Introduction
Сердце является первым функциональным органом для развития у эмбриона 1, 2. В сочетании с кровеносной системой, она поставляет кислород, питательные вещества и механизм утилизации отходов в процессе разработки. Через три недели после оплодотворения, человеческое сердце бьется в первый раз, и его надлежащее регулирование поддерживается кардиомиоцитов (КМВ). Поэтому необратимая потеря этих специализированных клеток является фундаментальным вопросом, лежащий в основе прогрессирующей сердечной недостаточности. В то время как некоторые организмы , такие как данио и Xenopus имеют потенциал для регенерации сердца, взрослого сердца млекопитающих является более ограниченным 3, 5, 6. Таким образом, учитывая критическую функцию сердца, это не удивительно , что болезнь сердца является ведущей причиной смерти в мире, что составляет 600000 смертей в одной только 7 Соединенных Штатах.refore, клеточная терапия эффективно отремонтировать или заменить травмированного миокард имеют большой клинический интерес.
Семенной исследование Яманака и его коллеги показали , что 8 принудительная экспрессия четырех факторов транскрипции является достаточным для превращения полностью дифференцированные клетки фибробласты в плюрипотентные стволовые клетки. Тем не менее, онкогенные мощность всех плюрипотентных стволовых клеток стратегий был серьезную озабоченность в их использовании в терапевтических целях. Это побудило научную область для поиска альтернативных методов трансдифференцироваться клеток, избегая при этом плюрипотентных стадии. В последнее время несколько групп показали целесообразность этой стратегии, показывая прямое преобразование фибробластов мыши в индуцированных кардиомиоцитов-подобных клеток (iCLMs) с эктопической экспрессии факторов транскрипции GATA4, MEF2C, Tbx5, а позже, Hand2 (GMT и GHMT , соответственно) 9, 10. Furthermore, та же стратегия может быть выполнена в естественных условиях и в тканях человека , полученных 9, 11, 12. Недавние исследования выделены дополнительные факторы или сигнальных путей , которые могут быть модулированы для дальнейшего повышения эффективности сердечной перепрограммирования 13, 14, 15. Взятые вместе, эти исследования демонстрируют потенциал направленной трансдифференцировки для регенеративной терапии. Тем не менее, низкая эффективность СМ перепрограммирования, неизвестных молекулярных механизмов, несовместимым воспроизводимости из - за методологических различий 16 и гетерогенный характер iCLMs остаются нерешенными.
Для того, чтобы непосредственно оценить iCLM гетерогенность, мы разработали дискретный и надежный анализ одноклеточного для идентификации развития саркомера и сердечной клонального specificatioп-две необходимые характеристики функциональных кардиомиоцитов. Есть по крайней мере три основных типа КМ в сердце , как это определено их местоположение и уникальными электрическими свойствами: предсердия (AM), желудочковая (VM) и кардиостимулятором (PM) 17, 18, 19, 20. В спланированных комбинации, они позволяют надлежащим перекачку крови. Во время травмы сердца, один или все подтипы могут быть затронуты, и тип клеточной терапии необходимо будет решаться на индивидуальной основе случая. В настоящее время большинство стратегий сосредоточиться на общей генерации кардиомиоцитов, в то время как небольшая работа делается для изучения молекулярных механизмов, которые регулируют спецификацию подтипа.
Следующее исследование подробно описано, как правильно определить количество хорошо организованных саркомеры и определить разнообразный набор кардиомиоцитов подтипов. Использование кардиостимулятора (ПМ) Определённые репортер мыши, мы можем применить Immunocytochemical подход , чтобы отличить наведенные предсердные типа миоцитов (IAM), индуцированное желудочковых типа миоцитов (IVM) и индуцированные PM-как миоциты (IPMS) 21. На основании наших наблюдений, только клетки, которые обладают организации саркомера способны спонтанного избиения. Эта уникальная перепрограммирование платформа позволяет оценить роль определенных параметров в организации саркомера, спецификации подтипа, и эффективность СМ перепрограммирования при разрешении одноклеточных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры, связанные с практикой животных были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животных в UT Юго-западного медицинского центра по.
1. Выделение Hcn4-GFP E12.5 мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ)
- Настройка таймерные вязки между гомозиготных самцов Hcn4-GFP и CD-1 женщин.
- Жертвоприношение беременных женщин на E12.5 по эвтаназии двуокиси углерода и последующего смещения шейных позвонков.
- Удалить рогов матки с препаровальный пинцет , как описано выше 22, 23, и поместить их в чашку Петри на льду с 1х забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) без Са 2+ или Mg 2+.
