Introduction
הלב הוא האיבר הפונקציונלי הראשון לפתח בעובר 1, 2. בשיתוף עם מערכת הדם, היא מספקת חמצן, חומרי הזנה, וכן מנגנון סילוק פסולת במהלך פיתוח. שלושה שבועות לאחר ההפריה, הלב האנושי פועם בפעם הראשונה והרגולציה הראויה מתוחזק על ידי cardiomyocytes (CMS). ההפסד בלתי הפיך של תאים מיוחדים אלה היא אפוא הנושא היסודי אותו אי ספיקת לב מתקדמת. בעוד כמה אורגניזמים כגון דג הזברה Xenopus יש פוטנציאל להתחדשות לב, הלב של יונקי הבוגרים מוגבל יותר 3, 5, 6. לפיכך, בהתחשב הפונקציה הקריטית של הלב, אין זה מפתיע כי מחלת לב היא הגורם המוביל למוות בעולם, והיוותה 600,000 מקרי מוות בארצות הברית לבדה 7. הrefore, טיפולים מבוססי תאים כדי לתקן או להחליף את שריר הלב נפגע ביעילות הם עניין קליני גדול.
המחקר הזרע של יאמאנאקה ועמיתיו 8 הראה כי ביטוי כפוי של ארבעה גורמי שעתוק מספיק כדי להמיר תאי פיברובלסטים בדיל באופן מלא לתאי גזע פלוריפוטנטיים. עם זאת, יכולת tumorigenic של כל אסטרטגיות תאי גזע פלוריפוטנטיים כבר דאגה קריטית בשימוש שלהם למטרות טיפוליות. זה הניע התחום המדעי לחפש שיטות חלופיות כדי transdifferentiate תאים תוך הימנעות שלב פלוריפוטנטיים. לאחרונה, מספר קבוצות הראו את הכדאיות של אסטרטגיה זו על ידי הצגת המרה ישירה של פיברובלסטים עכבר לתאי cardiomyocyte דמוי המושרה (iCLMs) עם ביטוי אקטופי של שעתוק גורמי Gata4, Mef2c, Tbx5, ובהמשך, Hand2 (GMT ו GHMT 9, בהתאמה), 10. Furthermore, באותה האסטרטגיה ניתן לבצע in vivo ו ברקמות אדם נגזר 9, 11, 12. מחקרים שנעשה לאחרונה הדגישו גורמים נוספים או מסלולי איתות כי יכול להיות מווסת כדי לשפר את יעילות תכנות מחדש של לב עוד 13, 14, 15. יחדיו, מחקרים אלה להדגים את הפוטנציאל של transdifferentiation ביים עבור טיפולים רגנרטיבית. עם זאת, היעילות הנמוכה של תכנות מחדש CM, המנגנונים המולקולריים הידועים, שחזור עולה בקנה אחד בשל הבדלים מתודולוגיים 16, ואת האופי הטרוגני של iCLMs להישאר unaddressed.
על מנת ישירות להעריך ההטרוגניות iCLM, עצבנו assay בדידה החזקה תא בודד לזיהוי התפתחות sarcomere ו specificatio שושלת לבn ושניים מאפיינים דרושים של cardiomyocytes הפונקציונלי. יש לפחות שלושה סוגים עיקריים של CM בלב כהגדרתו לפי המיקום שלהם תכונות חשמליות ייחודי: פרוזדורים (PM), חדרית (VM) ו קוצב לב (PM) 17, 18, 19, 20. בשנת מערך מתוזמר, הם לאפשר שאיבה הנכונה של דם. במהלך פגיעה לבבית, אחד או כל תת עלול להיפגע, ואת הסוג של טיפול בתא היה צורך לטפל על בסיס כל מקרה לגופו. כיום, רוב האסטרטגיות להתמקד בדור הכולל של cardiomyocytes, בעוד מעט עבודה נעשתה כדי ללמוד את המנגנונים המולקולריים אשר מסדיר מפרט תת סוג.
המחקר הבא מפרט כיצד לכמת כראוי סרקומר מאורגן היטב לזהות קבוצה מגוונת של תת cardiomyocyte. באמצעות קוצב לב (PM) עכבר כתב -specific, אנו מסוגלים להחיל iהגישה mmunocytochemical להבחין מיוציטים המושרה דמוי פרוזדורים (IAM), myocytes חדרית דמוי המושרה (IVM), ו myocytes PM דמוי המושרה (iPMs) 21. בהתבסס על התצפיות שלנו, רק תאים כי תערוכת ארגון sarcomere מסוגלים פועם ספונטני. פלטפורמת תכנות מחדש ייחודית זו מאפשרת להערכת התפקיד פרמטרים מסוימים של בארגון sarcomere, מפרט תת סוג, והיעילות של תכנות מחדש CM ברזולוציה תא בודד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוצדורות הכרוכות שיטות חיה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש במרכז הרפואי Southwestern UT.
1. ניתוק של Hcn4-GFP E12.5 עכבר עובריים פיברובלסטים (MEFs)
- הגדרת הזדווגויות מתוזמן בין זכרים Hcn4-GFP הומוזיגוטים ונקבות CD-1.
