcla se solidifique (~ 30 seg), y luego insertar la aguja de la jeringa que contiene células a través de la mezcla solidificada en el miocardio infartado e inyectar las células. Cierre las capas musculares, tejido subcutáneo y de la pared torácica con 3-0 o 2-0 monocryl de sutura según el tamaño del animal. La buprenorfina 0,01-0,02 mg / kg inyección intramuscular se utilizará cada 8 horas para controlar el dolor durante los primeros 3 días después de la cirugía.
- Evaluar la función cardíaca mediante una resonancia magnética cardiacaformación de imágenes (MRI) antes del procedimiento quirúrgico, una semana y cuatro semanas después del procedimiento quirúrgico 2, 3, 4. Después de los estudios finales de resonancia magnética, sacrificar al animal y procesar sus corazones para histología y análisis molecular 2, 3, 4.
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Representative Results
Caracterización de Diferenciada hiPSC-CM, -ECs, y -SMCs
La capacidad diferencial de hiPSCs se evaluaron 2, 3, 4. Flujo de análisis de citometría de T expresión troponina cardíaca (cTnT) sugieren que la pureza de la población final hiPSC-CM puede exceder de 90% (Figura 1A, 1B, panel de B1). Casi todas las células expresaron miosina lenta cadena pesada (Figura 1B, panel de A1), la actina α-sarcoméricas (Figura 1B, panel de A2), mientras que aproximadamente el 25% expresa la isoforma 2v de la cadena ligera de la miosina (MLC2v) (Figura 1B, el panel B2), que se encuentra sólo en los CM ventricular 4. La eficiencia del protocolo de diferenciación hiPSC-CE (es decir, el porcentaje de CD31 + células) fue sustanciaLLY más alta cuando se realiza con hiPSCs de la línea Grips (45,6%, Figura 1C, panel de C2) que con las células PCBC16iPS (31,3%, Figura 1C, panel de D2); se lograron poblaciones de> 95% de pureza a través de la selección para la expresión CD31, y> 90% de las células seleccionadas continuaron expresando CD31 o CD144 para un máximo de 4 semanas cuando se cultivan en medio EGM2-MV (sin FBS) suplementado con B27, VEGF, y SB431542 (Figura 1D) 3. Más de 94% de la purificada hiPSC-SMCs expresa actina de músculo liso (SMA), pero sintético hiPSC-SMCs eran más propensos que contráctil hiPSC-SMCs para expresar colágeno 1, la conexina 43, o vimentina (Figura 1E). La capacidad de migración y proliferación de hiPSC-SMCs se evaluaron 4. Sintética hiPSC-CML también fueron más migratoria y proliferativa que contráctil hiPSC-CML (Figura 1F, paneles I y II), mientras que las SMC contráctiles contrajo con más fuerza in respuesta al tratamiento de carbacol (Figura 1F, los paneles III, IV y V).
Factor de crecimiento de lanzamiento a partir de gelatina microesferas
Mediciones de ELISA de IGF-1 en los niveles en el medio de parches cultivadas, libres de células indicaron que el factor de crecimiento fue liberado de las microesferas durante un período de al menos 3 días (Figura 2A) 2. Los análisis se realizaron mediante la carga de 5 mg de microesferas que contienen IGF-con 5 g de IGF-1. Un parche fue generado mediante la mezcla de las microesferas con 1 ml de solución de fibrinógeno y 1 ml de trombina. El parche se cultivó en MEM 2 ml. Se recogió un ml del medio y se sustituye con 1 ml de MEM fresco cada día (Figura 2B). Los datos se presentan como media ± SEM.
Las observaciones de un modelo IR-lesión
2. Un total de 6 millones hiPSC-CM, -ECs, y -SMCs (2 millones de cada tipo de célula) se inyecta directamente en el tejido del miocardio lesionado. Para los animales en el grupo celular + Patch, un parche compuesto por fibrina y IGF-1 que contiene microesferas fue creado sobre el sitio de la lesión antes de la inyección, mientras que los animales en el grupo de células fueron tratados con la misma dosis de células pero sin el parche; ambos tratamientos fueron retenidos de los animales en el grupo de MI. Cuatro semanas después de la lesión y tratamiento, 9% de las células entregados a los animales en el grupo celular + Patch se retuvieron y continuaron para sobrevivir en el sitio de administración, en comparación con sólo 4% de las células administradas a los animales en el grupo celular (Figura 3A). El tratamiento tanto con las células y el parche, pero no con las células solas, también fue associated con mejoras significativas en las mediciones de la función cardiaca y el tamaño del infarto (Figura 3B).