- Выполните все последующие шаги в капюшоне культуры ткани с использованием стерильной техники.
- Удалить эмбрионов из матки и амниотической с помощью ножниц и рассекает щипцов. Держите плаценту прикрепленную для лучшей управляемости. Pregnaнт CD-1 самки обычно рождают между 10 и 14 щенков.
- Использование рассекает щипцов, возьмите изолированных эмбрионов и быстро промыть их дважды в 70% (об / об) этанола.
Примечание: Смыв должен быть быстрым, чтобы минимизировать гибель клеток. - Снимите головку, конечности, хвост, и внутренние органы, включая сердце из изолированных зародышей.
- Поместите оставшиеся ткани в 10-см чашку с 1 мл 1x PBS и мелко фарша с использованием стерильного лезвия бритвы до приблизительно 1 мм 3 в размере.
- Передача измельченной ткани в 50 мл коническую трубку с PBS.
- Спин при 300 мкг в течение 3 мин. Тщательно аспирата избыток PBS.
- Добавить 1 мл стерильного 0,25% трипсин-ЭДТА в эмбрионе. Инкубируйте клетки в водяной бане C 37 ° в течение 15 мин. Аккуратно перемешайте пробирку каждые 4 мин. Чрезмерная перевариванию ткани значительно снизить урожайность.
- смесь клеток Vortex на максимальной скорости (3200 оборотов в минуту) в течение 4 сек.
- Добавляют 2 мл фибробластами среды на эмбрион и перемешать. Фильтр тhrough сито ячейки 100 мкм с помощью пипетки, чтобы помочь клеткам через сито. Обратитесь к Таблице 1 для разработки всех последующих сред.
- Спин при 300 мкг в течение 4 мин. Тщательно аспирата супернатант.
- Добавьте 10 мл свежей фибробластами среды на 3 эмбрионов и растирать 6-10 раз.
- Пластина клеток в 1 15 см блюдо культуры ткани на каждые 3 эмбрионов, полученных. Культура в течение ночи в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора.
- После инкубации в течение ночи, замените носитель со свежими 30 мл среды на чашку. Поместите клетки обратно в инкубатор на ночь.
Примечание: Проверьте наличие Hcn4-GFP + загрязнения клеток под флуоресцентным микроскопом. Культура должна быть GFP - и только становятся GFP + на перепрограммирование. - На следующий день, урожай клеток с 3 мл свежего подогретого 0,25% трипсина-ЭДТА. Граф и заморозить клетки. Как правило, замерзают клетки в 3 × 10 6 клеток на мл. Ожидаемый YieЛ.Д. должно быть 3 × 10 6 клеток на эмбрион.
2. ретровируса Производство и перепрограммирования
Внимание: Следующий протокол требует производства и обработки инфекционных ретровирусов. Выполните следующие действия в кабинете Уровень биологической безопасности 2 под BSL-2 руководящих принципов и стерильной техники. Используйте 10% отбеливателя утилизацию всех материалов, подверженных ретровирусов.
- Ретровируса производство и подготовка MEFs
Примечание: Следующий протокол для ретровирусов производства в 6-луночные планшеты и MEF-инфекции в 24-луночные планшеты. Для других форматов, обратитесь к таблице 2. MEFs высевают в день -1, так что сроки должны быть согласованы надлежащим образом для каждого эксперимента (смотрите в разделе 2.3 и рисунок 2).- Поддерживать Плат-E (PE) клеток в соответствии с рекомендациями производителя. Вкратце, культура PE клеток в среде DMEM с добавлением 10% FBS, 1 мкг / мл puromyCIN, 10 мкг / мл бластицидин, пенициллин, стрептомицин и. Прохождение клетки 1: 4 раз в два дня, когда культура достигает 70-90% сплошности.
- День -2: За день до трансфекции, семена Плат-E клеток в количестве 1 × 10 6 клеток / лунку на 6-луночный планшет в трансфекция средах. Клетки должны быть на 70-80% сплошности во время трансфекции.
- Трансфекция с использованием коммерческого агентом трансфекции.
Примечание: Коммерческие реагенты должны быть при комнатной температуре (RT) до трансфекции. Для трансфекции ДНК, добавьте каждый ретровирусов плазмидной ДНК по отдельности (G, H, M, T) и с образованием GHMT коктейль 9.- День -1: В полистирольной трубке 15 мл коническую, смешивают 60 мкл восстановленного сыворотки среды с 6 мкл реагента для трансфекции на реакцию в течение 6- ти луночного формата пластины. Выдержите смесь в течение 5 мин при комнатной температуре.
