Summary
Her beskriver vi en hurtig-likevektsdialyse (RED) -metode for å måle legemiddelbindingen til kaseum fra lungekirberose-lesjoner og hulrom. Protokollen brukes også med en skummende makrofag-avledet matrise som er en effektiv surrogat til kaseum.
Abstract
Utryddelsen av tuberkulose sykdom krever legemiddelregimer som kan trenge inn i de flere lagene av komplekse pulmonale lesjoner. Narkotikafordeling i tilfellehulene i hulrom og lesjoner er spesielt viktig fordi de har subpopulasjoner av stofftolerante bakterier, også ofte referert til som persister. Eksisterende metoder for måling av legemiddelinntrengning i tuberkulose-lesjoner medfører kostbare og tidkrevende farmakokinetiske studier in vivo koblet til bioanalytiske eller imagingteknikker. In vitro- måling av medikamentbinding til caseummakromolekyler ble foreslått som et alternativ til slike teknikker, siden denne binding hindrer passiv diffusjon av legemiddelmolekyler gjennom caseum. Hurtig likevektsdialyse er et raskt og pålitelig system for utførelse av plasmaprotein og vevsbindingsstudier. I denne protokollen brukte vi en hurtig-likevektsdialyse (RØD) enhet for å måle medikamentbindingen til homogenater av caseum som er excisUtført fra lesjoner og hulrom av tuberkuloseinfiserte kaniner. Protokollen beskriver også hvordan man genererer en surrogatmatrise fra lipidbelastede THP-1 makrofager for å bruke i stedet for caseum. Denne caseum / surrogatbindingsanalysen er et viktig verktøy for tuberkulose-legemiddelfunn og kan tilpasses for å bidra til å studere legemiddelfordeling i lesjoner eller abscesser forårsaket av andre sykdommer.
Introduction
Behandlingen av pulmonell tuberkulose sykdom krever effektiv distribusjon av legemidler i forskjellige typer lesjoner. Nekrotiske lesjoner og hulrom inneholder caseous sentre som havner subpopulasjoner av stofftolerante eller "vedvarende" bakterier. 1 , 2 Kavitasykdommen er assosiert med dårligere herdesatser og dårlig prognose. 3 , 4 Tidligere studier har vist, ved hjelp av kvantitative og imaging teknikker, at evnen til å trenge inn i caseum varierer vesentlig fra en narkotikaklasse til en annen. 5 , 6 Disse metodene krever imidlertid bruk av dyreinfeksjonsmodeller som er treg og kjedelig. En in vitro- analyse som måler legemiddelbindende til eks vivo- caseum, ble designet. Denne binding ble funnet å reversere korrelere med medikamentpenetrering i caseous granulomer og er derforBrukes som et prediktivt verktøy. 7
Likevektsdialyse betraktes som gullstandardmetoden for plasmaproteinbindingsstudier. Den raske likevektsdialysen (RED) -enheten gir et raskt, brukervennlig og pålitelig system for å utføre slike analyser. 8 Enheten består av to komponenter: engangsbruk, engangsinnsatser bestående av 2 kamre adskilt av en vertikal sylinder av semi-permeabel membran; Og gjenbrukbare grunnplater som kan holde opptil 48 innlegg på en gang. Dialysemembranen har en 8 kDa molekylvekt cut-off (MWCO) som er ideell for medisin-makromolekylbindingsstudier. Det høye overflate-til-volumforholdet i membranrommet muliggjør rask dialyse og likevekt. Både innsatsene og basisplaten er validert for minimal, ikke-spesifikk binding. Kombinasjonen av den RØDE enheten med bioanalytiske teknikker gir nøyaktige estimater av ubundne fraksjoner av legemidler i plasma. 8 , 9
Selv om opprinnelig designet for å måle plasmaproteinbinding, har den RØDE enheten vært brukt i flere vevbindende studier ved bruk av homogenater. 10 , 11 I denne protokollen måler vi medikamentbindende til kaseum, den nekrotiske rusk skåret ut fra nekrotiske lesjoner og hulrom av tuberkuloseinfiserte kaniner. Den akellulære og ikke-vaskulære karakteren av caseous materiale gjør det enkelt å homogenisere til en homogen suspensjon som er kompatibel med analysen.