- הקורבן נקבה בהריון E12.5 ידי המתת חסד פחמן דו חמצני ו נקע בצוואר הרחם לאחר מכן.
- סר קרן רחם עם מלקחיים לנתח כפי שתואר לעיל 22, 23, ולהכניס אותם לתוך צלחת פטרי על קרח עם בופר פוספט 1x (PBS) ללא Ca 2 + או Mg 2+.
- ביצוע כל הצעדים הבאים בשכונה בתרבית רקמה באמצעות טכניקה סטרילית.
- הסר את העוברים מן הרחם מי שפיר שק באמצעות מספריים לנתח מלקחיים. שמור את השליה מחוברת לטיפול טוב יותר. PregnaCD-1 NT הנקבות בדרך כלל ללדת בין 10 ל 14 גורים.
- שימוש לנתח מלקחיים, לקחת את העוברים המבודדים ובמהירות לשטוף אותם פעמים 70% (v / v) EtOH.
הערה: השטיפות צריכות להיות מהירות כדי למזער מוות של תאים. - הסר את הראש, גפיים, זנב, ואיברים פנימיים, כולל הלב מן העוברים המבודדים.
- מניחים את הרקמה הנותרת בצלחת 10 ס"מ עם 1 מ"ל של 1x PBS ופשטי- דק באמצעות סכין גילוח סטרילי עד כ 1 מ"מ 3 בגודל.
- העברת רקמות טחון לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל עם PBS.
- ספין ב 300 XG במשך 3 דקות. בזהירות לשאוב PBS עודף.
- הוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA סטרילי לכל העובר. דגירת תאים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. בעדינות מערבבים את הצינור כל 4 דקות. יתר העיכול של הרקמות תפחית באופן משמעותי את התשואה.
- תערובת תאים וורטקס במהירות מרבית (3,200 סל"ד) במשך 4 שעות.
- הוסף 2 מ"ל של התקשורת פיברובלסטים לכל העובר ומערבבים. t מסנןhrough מסננת תא 100 מיקרומטר בעזרת פיפטה כדי לסייע התאים דרך המסננת. עיין בטבלה 1 לגיבוש כל המדיומים הבאים.
- ספין ב 300 XG למשך 4 דקות. בזהירות לשאוב supernatant.
- הוסף 10 מ"ל של התקשורת פיברובלסטים טריים לכל 3 עוברים triturate 6-10 פעמים.
- פלייט התאים 1 צלחת בתרבית רקמה 15 ס"מ עבור כל 3 עוברים מוכנים. לילה תרבות חממה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לאחר דגירת הלילה, להחליף את התקשורת עם 30 מיליליטר טרי של תקשורת לכל צלחת. מניח תאים בחזרה לתוך חממת הלילה.
הערה: בדוק Hcn4-GFP + תא זיהום תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. התרבות צריכה להיות GFP - ורק להיות GFP + על תכנות מחדש. - למחרת, תאי קציר עם 3 מיליליטר של 0.25% מחוממים מראש הטרי טריפסין-EDTA. רוזן ולהקפיא תאים. בדרך כלל, להקפיא תאים ב 3 x 10 6 תאים לכל מיליליטר. Yie הצפויld צריך להיות 3 x 10 6 תאים לכל עובר.
הפקת רטרו-וירוס 2. תכנות מחדש
זהירות: הפרוטוקול הבא דורש ייצור וטיפול רטרווירוסים זיהומיות. בצע את השלבים הבאים בתוך ארון בטיחות ביולוגית רמה 2 תחת הנחיות BSL-2 ו טכניקה סטרילית. השתמש 10% אקונומיקה להיפטר מכל החומרים חשופים רטרווירוסים.
- ייצור רטרו-וירוס והכנת MEFs
הערה: הפרוטוקול הבא הוא לייצור retroviral 6 צלחות היטב זיהום MEF ב 24 גם צלחות. עבור פורמטים אחרים, עיין בטבלה 2. MEFs הם מצופה ב יום -1, ולכן העיתוי יהיה צורך בתיאום כראוי עבור כל ניסוי (ראה גם סעיף 2.3 ו איור 2).- לשמור פלאט-E (PE) תאים לפי המלצות היצרן. בקצרה, תאים PE תרבות DMEM בתוספת 10% FBS, 1 מיקרוגרם / מ"ל puromycin, 10 מיקרוגרם / מ"ל blasticidin, פניצילין, סטרפטומיצין. מעבר תאים 1: 4 כל יומיים כאשר התרבות מגיע 70-90% confluency.
- יום -2: היום לפני transfection, זרע תאי פלאט-E ב 1 x 10 6 תאים / גם בצלחת 6 באר במדיה transfection. תאים צריכים להיות ומחוברות 70-80% בזמן transfection.
- Transfection באמצעות סוכן transfection מסחרי.