Примечание: Поскольку трансфекция реагент, используемый здесь связывается с пластмассами, Aдд непосредственно к уменьшенному сывороточный сред, чтобы избежать снижения эффективности трансфекции. - Добавить в общей сложности 2 мкг GHMT коктейля на реакцию и осторожно нажмите, чтобы смешать его. Не вихрь. Инкубируют реакционную смесь в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Добавьте смесь из стадии 2.2.3 к защитному клеток в капле мудрое.
- Инкубируйте трансфицированных клеток Плат-E в течение ночи в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора. Запишите время трансфекции.
- День -1: В полистирольной трубке 15 мл коническую, смешивают 60 мкл восстановленного сыворотки среды с 6 мкл реагента для трансфекции на реакцию в течение 6- ти луночного формата пластины. Выдержите смесь в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Посев Hcn4-GFP эмбриональных фибробластов мыши.
- За 1 ч до посева MEFs, подготовить 24-луночный планшет для иммуногистохимии.
- Добавьте 12 мм фибронектина покровное в каждую лунку.
- Coat лунки объемом 300 мкл бычьего раствора коллагена (например, SureCoat) и инкубировать в 37 ° C инкубаторе в течение 1 ч.
- Отберите раствор для нанесения покрытия непосредственно перед MEF обшивкой.
- Оттепель замороженный флакон Hcn4-GFP MEFs и мыть x1 с подогретым fibroblAST СМИ при 500 мкг в течение 5 мин.
- Определение жизнеспособности клеток с использованием трипанового синего или подобные красители. Подсчитайте число жизнеспособных клеток на мл культуры, используя следующую формулу:
% жизнеспособных клеток = [1,00 - (Число синих клеток / Количество всех клеток)] х 100- Подсчитайте общее число жизнеспособных клеток, используя следующую формулу:
Жизнеспособные клетки =% жизнеспособных клеток х коэффициент разбавления х 10000 х общий объем клеточной суспензии
- Подсчитайте общее число жизнеспособных клеток, используя следующую формулу:
- Семенной 3 х 10 4 клеток на лунку на 24-луночный планшет с предварительно приготовленным раствором бычьего коллагена-фибронектин покровное.
- За 1 ч до посева MEFs, подготовить 24-луночный планшет для иммуногистохимии.
- Трансдукция и перепрограммирование MEFs
Примечание: В соответствии с примечаниями изготовителя, надлежащим образом Плат-E клетки производят средний титр 1 × 10 7 инфекции ед / мл. Несмотря на то, титр не измеряется непосредственно для каждого эксперимента, контрольная GFP, всегда включается в качестве суррогата эффективность инфекции.Высокая экспрессия GFP и интенсивность (GFP +> 95%) , как правило , коррелирует с успешным GHMT-опосредованной поколения iCLMs.- День 0: 24 ч после трансфекции, фильтровать PE ретровирусов среды через мкм размер пор фильтра 0,45 поверхностно- активных веществ ацетата целлюлозы и переносят в 15 мл коническую трубку. Добавить полибрен до конечной концентрации 8 мкг / мл. Тщательно пополнять клетки с 2 мл свежей среды для трансфекции.
Примечание: клетки легко отделяются от пластины, если средства массовой информации меняется слишком быстро. - Аспирируйте среду культивируемых MEFs и добавьте свежесобранных ретровирусов среду; она не должна приводить в 1,7 мл среды на лунку 6-луночного планшета. Добавить ~ 800 мкл на лунку 24-луночного планшета. Возвращение MEF пластины в инкубатор и инкубировать в течение ночи.
- День 1: Повторите шаги 2.4.1 и 2.4.2. Откажитесь клетки после сбора вируса 2 - го. Возвращение зараженных MEFs в инкубатор и дайте им отдохнуть в течение ночи.
- День 2: 48 ч после индукции, аспирация клетка кондиционированной среды и мыть x1 с 1x PBS. Добавьте 500 мкл предварительно нагреты iCLM среды на лунку 24-луночного планшета.
- Заменить iCLM СМИ каждые 2 - 3 дня. Процесс пластины 14 дней после вирусной индукции для иммуноцитохимия (МУС) анализа сердечной перепрограммирования.
- День 0: 24 ч после трансфекции, фильтровать PE ретровирусов среды через мкм размер пор фильтра 0,45 поверхностно- активных веществ ацетата целлюлозы и переносят в 15 мл коническую трубку. Добавить полибрен до конечной концентрации 8 мкг / мл. Тщательно пополнять клетки с 2 мл свежей среды для трансфекции.