Figura 1: Diferenciación de hiPSCs en cardiomiocitos, células endoteliales, y células musculares lisas. Diferenciación de los cardiomiocitos y la pureza de hiPSC-CM se evaluaron mediante citometría de flujo (A) y la histología con diferentes marcadores cardíacos (B). La diferenciación endotelial de hiPSC se determinó con citometría de flujo (C). El mantenimiento del fenotipo endotelial de hiPSC-ECs se evaluó a través de análisis de la expresión de CD31 y CD144 en 2, 3, y 4 semanas después de la purificación mediante citometría de flujo (D). La diferenciación de las células del músculo liso de hiPSC se midió por varios marcadores (E). Y la migración y proliferación potencial de lascélulas del músculo liso sintéticos vs células contráctiles del músculo liso derivadas de hiPSCs se evaluó (F). Los núcleos se contratiñeron con DAPI en la tinción de inmunofluorescencia. Barra de escala = 100 micras de (B) y 200 m (E y F). La capacidad de migración y proliferación de sintético hiPSC-SMCs se evaluaron (F, el panel i y ii). Y la contracción de las SMC contráctiles en respuesta al tratamiento se evaluó carbacol (F, el panel iii-v). * P <0,05, sintética hiPSC-CML vs. contráctil hiPSC-CML. A y B se modificaron de YE L, et al. 2. C y D se modificaron de Zhang S, et al. 3. E y F se modificaron de Yang L, et al. 4. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). La comparación entre dos grupos se evaluó mediante la prueba t de Student, y la comparación entre varios grupos se evaluó mediante ANOVA de una vía. p <0,05 fue considerado signifihipocresía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La liberación de factores de crecimiento a partir de microesferas. Se sintetizó microesferas que contienen IGF-(A). IGF-1 de liberación a partir de microesferas se midió en 1, 3, 5 y 7 días después de que se sintetizaron (B). Barra de escala = 200 micras. Panel A se modificó a partir de Ye L., et al. 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Evaluación de la eficacia de la terapia celular con cel-trilinaje derivados hiPSCls. La tasa general de injerto para la población de tres células se evaluó 4 semanas después del trasplante de células (A). La función cardíaca (como se indica por la fracción de eyección) y el tamaño del infarto se evaluaron a través de resonancia magnética cardiaca en 1 y 4 semanas después del trasplante de células (B). * P <0,05 frente a MI; #p <0,05 frente a Patch. A y B se modificaron a partir de de Ye L., et al. 2. Los datos se presentan como media ± SEM. Se analizaron Las comparaciones entre grupos de significación con ANOVA de una vía. p <0,05 fue considerado significativo. Resultados identificados como significativos a través de ANOVA se volvieron a analizar con la corrección de Tukey.
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Discussion
Rendimiento mejorado / pureza de hiPSC-CM
protocolos convencionales para la diferenciación de las células madre humanas en los CM son a menudo limitadas por el bajo rendimiento y la pureza; por ejemplo, solo 35-66% de células madre-CM obtiene a través de la separación de Percoll y la formación de cuerpos cardiaca expresado miosina lenta cadena pesada o cTnT 6. La pureza de las poblaciones hiPSC-CM diferenciadas se puede incrementar sustancialmente mediante la selección para la expresión de un gen informador que se ha relacionado con el promotor de un-CM específica proteína 7, 8, 9, pero esta técnica requiere necesariamente el uso de organismos modificados genéticamente células, que son menos deseable, en particular para las investigaciones clínicas. Con el protocolo que aquí se presenta, el 68% de la hiPSC-CM expresó cTnT, y la pureza fue posteriormente aumentó a> 90% a través de micro-disección y preplating sin manipulación genética o individualselección de las células beta. El rendimiento total fue de ~ 3-5 millones de hiPSC-CM por pocillo.
Rendimiento mejorado / estabilidad de hiPSC-EC
Los dos protocolos de diferenciación hiPSC-CE utilizados más comúnmente se basan en cocultivo con células estromales murinas 10, 11 y la formación embrionaria de cuerpo 12, 13. Sin embargo, el método de co-cultivo podría conducir a la contaminación xenogénico con células murinas de linaje o proteínas de 10, y sólo ~ 15% o menos de las células producidas mediante el método embrionario-cuerpo asumir un fenotipo CE 10, 12, 13. El protocolo de diferenciación hiPSC-CE que aquí se presenta elimina el riesgo de contaminación y xenogénico puede ser de hasta 3 veces más eficiente que los métodos que utilizan cuerpos embrionarios (dependiendo de que se utiliza la línea hiPSC). Ademmineral, después de la purificación a través de la selección para la expresión CD31, ~ 90% de la hiPSC-ECs mantiene el fenotipo CE durante al menos 4 semanas in vitro, en comparación con sólo dos semanas cuando hiPSC-ECs se produce a través de protocolos de diferenciación convencionales 12.