הערה: ריאגנטים המסחריים צריכים להיות בטמפרטורת חדר (RT) לפני transfection. עבור transfection DNA, להוסיף כל פלסמיד דנ"א retroviral בנפרד (G, H, M, ו- T) כדי ליצור קוקטייל GHMT 9.- יום -1: בתוך צינור פוליסטירן חרוטי 15 מ"ל, לערבב 60 μL של התקשורת סרום מופחת עם 6 μL של מגיב transfection לכל תגובה עבור פורמט 6-גם צלחת. דגירה את התערובת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: מאז מגיב transfection משמש כאן נקשר פלסטיקה,DD ישירות בתקשורת בסרום המופחתת כדי למנוע ירידה ביעילות transfection. - להוסיף סך של 2 מיקרוגרם של קוקטייל GHMT לכל תגובה לטפוח בעדינות לערבב אותו. לא מערבולת. דגירת התגובה במשך 15 דקות ב RT.
- מוסיף את תערובת משלב 2.2.3 לתאי PE בצורת טיפה חכמה.
- דגירת תאי פלאט-E טרנספקציה לילה חממת 2 37 מעלות צלזיוס, 5% CO. קלט בזמן transfection.
- יום -1: בתוך צינור פוליסטירן חרוטי 15 מ"ל, לערבב 60 μL של התקשורת סרום מופחת עם 6 μL של מגיב transfection לכל תגובה עבור פורמט 6-גם צלחת. דגירה את התערובת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- זריעה של פיברובלסטים עובריים בעכבר Hcn4-GFP.
- 1 שעות לפני ציפוי MEFs, להכין צלחת 24 גם עבור immunocytochemistry.
- הוספת coverslip פיברונקטין 12 מ"מ לכל טוב.
- בארות מעיל עם 300 μL של פתרון קולגן שור (למשל, SureCoat) דגירה של 37 ° C חממה עבור H 1.
- פתרון הציפוי לשאוב מיד לפני ציפוי MEF.
- להפשיר בקבוקון קפוא של Hcn4-GFP MEFs ולשטוף x1 עם fibrobl מחומם מראשתקשורת אס 'ב XG 500 במשך 5 דקות.
- לקבוע כדאיות התא באמצעות הרחקה trypan כחול או צבעים דומים. לחשב את מספר תאים קיימא לכל מ"ל של התרבות באמצעות הנוסחה הבאה:
תאי קיימא% = [1.00 - (מספר התאים הכחולים / מספר התאים הכוללים)] x 100- חישוב מספר כולל של תאי קיימא באמצעות הנוסחא הבאה:
תאי חיים = תאי% קיימא x גורם לדילול x 10,000 x נפח כולל של השעית תא
- חישוב מספר כולל של תאי קיימא באמצעות הנוסחא הבאה:
- זרע 3 x 10 4 תאים לכל טוב על צלחת 24 גם עם coverslip פתרון פיברונקטין קולגן שור שהוכן קודם לכן.
- 1 שעות לפני ציפוי MEFs, להכין צלחת 24 גם עבור immunocytochemistry.
- התמרה ואת תכנות מחדש של MEFs
הערה: על פי רשימותיו של היצרן, מתוחזקים היטב תאי פלאט-E לייצר כייל ממוצע של 1 x 10 7 יחידות זיהום / מיליליטר. למרות כייל אינו נמדד ישירות עבור כל ניסוי, פקד GFP כלול תמיד כתחליף יעיל זיהום.ביטוי של GFP גבוה ועצמה (GFP +> 95%) בדרך כלל בקורלציה עם דור מוצלח בתיווך GHMT של iCLMs.- יום 0: 24 שעות שלאחר transfection, לסנן המדיום retroviral PE דרך פילטר אצטט תאית פעילי שטח ללא גודל 0.45 מיקרומטר נקבוביות ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל. להוסיף polybrene לריכוז סופי של 8 מיקרוגרם / מ"ל. בזהירות לחדש תאים עם 2 מ"ל של מדיום transfection טריים.
הערה: תאים בקלות לנתק מהצלחת אם התקשורת משתנה מהר מדי. - לשאוב את המדיום של MEFs התרבותי ולהוסיף מדיום retroviral שנאסף טרי; זה אמור להניב 1.7 מ"ל של התקשורת לכל גם צלחת 6 באר. הוסף את ~ 800 μL לכל טוב של צלחת 24 גם. חזור צלחת MEF אל האינקובטור דגירת הלילה.
- יום 1: חזור על שלבי 2.4.1 ו 2.4.2. מחק תאים לאחר איסוף 2 nd וירוס. חזור MEFs הנגוע אל האינקובטור ולתת להם לנוח לילה.
- יום 2: 48 שעות לאחר אינדוקציה, לשאוב את x1 תקשורת לשטוף מותנית התא עם 1x PBS. הוספת 500 μL מחומם מראש מדיה iCLM לכל גם צלחת 24 באר.
- חלף תקשורת iCLM כל 2 - 3 ימים. צלחת תהליך 14 ימים לאחר אינדוקציה ויראלי עבור immunocytochemistry (ICC) ניתוח של תכנות מחדש של הלב.
- יום 0: 24 שעות שלאחר transfection, לסנן המדיום retroviral PE דרך פילטר אצטט תאית פעילי שטח ללא גודל 0.45 מיקרומטר נקבוביות ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל. להוסיף polybrene לריכוז סופי של 8 מיקרוגרם / מ"ל. בזהירות לחדש תאים עם 2 מ"ל של מדיום transfection טריים.