3. Иммуноокрашивание перепрограммирован MEFs
- 14 дней после индукции, тщательно аспирата СМИ.
- Промыть каждую лунку 300 мкл охлажденного на льду 1x PBS. Аспирируйте избыток раствора.
- Закрепить клетки с 250 мкл 4% -ного раствора параформальдегида (PFA) на лунку 24-луночного планшета. Инкубировать 15 мин при комнатной температуре.
Примечание: Фиксированные клетки могут быть сохранены в PBS при 4 ° С в течение 1 - 2 недель перед окрашиванием. - Проницаемыми клетки путем промывки скважин x3 с 300 мкл 0,1% PBS-Тритон 100 (PBST). Выдержите 5 минут при комнатной температуре между стирок. Аспирируйте избыток раствора после последней промывки.
- Блок для 10мин при комнатной температуре с 1x универсальный блок буфером при 300 мкл / лунку.
- Подготовить (ICC) буфера окрашивания: Добавить 1: 1 из 1x PBS и 1x Универсальный блокирующий буфер. Развести первичных антител в БЦХ буфере окрашивания и инкубировать антител в течение ночи при температуре 4 ° С. Обратитесь к разделу материала для рекомендуемых разведениях.
- Пятно одну пару слайдов с мышью альфа-актинин, ветряная αGFP и кролика NPPA для IPM и IAM идентификации.
- Пятно одну пару слайдов с помощью мыши альфа-актинин, курица αGFP и кролика Myl2 для IPM и IVM идентификации.
- На следующий день, мыть лунки x3 с 300 мкл 0,1% PBST. Выдержите 5 минут при комнатной температуре между стирок. Аспирируйте избыток раствора после последней промывки.
- Подготовка вторичных разведений антител в окрашивании ICC буфере. Обратитесь к разделу материала для рекомендуемых разведениях. Инкубируйте вторичными антителами 1 час при комнатной температуре, в защищенном от света.
- Пятно все слайды со следующим вторичным antibodies: мышь Alexa-555, курица Alexa-488, и кролик Alexa-647.
- Промыть лунки x3 с 300 мкл 0,1% PBST. Выдержите 5 минут при комнатной температуре между стирок. Защита от света.
- Добавить 2,4 мкл монтажными среды, содержащей 1,5 мкг / мл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) на предметное стекло микроскопа. Осторожно удалите покровное из лунке 24-луночного планшета, удаления избытка раствора, и передать на предметное стекло с крепежными средствами массовой информации. Аккуратно нажмите покровное для удаления избытка объема и воздуха.
- Печать слайдов с предпочтительным лака для ногтей или пластиковым уплотнителем. Хранить слайды при 4 ° С в защищенном от света.
4. Идентификация сердечной подтипов Использование конфокальной микроскопии
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения изображений, конфокальный микроскоп оснащен по меньшей мере, 2 флуоресцентных детекторов, способных спектрального детектирования при 405, 488, 555 и 639 нм длин волн необходимо для того, чтобы идентифицировать IPMS, Iams и IVMS. Imagе клетки, используя план-Apochromat 20X / 0.75 цели или лучше. Использование программного обеспечения для анализа изображений производителя, сканирование увеличить изображения можно добиться 40X-качества нефти погружения изображения.
- Библиотека изображений: принимать 8-битные изображения с DAPI, Alexa-488, Alexa-555 и Alexa-647 каналов (гл.). Пиксель время выдержки 6 с, 1024 размер кадра, линия шага на 2, и усреднение 2 достаточно для изображений с высоким разрешением.
- Для каждого слайда, начните с одного края и начать сканирование вверх и вниз в красный флуоресцентный канал (ч.) Для альфа-актинин + саркомера + клеток (на рисунке 3 и на рисунке 5А для примеров). Саркомера страты легче идентифицировать визуально в 555 нм.
- После того, как α-актинин + саркомера + клеток был идентифицирован, переключиться на зеленый гл. и держать внимание, если она положительна (IPM). Переключение на компьютер, чтобы оценить далеко красный 647 ч. (IAM или IVM).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейкиα-актинин + / саркомера + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 - обозначаются как IPMS. Выражение GFP будет видно в течение всего клеточного (фиг.4А). - Пятно слайды с альфа-актинин (мышь-Alexa555), Hcn4-GFP (курица-Alexa488), NPPA (кролик-Alexa647) и DAPI. Клетки , которые являются α-актинин + / саркомера + / Hnc4-GFP - / + NPPA являются IAM. NPPA окрашивание будет появляться перинуклеарного и (рисунок точечный 4B).