Gitt at caseum er kjedelig å produsere og vanskelig å komme forbi, har protokollen også blitt validert for bruk med en surrogatmatrise som er fremstilt fra skumete makrofager. THP-1 monocyt-avledede makrofager induseres med oljesyre for å akkumulere flere lipidlegemer som gir dem deres "skummende" utseende. Disse lipidbelagte cellene høstes ogBehandlet for å produsere en matrise som vi bruker som en surrogat til caseum. Denne studien har vist at medikamentbindingen til denne surrogatmatrisen korrelerer godt med binding til kaseum, som effektivt etterligner in vivo- prosessen som hindrer legemiddelpenetrasjon i caseous kjerne av granulomer og hulrom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med veiledningen for pleie og bruk av laboratoriedyr ved National Institutes of Health med godkjenning fra NIAHs institusjonelle dyrepleie- og brukskomité, Bethesda, MD. Alle studier som involverte M. tuberculosis ble utført i et laboratorium med biosikkerhetsbegrensning nivå 3 (BSL-3).
1. Kanininfeksjonsmodell og Caseum Collection
- Infiser New Zealand hvite kaniner med M. tuberculosis ved bruk av et eksponeringssystem med nese-bare aerosol som tidligere beskrevet. 12 , 13 Tillat infeksjonen å utvikle seg i 12-16 uker. Sedat kaninene med 35 mg / kg ketamin og 5 mg / kg xylazin intramuskulært, euthaniser kaninene med 0,22 ml / kg pentobarbitalnatrium og fenytoinnatrium intravenøst og fortsett med nekropsjonene.
- Ved hjelp av pinsett og en skalpell, fjern lungene fra brystet ca.vity. Fra hver lungelag, disser ut individuelle hulrom og store nekrotiske granulomer ved hjelp av en skalpell. Skru forsiktig av kammerum fra hulrom og granulomegg. Veier, registrerer og oppbevarer prøver i 2 ml skruer med kapsler på -20 ° C til bruk for bruk.
- Gamma-bestråle infeksiøse caseumprøver ved 3 MegaRad på tøris for å gjøre dem uinfeksjonelle og sikre for bruk i et BSL-2-laboratorium.
2. In Vitro Generering av Caseum Surrogat fra THP-1 Cells
- Voks THP-1 monocytter i RPMI 1640 medium (2 mM L-glutamin og 10% føtalt bovint serum) i T175 cellekulturflasker (80 ml / kolbe). Inkuber kolberne i en 5% CO 2 atmosfære ved 37 ° C i 3-4 dager.
- Sentrifuger kulturen fra en T175-kolbe i to 50 ml koniske rør ved 150 xg i 5 minutter. Kast supernatanten og suspender pelleten i 10 ml RPMI 1640 media.
- Pipetter 5 μl av denne kulturen inn i et 1,5 ml rør som inneholder 45 μl tFrodige blå. Bland godt gjennom pipettering. Overfør 10 μL til et hemocytometer og telle antall levedyktige THP-1 monocytter (ufarget) ved hjelp av et lysmikroskop (10X forstørrelse). Beregn antall levedyktige celler per ml av kulturen. Fortynn den med RPMI media til den endelige tettheten på 1,25 x 106 celler / ml.
- Last 40 ml av kulturen på en stor cellekulturplate (50 x 106 celler / plate). Tilsett 40 μl 100 μM PMA (phorbol 12-myristate13-acetat fremstilt i etanol) og la celler adhere over natten i inkubatoren.