3. Immunostaining של MEFs לתכנות מחדש
- 14-ימים-אינדוקציה פוסט, לשאוב התקשורת בזהירות.
- יש לשטוף היטב עם כל 300 μL של PBS 1x קר כקרח. לשאוב פתרון עודף.
- תקן תאים עם 250 μL של paraformaldehyde 4% (PFA) פתרון לכל גם צלחת 24 באר. דגירה 15 דקות ב RT.
הערה: קבוע התאים ניתן לאחסן PBS ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1 - 2 שבועות לפני מכתים. - תאים Permeabilize ידי x3 בארות כביסה עם 300 μL 0.1% PBS-TritonX 100 (PBST). דגירה 5 דקות ב RT בין שוטף. לשאוב פתרון עודף לאחר לשטוף האחרון.
- בלוק 10דקות ב RT עם הצפת 1x יוניברסל בלוק ב 300 μL / טוב.
- הכן חיץ מכתים (ICC): הוסף 1: 1 של PBS 1x ו 1x יוניברסל חסימת חיץ. מדולל נוגדנים עיקריים במאגר מכתים ICC דגירת נוגדני הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. עיין בסעיף חומר דילולים מומלצים.
- כתם זוג אחד של שקופיות עם α-actinin עכבר, עוף αGFP וארנב Nppa עבור IPM והזדהות IAM.
- הכתם זוג אחד של שקופיות עם-actinin α העכבר, עוף αGFP וארנב Myl2 לזיהוי IPM ו IVM.
- למחרת, לשטוף x3 בארות עם 300 μL 0.1% PBST. דגירה 5 דקות ב RT בין שוטף. לשאוב פתרון עודף לאחר לשטוף האחרון.
- כן דילולי הנוגדנים משני במאגר מכתים ICC. עיין בסעיף חומר דילולים מומלצים. דגירה נוגדנים משני 1 שעות ב RT, מוגן מפני אור.
- כתם כל השקופיות עם antibodie משני הבאs: עכבר Alexa-555, עוף Alexa-488, ארנב Alexa-647.
- לשטוף x3 בארות עם 300 PBST 0.1% μL. דגירה 5 דקות ב RT בין שוטף. להגן מפני אור.
- להוסיף 2.4 μL של התקשורת הרכבה המכיל 1.5 מיקרוגרם / מ"ל של 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לשקופית מיקרוסקופ זכוכית. מוציאים בזהירות את coverslip מהבאר של צלחת 24 גם, להסיר פתרון עודף, ולהעביר לשקופית זכוכית עם התקשורת גובר. לחץ בעדינות את coverslip להסיר נפח אוויר עודף.
- מגלשות חותמות עם לק העדיף או איטום פלסטיק. חנות רכובה שקופיות ב 4 ° C המוגנים מפני אור.
זיהוי 4. של תת לב באמצעות מיקרוסקופ Confocal
הערה: עבור הדמיה, מיקרוסקופ confocal מצויד לפחות 2 גלאי פלורסנט מסוגל זיהוי רפאים ב 405, 488, 555, ו 639 אורכי גל nm הוא הכרחי על מנת לזהות iPMs, איימס, ו iVMs. iMAGתאי דואר באמצעות תוכנית-Apochromat 20X / 0.75 אובייקטיבי או טוב יותר. באמצעות תוכנת ניתוח תמונה של היצרן, סריקת תמונות זום יכול להשיג תמונות באיכות טבילת 40X-שמן.
- תמונה הספרייה: לקחת תמונות של 8 סיביות עם DAPI, Alexa-488, Alexa-555, וערוצי Alexa-647 (ch.). פיקסל להתעכב זמן של 6 שניות, גודל מסגרת 1024, צעד בתור 2, והעמיד ממוצע של 2 מספיק עבור תמונות ברזולוציה גבוהות.
- עבור כל שקופית, להתחיל מקצה אחד ולהתחיל סריקה למעלה ולמטה בערוץ ניאון אדום (ch.) עבור-actinin α + תאים sarcomere + (עיין איור 3 ואיור 5A לדוגמאות). פסי sarcomere קלים יותר לזהות ויזואלית את אורך גל 555 ננומטר.
- ברגע α-actinin + תא sarcomere + זוהה, לעבור CH ירוק. ולשמור פתק, ככל שהיא חיובית (IPM). Switch למחשב להעריך את פרק 647 מרחיקות אדום. (IAM או IVM).
הערה: תאים שאינם α-actinin + / sarcomere + / Hnc4-GFP + / Nppa - / Myl2 - מיועדים iPMs. ביטוי של GFP יהיה לראות ברחבי התא (איור 4 א). - מגלשות הכתם עם-actinin α (עכבר Alexa555), Hcn4-GFP (עוף-Alexa488), Nppa (ארנב-Alexa647), ו DAPI. תאים הם α-actinin + / sarcomere + / Hnc4-GFP - / Nppa + הם IAM. מכתים Nppa יופיע perinuclear ו punctate (איור 4B).