- Пятно слайды с альфа-актинин (мышь-Alexa555), Hcn4-GFP (курица-Alexa488), Myl2 (кролик-Alexa647). Клетки для положительных a-актинин + / саркомера + / Hnc4-GFP - / + Myl2 являются IVMS. Myl2 окрашивание будет демонстрировать исчерченную форму вдоль саркомера нити. Из -за различий в качества окрашивания и Z-плоскости, страты не всегда может быть легко видна (рис 4C).
- После того, как α-актинин + саркомера + клеток был идентифицирован, переключиться на зеленый гл. и держать внимание, если она положительна (IPM). Переключение на компьютер, чтобы оценить далеко красный 647 ч. (IAM или IVM).
Примечание: Для того чтобы оценить реальное количество потенциально перепрограммировать MEFs, 2 лунки 24-луночного планшета высевают параллельно с экспериментальными скважин и собирают через один день после посева. Общее количество посеянных клеток затем определяется путем усреднения двух скважин. Это становится фактическим полным посеянных клеток (aTotal).
- саркомера +
- Осмотрите каждую ячейку на покровное для правильной альфа-актинин + / + саркомера (справа панели Рисунок 3) и записи (рис 5B-I).
- Сведите общее количество альфа-актинин + / + саркомера на каждом покровном и разделить на фактическое общее посеянных клеток (aTotal) (рис 5B-III). Например, если были альфа-актинины aTotal = 12500 клеток, а также 100 клеток + / + саркомера тогда, были перепрограммировать 0,8% от посеянных MEFs. В среднемreprograming эксперимент даст 1% альфа-актинин + / саркомера + клеток (рис 5в).
- Подтип +
Примечание: Для следующих шагов, обратитесь к рисунку 5B / C для типичного рабочего процесса iCLM количественной оценки. Если коротко, то для каждого саркомера + клетки, в виде таблицы , если он уникален для любого подтипа (рис 5B-I). Подсчитайте% подтип (рис 5B-III) путем деления числа подтипа + клеток в течение среднего саркомера + -клеток х 100 (рис 5B-I). Для расчета абсолютной эффективности% подтипа (рис 5B-IV), делят подтипа + -клеток число от фиг.5В-I на общее число клеток , посеянных х 100 (фиг.5В-II).- Для каждого из альфа-клеток актинин + / + саркомера, оценить , если они являются GFP +, NPPA +, или Myl2
- Сведите общее количество альфа-актинин + / саркомера + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 -, актинин + / саркомера + / Hnc4-GFP - / NPPA +, и α-актинин + / саркомера + / Hnc4-GFP - / Myl2 + клеток (рис 5B-I).
- Для того, чтобы вычислить процент каждого подтипа, необходимо разделить количество Подтип + клеток от общего количества альфа-актинин + / саркомера клетки + в этой лунке и умножить на 100. GHMT генерирует IPMS, Iams и IVMS примерно в равных соотношениях (рис 5B-III).
- Для того, чтобы вычислить абсолютное число подтипа + клеток, разделить общее число подтипа + клеток для экспериментальных услови х с помощью aTotal и умножить на 100 (Фиг.5В-II). В среднем IPMS составляют 0,3% от общего инфицированной клеточной популяции, Iams на 0,3%, аIVMS 0,25% (рис 5B-IV).
- Для каждого из альфа-клеток актинин + / + саркомера, оценить , если они являются GFP +, NPPA +, или Myl2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Воспользовавшись PM-специфической репортерной мыши, мы разработали мультиплекс стратегию Иммуноокрашивание для выявления различных эндогенных миоцитов , как показано на рисунке 1. После шагов перепрограммирования , показанные на рисунке 2, индукция специфических подтипов CMs могут быть обнаружены уже в 4 -й день 21, хотя и с низкой скоростью. К 14 -му дню, эксперимент может быть остановлен и оценивали саркомера организации (рисунок 3) и подтип-спецификации (Рисунок 4). На рисунке 5 приведены рабочий процесс подготовки слайдов для ICC (Рисунок 5 Панель A), а также определение количества iCLM подтип-специфических клеток (рисунок 5 Группа B / C).