Especificación fenotípica de CML-hiPSC
El fenotipo de un SMC (o una población de CML) es quizás mejor descrito como un equilibrio entre las características predominantemente contráctiles y sintéticos, que pueden dar lugar a diferencias sustanciales en la morfología, la expresión del marcador, y la actividad. Por lo tanto, la utilidad de hiPSC-SMCs para una aplicación particular puede depender de que fenotipo específico se genera. La diferenciación y la purificación de los protocolos hiPSC-SMC que aquí se presentan son los primeros en producir poblaciones predominantemente contráctiles o sintéticos SMC que son ~ 95% de pureza en tan sólo 2-3 semanas, y el riesgo de contaminación xenogénica es mínima, debido a que los procedimientos no require el uso de células alimentadoras.
El injerto mejorado Tasa de células trasplantadas
Uno de los obstáculos principales para la terapia celular eficaz se cree que es el extremadamente bajo número de células administradas que injertadas por el miocardio 14, 15, 16, 17. Las citoquinas tales como IGF-1 pueden mejorar el injerto al permitir que las células para soportar mejor el microambiente tóxicos en los tejidos isquémicos 18, 19, 20, pero las altas presiones inducidas durante la contracción pueden exprimir las células a través de la pista de la aguja y en la circulación periférica. Por lo tanto, la tasa considerablemente mayor de injerto consigue inyectando las células a través de un parche de fibrina que contiene IGF-1-, que era más de 2 veces mayor que la tasa observada cuando el samdosis de células e se administró sin el parche, probablemente se puede atribuir tanto a los efectos citoprotectores de IGF-1 y al parche mismo, que forma una barrera física que impide que las células de ser expulsado en el espacio epicárdica.
Los pasos críticos
Para garantizar la pluripotencia de las células de las caderas, es necesario comprobar el cariotipo de la línea hiPSC antes de la diferenciación, determinar la expresión de marcadores de pluripotencia (Nanog, SSEA1, y Oct4, et al.), Y confirmar su capacidad de formación de teratomas . Se sugiere volver a comprobar su pluripotencia cuando las líneas se han hiPSC pasar durante más de 10 generaciones. El estado de hiPSC indiferenciada también es crucial para la diferenciación correcta. Para garantizar el estado de la hiPSC antes de la iniciación de la diferenciación, se recomienda: 1) utilizar un medio fresco (menos de dos semanas de edad), y refrescar el medio día, antes de la iniciación de hiPSC differentiation; 2) reducir el tiempo de digestión enzimática (menos de 5 min), y suavemente pipetear arriba y abajo de las células para evitar el daño innecesario a las células; 3) replate las células a una densidad de 1 x 10 5 células por pocillo de la placa de 6 pocillos; 4) Siempre mantener las células en 37 ° C y 5% de CO2, y evitar mantener las células de la incubadora durante más de 15 minutos.
Limitaciones de la Técnica
La principal desventaja de este método para la combinación de las células cardíacas hiPSC derivados inyectadas y la administración de parche es el requisito para la cirugía abierta de tórax; Por lo tanto, este enfoque es poco probable que sea directamente traducible a aplicaciones clínicas, excepto como terapia adyuvante para los pacientes que se someten a cirugía de revascularización coronaria concurrente. uso clínico más extendido será necesario el desarrollo de un método de entrega práctico y mínimamente invasivos, tales como un enfoque basado en catéter endoscope- y que podrían accederel corazón a través del abdomen y el diafragma. Además, uno de los problemas de seguridad más críticos asociados con la terapia celular cardiaca es el desarrollo de complicaciones arritmogénicos, y cuando los monos fueron tratados con inyecciones intramiocárdicas de 1 mil millones de los CM de células madre derivadas de, los cuatro de los animales desarrollaron arritmias espontáneas 21. Sin embargo, se observó ninguna evidencia de complicaciones arritmógenas cuando 10 millones de CM hiPSC derivados fueron inyectadas en los corazones de cerdos con lesiones IR 2, tal vez porque la dosis de células fue 100 veces más pequeño.
Las aplicaciones futuras o llegar
rechazo inmune probablemente juega un papel importante para la tasa de injerto bajo. El sistema de edición gen CRISPR / Cas puede permitir a los investigadores a crear una línea de hiPSCs "donante universal" por knock out (KO) del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I y clase II. Las células y los tejidos pueden h derivados-KO hiPSC MHCave tasas sustancialmente más altos de injerto. A medida que mejoran las técnicas, las tasas de injerto es probable que aumenten. En cierto momento del aumento del tamaño del injerto, se espera que el injerto grande para aumentar la arrhythmogenicity del corazón receptor. La reducción de los injertos asociados arritmogenicidad podría lograrse mediante el uso de células con aumento de la brecha de proteínas de unión expresión por la tecnología de edición de genes.
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Disclosures
Ninguna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol Section 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10 cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Protocol Section 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-β | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Protocol Section 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-β | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Protocol Section 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Protocol Section 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| ε-aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5 T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7 T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
References
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