- מגלשות הכתם עם-actinin α (עכבר Alexa555), Hcn4-GFP (עוף-Alexa488), Myl2 (ארנב-Alexa647). תאים חיוביים-actinin α + / sarcomere + / Hnc4-GFP - / Myl2 + הם iVMs. מכתים Myl2 יפגין צורה מפוספסת לאורך נימת sarcomere. בשל וריאציות באיכות מכתים והמטוס-Z, תלמים לא תמיד גלוי בקלות (איור 4C).
- ברגע α-actinin + תא sarcomere + זוהה, לעבור CH ירוק. ולשמור פתק, ככל שהיא חיובית (IPM). Switch למחשב להעריך את פרק 647 מרחיקות אדום. (IAM או IVM).
= "Jove_title"> 5. קְבִיעַת כָּמוּת
הערה: על מנת להעריך את המספר האמיתי של MEFs לתכנות מחדש באופן פוטנציאלי, 2 בארות צלחת 24 גם הם זורעים במקביל הבארות הניסיוניות נקצרות יום אחד לאחר הציפוי. המספר הכולל של תאים מצופה מכן נקבע על ידי חישוב ממוצע שתי הבארות. זה הופך את התאים הכוללים בפועל המצופים (aTotal).
- sarcomere +
- ראייה לבדוק כל תא על coverslip עבור-actinin α נכונה + / sarcomere + (לוחות מימין איור 3) ולהקליט (איור 5 ב-ט).
- לסדר בטבלה את המספר הכולל של-actinin α + / sarcomere + על כל coverslip ומתחלקים על ידי התאים הכולל בפועל מצופה (aTotal) (איור 5 ב-iii). לדוגמא, אם aTotal = 12,500 תאים, ו -100 תאים היו אלפא-actinin + / sarcomere + אז, 0.8% של MEFs המצופה היו לתכנות מחדש. ממוצעניסוי reprograming יניב 1% α-actinin + / sarcomere + תאים (איור 5 ג).
- סוג משנה +
הערה: לקבלת השלבים הבאים, עיין איור 5 ב / C עבור זרימת עבודה כימות נציג iCLM. בקצרה, לכל sarcomere + תא, לסדר בטבלה אם הוא ייחודי עבור תת סוג (איור 5 ב-ט). חישוב סוג משנה% (איור 5 ב-iii) על ידי חלוקת מספר התאים תת סוג + מעל sarcomere הממוצע + תאים x 100 (איור 5 ב-ט). כדי לחשב את היעילות המוחלטת% תת סוג (איור 5 ב-ד), חלק את המספר תת סוג + תא מ איור 5 ב-i במספר הכולל של תאים הזורעים x 100 (איור 5 ב-ii).- עבור כל אחת actinin-α + / sarcomere + תאים, להעריך אם הם GFP +, Nppa +, או Myl2
- לסדר בטבלה המספר הכולל של α-actinin + / sarcomere + / Hnc4-GFP + / Nppa - / Myl2 -, actinin + / sarcomere + / Hnc4-GFP - / Nppa +, ו α-actinin + / sarcomere + /-GFP Hnc4 - / Myl2 + תאים (איור 5 ב-ט).
- כדי לחשב את האחוז כל תת-סוג, לחלק את מספר תאי סוג משנה + במספר הכולל של α-actinin + / sarcomere + תאים כי גם להכפיל 100. GHMT מייצר iPMs, איימס, ו iVMs בערך יחסים שווים (איור 5B-iii).
- כדי לחשב את מספרם המוחלט של תת-סוג + תאים, לחלק את המספר הכולל של תת-סוג + תאים עבור תנאי הניסוי ידי aTotal ולהתרבות על ידי 100 (איור 5 ב-ii). ביום iPMs הממוצע מייצג 0.3% מכלל אוכלוסיית התא הנגוע הכוללת, איימס 0.3%, ו0.25% iVMs (איור 5 ב-ד).
- עבור כל אחת actinin-α + / sarcomere + תאים, להעריך אם הם GFP +, Nppa +, או Myl2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניצול של העכבר הכתב PM-ספציפי, פיתחנו אסטרטגיה immunostaining זמנית לזהות מיוציטים אנדוגני מגוונים כמו מתואר באיור 1. בעקבות צעדי תכנות מחדש שמוצגים באיור 2, אינדוקציה של CMS ספציפי תת סוג ניתן לאתר מוקדם ככל יום 4 21, אם כי שיעור נמוך. במשך היום 14, הניסוי ניתן לעצור שלהם ונבחנת לגביהם ארגון sarcomere (איור 3) וסוג משנה-מפרט (איור 4). איור 5 מסכם את העבודה של הכנת שקופיות עבור ICC (איור 5 לוח א '), ואת כימות של תאים תת סוג ספציפי iCLM (איור 5 לוח ב' / ג ').