Рисунок 1: Подтип Разнообразие эндогенногоКардиомиоцитов. (AB) Иммуноцитохимическая (МТП) окрашивание неонатальных предсердных кардиомиоцитов из Hcn4-GFP мышей репортер альфа-актинин (саркомер маркеров, красный), Hcn4-GFP (PM маркер, зеленый), и NPPA (мерцательная маркер, оранжевый). (C) Иммуноцитохимическая окрашивание неонатальных желудочковых кардиомиоцитов из Hcn4-GFP мышей репортер альфа-актинин (саркомер маркеров, красный), Hcn4-GFP (PM маркер, зеленый), и Myl2 (желудочковая маркер, оранжевый). DAPI (синий): ядерное окрашивание. Шкала баров: 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1: культуральная среда. Сводная таблица для подготовки нескольких сред, используемых во время GHMT-индуцированной перепрограммирования. Таблица 2: Посев, Трансфекция и индукционные форматы.(A) Сводная таблица для обшивки и трансфекции клеток. (B) плотность Посевная и приблизительная инфекции единиц (или вирусный супернатант) необходимо , чтобы побудить MEFs в кардиомиоцитов-подобных клеток. 
Рисунок 2: Перепрограммирование Timeline схематичными. Схематическое представление GHMT-индуцированных Hcn4-GFP MEFs. Три основные этапы изображены. 
Рисунок 3: Степень саркомера организации. ICC окрашивание Hcn4-GFP MEFs через 14 дней после GHMT трансдукции для альфа-актинин (саркомера маркер, красный) показывает разнообразные организации саркомера. Степень организации увеличивается слева направо панелей. Типичные картины каждого уровня (п = 3). Шкала бар: 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Рисунок 4: Подтип специфические перепрограммирован Cardiomyo cytes. (AC) ICC окрашивание GHMT-трансдуцированную Hcn4-GFP MEFs для альфа-актинин (саркомера маркер, красный), Hcn4-GFP (PM маркер, зеленый), NPPA (мерцательная маркер, оранжевый), или Myl2 (желудочковая маркер, оранжевый) , DAPI (синий): ядерное окрашивание. Шкала баров: 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Рисунок 5: Получение изображения и анализ рабочих процессов. Схематическое представление для анализа изображений. Панель А изображает приоритетный порядок присвоения саркомера + и подтипов специфичности к клетке. Группа B (I-IV) и C показывают ожидаемые результаты от среднего эксперимента GHMT-iCLM. Основные положения и формулы показаны зеленым цветом.ом / файлов / ftp_upload / 55456 / 55456fig5large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. iCLM СМИ Компонент Объем (мл) Конечная концентрация DMEM 270 Средняя 199 90 FBS 50 10% Инсулин-трансферрина-Селен G 2.5 0,50% раствор витамина MEM 10 2% MEM Аминокислоты 20 4% Non-незаменимые аминокислоты 10 2% Антибиотик-антимикотиками 10 2% B-27 дополнения 10 2% Инактивированной нагреванием лошадиной сывороткой 25 5% Na-пируват 2.5 1,5 мМ Плат-E медиа (ПЭ) Компонент Объем (мл) Конечная концентрация DMEM 450 FBS 50 10% Пенициллин / стрептомицин 5 1% Пуромицин 0,05 1 мкг / мл бластицидин 0,5 10 мкг / мл Фибробласт среда (FB) Компонент0; Объем (мл) Конечная концентрация DMEM 450 FBS 50 10% Пенициллин / стрептомицин 5 1% Glutamax 5 1% Трансфекция среда (TxF) - Filtered (0,45 мкм) Компонент Объем (мл) Конечная концентрация DMEM 450 FBS 50 10% Иммуноцитохимическая (ICC) буфера окрашивания Компонент Объем (мл) Конечная концентрация 1x PBS 5 1x Универсальный Блокирующий буфер 5 A) Cell высева и трансфекция Плита / Посудомоечная Площадь поверхности (см 2) Посев плотности (клетки) Среднего роста (мл) Общее количество ДНК для трансфекции (мкг) Трансфекция Реагент (мкл) Снижение сыворотки Средства массовой информации (мкл) 15 см пластины 152 1.00E + 06 20 25 75 600 10 см пластины 55 5.50E + 06 10 9 27 300 6 см пластины 21 2.20E + 06 4 3.5 10.5 105 6 хорошо / x1 9 1.00E + 06 2 2 6 60 12 хорошо / x1 4 4.00E + 05 1 0,5 1.5 15 24 хорошо / x1 2 2.00E + 05 0,5 0,3 0,9 9 48 хорошо / x1 1 1.70E + 05 0,25 0,15 0,45 4.5 Б) Фибробласт высева и индукция Плита / Посудомоечная Фибробласт плотности высева (миллионы) Приближенные единицы инфекции для iCLM 6 см пластины 0.22-0.33 5.00E + 7 (~ 5 мл) 6 хорошо / x1 0.1-0.15 3.00E + 7 (~ 3 мл) 12 хорошо / x1 0.04-0.06 1.30E + 7 (~ 1 мл) 24 хорошо / x1 0.02-0.03 6.50E + 6 (~ 0,8 мл) 48 хорошо 0.001-0.015 3.00E + 6 (~ 0,4 мл)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Настоящее исследование представляет собой стратегию прямого перепрограммирования для превращения MEFs в разнообразный набор сердечных подтипов с помощью ретровируса-опосредованной экспрессии кардиального факторов транскрипции Gata4, MEF2C, Tbx5 и Hand2 (GHMT). Использование мультиплекс Иммуноокрашивание подход в сочетании с ПМ-специфической репортерной мыши, мы можем определить IAM, IVMS и IPMS в одной резолюции клетки. Такой анализ позволяет экспериментальной системы в пробирке , способной изолировать вклад отдельных факторов транскрипции по отношению к подтипу разнообразия и развития саркомера. Параллельно с этим, это может принести способность проникновения в суть новых факторов транскрипции или малых молекул, которые смещают iCLMs по отношению к определенной линии. Тем не менее, существует несколько важных шагов для успешного завершения этого анализа. Ниже мы рассматриваем влияние титра вируса, качество фибробластами и анализа изображений в общем эксперименте iCLM.
В нашем исследовании мы EMPЛой экотропного-ретровирусы перепрограммировать E12.5 MEFs. Мы заметили, что ретровирусный титр напрямую связана с качеством клеток. номер Высокий проход (> 35) и бедные методы культивирования серьезно влияют на качество ретровирусных частиц; Таким образом, есть несколько соображений, чтобы иметь в виду. Плат-E - клетки не производят вирус pseudotyped VSV-G, и, таким образом , не в силах противостоять ультрацентрифугирования или замораживания циклов 24, 25. Для того чтобы сохранить долговечность клеток, крайне важно для поддержания запаса с выбором антибиотика. Тем не менее, они должны быть сохранены в антибиотической свободных средств массовой информации во время вирусного производства. По нашему опыту, трансфекция реагент, используемый здесь, обеспечивает наивысшую эффективность трансфекции в клетках. Если другие методы трансфекции должны быть использованы, сравнивая вирусные титры , полученные имеет важное значение 26. Хотя есть рекомендации производителя для сборавирусный супернатант 48 ч после трансфекции, мы наблюдали, что два 24-х уборочных раундов дают более высокую эффективность перепрограммирования, избегая при этом токсические эффекты, которые обычно ассоциируются с более высоким титром вируса Preps. Кроме того, хотя некоторые исследования показали целесообразность коммерческих вирусных супернатантных концентраторов 27, мы не использовали их в нашем регулярном протоколе для того , чтобы поддерживать более высокую пропускную способность .
В дополнение к высоким титром вирусных коктейлей, качество фибробласты имеет решающее значение для успешного анализа перепрограммирования 28. Если приурочен правильно, свежевыделенные MEFs следует использовать из-за их более высокой эффективности по сравнению с замороженных запасов. Это может быть связано с характером ретровирусов, так как они нуждаются в высоко-пролиферативный хоста с целью интеграции 29. Кроме того, MEF плотность посева играет решающую роль. Мы включили в таблицу с занятых плотности высеваВ наших экспериментах (таблица 2). Кроме того, пассирования MEFs также значительно снижает эффективность перепрограммирования.
Иммуноцитохимическая (ICC) является нашим стандартным методом для анализа организации саркомера и спецификации подтипа. С помощью мыши репортер PM-GFP, мы смогли сформировать панель антител для обнаружения трех основных сердечных подтипов (AM, VM и ПМ). Однако из-за ограничений антитела наличия видов и ограничение 4-х каналов на стандартном конфокальной микроскопии установка, два покровные на подтипа необходимы для количественной оценки распространенности всех трех подтипов. Один покровное будет пятно для альфа-актинин / GFP (Hcn4) / Myl2, и один для альфа-актинин / GFP (Hcn4) / NPPA. Основываясь на нашем предыдущем наблюдении , что саркомера структура является общей характеристикой всех КМВ и потенциальной предпосылкой для подтипа спецификации 21, первый шаг в нашем анализе является определение саркомера +клетки. Тем не менее, в силу своей субъективной природы, устанавливая уровень организации саркомера, пожалуй, самая трудная часть этого анализа; это может быть ограничено путем усреднения количественными многократной наблюдательные или путем разработки программного обеспечения вычислительной сегментации клеток для автоматизации процесса 30. Использование эндогенные клетки в качестве точки отсчета, мы обнаружили , порог для хорошо организованного саркомера + и используется , что забить iCLMs (рисунок 3). Учитывая эти параметры, в среднем эксперимент приведет к 20 - 30% альфа-актинины + клеток , но только 1% являются альфа-актинина + / + саркомера. Саркомера + клеток на 1%, ~ 30% будет NPPA +, Myl2 + или Hcn4-GFP +.