איור 1: סוג משנה גיוון של אנדוגניCardiomyocytes. (AB) Immunocytochemistry (ICC) מכתים של cardiomyocytes פרוזדורים בילוד מעכברים הכתב Hcn4-GFP עבור-actinin α (סמן sarcomere, אדום), Hcn4-GFP (סמן PM, ירוק), ו Nppa (סמן פרוזדורים, כתום). (C) מכתים Immunocytochemistry של cardiomyocytes חדרית בילוד מעכברים הכתב Hcn4-GFP עבור-actinin α (סמן sarcomere, אדום), Hcn4-GFP (סמן PM, ירוק), ו Myl2 (סמן חדרית, כתום). DAPI (כחול): מכתים גרעיני. ברי סולם: 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלה 1: תרבות בינוני. סיכום טבלה לעריכה של כמה מדיומים המשמשים במהלך תכנות מחדש נגרמת GHMT. טבלה 2: מתזמן, Transfection ו פורמטי אינדוקציה.(א) סיכום טבלה עבור ציפוי transfection של תאים. (B) צפיפות זריעה ו המשוער זיהום יחידות (או supernatant ויראלי) הדרוש כדי לגרום MEFs לתאים דמויי cardiomyocyte. 
איור 2: תכנות מחדש ציר סכמטי. ייצוג סכמטי של MEFs GHMT הנגרמת Hcn4-GFP. שלושת השלבים העיקריים מתוארים. 
איור 3: תואר של ארגון sarcomere. מכתים ICC של Hcn4-GFP MEFs 14 ימים לאחר GHMT התמרה עבור α-actinin (סמן sarcomere, אדום) מציגה מגוון רחב של הארגון sarcomere. מידת הארגון גדל משמאל לוחות מימין. תמונות נציג של כל רמה (n = 3). סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 4: סוג משנה ספציפי לתכנות מחדש Cardiomyo cytes. (AC) מכתים ICC של GHMT-transduced Hcn4-GFP MEFs עבור α-actinin (סמן sarcomere, אדום), Hcn4-GFP (סמן PM, ירוק), Nppa (סמן פרוזדורים, כתום), או Myl2 (סמן חדרית, כתום) . DAPI (כחול): מכתים גרעיני. ברי סולם: 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 5: רכישת תמונה וניתוח זרימת עבודה. ייצוג סכמטי לניתוח תמונה. לוח א 'מתארת את סדר העדיפויות של הקצאה + sarcomere ו-סגולי תת סוג לתא. לוח ב '(I-IV) ו- C להראות את התוצאות הצפויות מניסוי GHMT-iCLM הממוצע. נקודות ונוסחאות מפתח מוצגים בירוק.om / קבצים / ftp_upload / 55,456 / 55456fig5large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. תקשורת iCLM רְכִיב נפח (מ"ל) ריכוז סופי DMEM 270 בינוני 199 90 FBS 50 10% אינסולין-transferrin-סלניום G 2.5 0.50% פתרון ויטמין MEM 10 2% חומצות אמינו MEM 20 4% חומצות אמינו לא חיוניות 10 2% לאנטיביוטיקה antimycotics 10 2% תוסף B-27 10 2% חום מומת סרום סוס 25 5% Na-פירובט 2.5 1.5 מ"מ תקשורת פלאט-E (PE) רְכִיב נפח (מ"ל) ריכוז סופי DMEM 450 FBS 50 10% פניצילין / סטרפטומיצין 5 1% puromycin 0.05 1 מיקרוגרם / מ"ל Blasticidin 0.5 10 מיקרוגרם / מ"ל בינוני פיברובלסטים (FB) רְכִיב0; נפח (מ"ל) ריכוז סופי DMEM 450 FBS 50 10% פניצילין / סטרפטומיצין 5 1% Glutamax 5 1% בינוני Transfection (TXF) - מסונן (0.45 מיקרומטר) רְכִיב נפח (מ"ל) ריכוז סופי DMEM 450 FBS 50 10% Immunocytochemistry (ICC) חיץ מכתים רְכִיב נפח (מ"ל) ריכוז סופי 1x PBS 5 חיץ 1x יוניברסל חסימה 5 א) זריעת תא transfection פלייט / תבשיל שטח פנים (2 ס"מ) צפיפות זריעה (תאים) מדיום הגידול (מ"ל) כמות ה- DNA סך transfect (מיקרוגרם) מגיב transfection (μL) מדיה סרום מופחת (μL) צלחת 15 ס"מ 152 1.00E + 06 20 25 75 600 צלחת 10 ס"מ 55 5.50E + 06 10 9 27 300 צלחת 6 ס"מ 21 2.20E + 06 4 3.5 10.5 105 6 היטב / x1 9 1.00E + 06 2 2 6 60 12 גם / x1 4 4.00E + 05 1 0.5 1.5 15 24 גם / x1 2 2.00E + 05 0.5 0.3 0.9 9 48 גם / x1 1 1.70E + 05 0.25 0.15 0.45 4.5 B) זריעת פיברובלסטים ואינדוקציה פלייט / תבשיל צפיפות זריעת פיברובלסטים (מ') יחידות זיהום משוערות עבור iCLM צלחת 6 ס"מ 0.22-0.33 5.00E + 7 (~ 5 מ"ל) 6 היטב / x1 0.1-0.15 3.00E + 7 (~ 3 מ"ל) 12 גם / x1 0.04-0.06 1.30E + 7 (~ 1 מ"ל) 24 גם / x1 0.02-0.03 6.50E + 6 (~ 0.8 מ"ל) 48 גם 0.001-0.015 3.00E + 6 (~ 0.4 מ"ל)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המחקר הנוכחי מספק אסטרטגיה ישיר תכנות מחדש לגיור של MEFs לתוך קבוצה מגוונת של תת הלב באמצעות ביטוי בתיווך רטרו-וירוס של שעתוק לב גורמי Gata4, Mef2c, Tbx5, ו Hand2 (GHMT). שימוש בגישת immunostaining זמנית בשילוב עם עכבר כתב PM-ספציפי, אנו מסוגלים לזהות IAM, iVMs, ו iPMs ברזולוצית תא בודד. כזה assay מאפשר עבור ניסוי במערכת במבחנה מסוגלת לבודד את תרומתם של גורמי שעתוק פרט כלפי מגוון תת סוג ופיתוח sarcomere. במקביל, זה יכול להביא תובנה גורמי שעתוק חדשים או מולקולות קטנות כי הטית iCLMs לקראת שושלת בפרט. אף על פי כן, ישנם מספר שלבים קריטיים על ההשלמה המוצלחת של assay זה. בהמשך, אנו מתייחסים להשפעתן של כייל הנגיף, איכות פיברובלסטים, וניתוח הדמיה בניסוי iCLM בכלל.
במחקר שלנו, אנו EMPלוי-רטרו-וירוסים ecotropic לתכנת מחדש MEFs E12.5. שמנו לב כייל retroviral קשורה באופן ישיר לאיכות של התאים. מספר מעבר הגבוה (> 35) וטכניקות culturing עניות קשות להשפיע על איכות חלקיקי retroviral; ולכן, ישנם מספר שיקולים שכדאי לזכור. תאים פלאט-E אינם מייצרים וירוס Pseudotyped VSV-G, ועל כן הם מסוגלים לעמוד ultracentrifugation או מחזורי הקפאה 24, 25. על מנת לשמר את תוחלת החיים של התאים, זה הכרחי כדי לשמור על המלאי עם מבחר אנטיביוטי. עם זאת, הם צריכים להישמר תקשורת חופשית אנטיביוטי במהלך הייצור ויראלי. מניסיוננו, מגיב transfection משמש כאן מספק את יעילות transfection הגבוהה ביותר בתאים. אם שיטות transfection אחרות הן לשמש, השוואת titers ויראלי המופק 26 חיוני. אמנם יש המלצות על ידי היצרן למסוקאות H 48 supernatant ויראלי לאחר transfection, צפו כי בשני סבבים קציר 24 שעות להניב יעילות תכנות מחדש גבוהה תוך הימנעות השפעות רעילות מזוהות בדרך כלל עם preps ויראלי-כייל גבוהה. יתר על כן, אם כי מספר מחקרים הראו את הכדאיות של ריכוז supernatant ויראלי מסחרי 27, יש לנו לא מועסקים אלה בפרוטוקול הרגיל שלנו כדי לשמור על קצב העברת נתונים גבוה יותר.
בנוסף קוקטיילים נגיפיים גבוה כייל, איכות פיברובלסטים היא בעל חשיבות מכרעת עבור assay תכנות מחדש מוצלח 28. אם מתוזמן כראוי, MEFs המבודד טרי צריך להיות מנוצל בשל היעילות הגבוהה שלהם בהשוואה למניות קפוא. זה יכול להיות קשור לאופי רטרווירוסים, כפי שהם צריכים לארח פערי שגשוג כדי לשלב 29. בנוסף, צפיפות זריעת MEF משחקת תפקיד קריטי. כללנו שולחן עם צפיפויות זריעת מועסקיםבניסויים שלנו (טבלה 2). יתר על כן, passaging MEFs גם יקטין באופן משמעותי את יעילות תכנות מחדש.
Immunocytochemistry (ICC) הוא הטכניקה הסטנדרטית שלנו לניתוח של ארגון sarcomere מפרט תת סוג. בעזרת עכבר כתב PM-GFP, הצלחנו לגבש לוח נוגדן לצורך זיהוי של שלוש תת לבביים משמעותיים (AM, VM, וראש הממשלה). עם זאת, בשל אילוצים של זמינות מינים נוגדן והגבלת 4 ערוצים על הגדרת מיקרוסקופ confocal סטנדרטי, שני coverslips לכל תת סוג נדרשים לכמת את השכיחות של כל שלושת תת. coverslip אחד יהיה כתם עבור α-actinin / GFP (Hcn4) / Myl2, ואחד עבור α-actinin / GFP (Hcn4) / Nppa. בהתבסס על התצפיות הקודמות שלנו כי מבנה sarcomeric הוא מאפיין משותף של כל CMS ותנאי מוקדם פוטנציאל המפרט תת סוג 21, הצעד הראשון בניתוח שלנו הוא הקובע sarcomere +תאים. עם זאת, בשל אופיו הסובייקטיבי, הקמת רמת הארגון sarcomere הוא אולי החלק הקשה ביותר של assay זה; זה יכול להיות מוגבל על ידי ממוצעי quantifications של הצופה מרובה או על ידי פיתוח תוכנת פילוח תא חישובית כדי להפוך את התהליך 30. שימוש בתאי אנדוגני כנקודת התייחסות, גילינו סף + sarcomere מאורגן היטב מנוצל כי להבקיע iCLMs (איור 3). בהתחשב בפרמטרים אלה, ניסוי הממוצע יהיה להצמיח 20 - 30% α-actinin + תאים אבל רק 1% הם אלפא-actinin + / sarcomere +. של sarcomere + תאי 1%, ~ 30% יהיו Nppa +, Myl2 +, או Hcn4-GFP +.