Учитывая , что кардиомиоциты являются структурно сложными, население на основе экспрессии генов (например , QRT-PCR) или проточной цитометрии анализ не может захватить сложную морфологическую чАнж, которые происходят во время iCLM перепрограммирования. В отличие от этого, патч зажима и переходных процессов визуализации кальция весьма жесткие функциональные анализы одноклеточные, но специальные навыки и оборудование, необходимые для проведения этих экспериментов. Таким образом, описанная методика уникальна тем, что она обеспечивает простой подход к изучению ключевых структурных и функциональных параметров iCLM перепрограммирования без существенного ущерба для пропускной способности.
Несмотря на множество последних достижений в области прямого перепрограммирования, многое еще предстоит сделать, чтобы лучше понять молекулярные механизмы, которые регулируют сердечный перепрограммирование, и более конкретно, спецификации подтипа. Эти механизмы станут особенно важны для перевода прямого перепрограммирования для клинического применения. Таким образом, в данном исследовании мы описываем платформу, способную непосредственно модулировать дискретных параметров для оценки вклад в развитие саркомера, спецификации подтипа и iCLM зрелости. Moreoвер, эта система может быть дополнительно разработаны для работы в формате с высокой пропускной способностью, позволяющей для комплексного скрининга малых молекул или внеклеточных матриц для следующего шага в регенеративной кардиологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Component of iCLM media |
| Fetal bovine serrum (FBS) | Sigma | F2442 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | Component of iCLM media |
| MEM vitamin solution | Thermo Fisher Scientific | 11120-052 | Component of iCLM media |
| MEM amino acids | Thermo Fisher Scientific | 1601149 | Component of iCLM media |
| Non-Essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | Component of iCLM media |
| Antibiotic-Antimycotics | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Component of iCLM media |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Component of iCLM media |
| Heat-Inactivated Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | Component of iCLM media |
| NaPyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-70 | Component of iCLM media |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 1514022 | Component of Plat-E media and fibroblast media |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A11139-03 | Component of Plat-E media |
| Blasticidin | Gemini Bio-Products | 400-128P | Component of Plat-E media |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Component of Fibroblast media |
| Confocal laser scanning LSM700 | Zeiss | For confocal analysis | |
| FuGENE 6 transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | Transfection reagent |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Induction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL |
| Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic | CellBiolabs | RV-101 | Retroviral pacaking cell line |
| Trypsin 0.25% EDTA | Thermo Fisher Scientific | For MEFs and Plat-E dissociation | |
| Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) | Sigma | A7811 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Chicken anti-GFP IgY | Thermo Fisher Scientific | A10262 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Rabbit Pab anti-NPPA | Abgent | AP8534A | Antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Rabbit Pab anti Myl2 IgG | ProteinTech | 10906-1-AP | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Vector Labs | H-1500 | Dye for confocal analysis |
| Superfrost Plus Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips | NeuVitro Corp | GG-12-1.5 | Coverslips for confocal analysis |
| 100 μm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 0.45 μm Syringes filters SFCA 25MM | Thermo Fisher Scientific | 09-740-106 | For virus filtration |
| 6 mL Syringes | Covidien | 8881516937 | For virus filtration |
| Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 | Abcam | AB150169 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) | Thermo Fisher Scientific | A31573 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Triton X-100 | Sigma | 93443-100ml | For cell permeabilization |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) | Sigma | D8537 | |
| Power Block 10x Universal Blocking reagent | Thermo Fisher Scientific | NC9495720 | Dilute to 1x in H2O |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | Electro Microscopy Sciences | 15710 | Use at 4% diluted in dH2O |
| 6 cm plates | Olympus | 25-260 | |
| 6-well plates | Genesee Scientific | 25-105 | |
| 24-well plates | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Corning | 4239 | |
| 15 cm Tissue culture dishes | Thermo Fisher Scientific | 5442 | |
| 15 mL Conical tubes | Corning | 4308 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 4249 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma | T8154 | For viability |
| Ethyl Alcohol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | 7005 | |
| Bleach | Thermo Fisher Scientific | 6009 |
References
- Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
- Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231 (2014).
- Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243 (2015).
- Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
- Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
- Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L.
- Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
- Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Conner, D. A. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137 (2011).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807 (2014).
- Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. , (1997).
- Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).