בהתחשב בכך cardiomyocytes הן מורכבות מבנית, ביטוי גנים מבוסס אוכלוסיה (למשל qRT-PCR) או cytometry זרימה ניתוחים לא יכול ללכוד את ch מורפולוגיים מסובכיםAnges המתרחשים במהלך תכנות מחדש iCLM. לעומת זאת, clamping התיקון והדמיה חולפת סידן הם מבחנים תפקודיים תא בודד מחמירים מאוד, אבל כישורים מיוחדים וציוד נדרשים לבצע ניסויים אלה. לפיכך, המתודולוגיה המתוארת היא ייחודית בכך שהוא מספק גישה פשוטה ללמוד פרמטרים מבניים ותפקודיים מפתח של תכנות מחדש iCLM מבלי להתפשר תפוקה באופן משמעותי.
למרות ההתקדמות שחלה באחרונה רבה תכנות מחדש ישיר, עבודה רבה עוד לפנינו כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים אשר מסדיר תכנות מחדש של לב, או לייתר דיוק, מפרט תת סוג. מנגנונים אלה יהפכו חשובים במיוחד לתרגם תכנות מחדש ישיר ליישומים קליניים. ככזה, במחקר זה אנו מתארים פלטפורמה מסוגלת ויסות פרמטרים דיסקרטיים ישירות להעריך את התרומה לקראת פיתוח sarcomere, מפרט תת סוג, ובגרות iCLM. MoreoVer, מערכת זו יכולה להיות מפותחת יותר לעבוד במתכונת תפוקה גבוהה המאפשרת הקרנה מורכבת של מולקולות קטנות או מטריצות תאיות עבור לשלב הבא בקרדיולוגיה רגנרטיבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Component of iCLM media |
| Fetal bovine serrum (FBS) | Sigma | F2442 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | Component of iCLM media |
| MEM vitamin solution | Thermo Fisher Scientific | 11120-052 | Component of iCLM media |
| MEM amino acids | Thermo Fisher Scientific | 1601149 | Component of iCLM media |
| Non-Essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | Component of iCLM media |
| Antibiotic-Antimycotics | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Component of iCLM media |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Component of iCLM media |
| Heat-Inactivated Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | Component of iCLM media |
| NaPyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-70 | Component of iCLM media |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 1514022 | Component of Plat-E media and fibroblast media |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A11139-03 | Component of Plat-E media |
| Blasticidin | Gemini Bio-Products | 400-128P | Component of Plat-E media |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Component of Fibroblast media |
| Confocal laser scanning LSM700 | Zeiss | For confocal analysis | |
| FuGENE 6 transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | Transfection reagent |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Induction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL |
| Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic | CellBiolabs | RV-101 | Retroviral pacaking cell line |
| Trypsin 0.25% EDTA | Thermo Fisher Scientific | For MEFs and Plat-E dissociation | |
| Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) | Sigma | A7811 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Chicken anti-GFP IgY | Thermo Fisher Scientific | A10262 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Rabbit Pab anti-NPPA | Abgent | AP8534A | Antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Rabbit Pab anti Myl2 IgG | ProteinTech | 10906-1-AP | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Vector Labs | H-1500 | Dye for confocal analysis |
| Superfrost Plus Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips | NeuVitro Corp | GG-12-1.5 | Coverslips for confocal analysis |
| 100 μm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 0.45 μm Syringes filters SFCA 25MM | Thermo Fisher Scientific | 09-740-106 | For virus filtration |
| 6 mL Syringes | Covidien | 8881516937 | For virus filtration |
| Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 | Abcam | AB150169 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) | Thermo Fisher Scientific | A31573 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Triton X-100 | Sigma | 93443-100ml | For cell permeabilization |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) | Sigma | D8537 | |
| Power Block 10x Universal Blocking reagent | Thermo Fisher Scientific | NC9495720 | Dilute to 1x in H2O |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | Electro Microscopy Sciences | 15710 | Use at 4% diluted in dH2O |
| 6 cm plates | Olympus | 25-260 | |
| 6-well plates | Genesee Scientific | 25-105 | |
| 24-well plates | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Corning | 4239 | |
| 15 cm Tissue culture dishes | Thermo Fisher Scientific | 5442 | |
| 15 mL Conical tubes | Corning | 4308 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 4249 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma | T8154 | For viability |
| Ethyl Alcohol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | 7005 | |
| Bleach | Thermo Fisher Scientific | 6009 |
References
- Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
- Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231 (2014).
- Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243 (2015).
- Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
- Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
- Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L.
- Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
- Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Conner, D. A. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137 (2011).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807 (2014).
- Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. , (1997).
- Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).