MERK: Den endelige konsentrasjonen av PMA er 100 nM. - Fortynn ren oljesyre (OA) (0,89 g / ml) i etanol til konsentrasjonen på 0,1 M ( dvs. 31,7 μL OA i 968,3 μl etanol). Fortynn denne løsningen i fersk forvarmet RMPI-medium til en konsentrasjon på 10 mM. Fortynn denne OA suspensjonen til 0,4 mM (endelig arbeidskonsentrasjon) i RPMI medium pre-warmed til 37 ° C.
- Fjern eksisterende media og ikke-adherede celler fra cellekulturplattene og forsiktig tilsatt 40 ml 0,4 mM OA til THP-1 makrofager (THP-M). Inkuber ved 37 ° C i inkubatoren over natten.
- Bruk et lysmikroskop ved 40x forstørrelse for å visuelt bekrefte tilstedeværelsen av mange lipidlegemer inneslutninger i hver THP-M. Fjern alt RPMI medium fra cellekulturplattene og vask forsiktig de adherente celler to ganger med fosfatbuffert saltvann (PBS) ved hjelp av en 50 ml serologisk pipette.
MERK: Lipidlegemer vises som små, klare, sfæriske strukturer i cytoplasmaet til THP-M. - Tilsett 40 ml 5 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i PBS til hver plate. Inkuber i 15 minutter ved 37 ° C.
- Løsne skummende makrofager (FM) ved å pipettere opp og ned over overflaten av hele platen ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette. Overfør cellesuspensjonen til et 50 ml konisk rør og spinn ned ved 150 xg i 5 minutter.
- Resuspender cellepellet i 10 ml PBS (tredje PBS-vask) aNd overføring til et forhåndsvektet 15 ml konisk rør. Spinn ned igjen ved 150 xg i 5 minutter. Sug forsiktig supernatanten ved hjelp av en serologisk pipette og kast bort.
- Behandle FM-pelletsene til 3 fryse-tine-sykluser for å lysere cellene og inkuber dem ved 75 ° C i 20-30 minutter til denatureringsproteiner i matrisen. Oppbevar pelletsene ved -20 ° C til klar for bruk.
3. Rapid Equilibration Dialysis (RED) Assay
- Tilbered 10 mM stamløsninger av alle testforbindelser i dimetylsulfoksid (DMSO). Fortynn til 500 μM arbeidsløsninger i DMSO før hver analyse.
- Veie røret som inneholder caseum surrogatpellet. Trekk vekten av det tomme røret for å utlede vekten av pellet alene. Tilsett 2-3 metallperler per rør og, ved hjelp av en vevshomogenisator ved 1200 slag / min i 1 min, forstyrre caseum eller surrogatmatrisen i PBS (1: 9 vekt / volum) for å oppnå 10x fortynnet suspensjon av hver matrise.
- Spike 6.5 μL av 500ΜM oppløsning av testforbindelsen i 643,5 μL av homogenatet for å oppnå den endelige konsentrasjonen på 5 μM (≤1% DMSO) og hvirvel.
- Sett de RØDE innsatsene i grunnplaten. Tilsett 200 μL av den medisinske spikmatrisen i donorkammeret (rød ring) av hver RØD innsats og 350 μl PBS i hvert mottakerkammer. Forbered 3 innlegg for hver testforbindelse (tre eksemplarer). Tetningsplate med en klebende tetningsplate og inkuberes ved 37 ° C på termomixeren ved 200 rpm (1 xg) i 4 timer.
- Etter inkubasjonen blandes forsiktig innholdet i donor- og mottakerkamrene ved pipettering opp og ned 2-3 ganger. Pipetter ut 20 μl alikvoter av homogenat fra donorkamrene og tilsett til 20 μl rent PBS i et 1,5 ml rør (1: 1). På samme måte pipetterer du 20 μl alikvoter av PBS-prøver fra mottakerkamrene og legger til 20 μl rent homogenat (matrise matching). 8
MERK: Matrix-matching eliminerer neEd for 2 separate kalibreringskurver (i homogenat og PBS) som skal gjøres for kvantitativ analyse. Innholdet i donorkammeret kan sedimentere over tid. Bland forsiktig innholdet ved pipettering før du fjerner alikvoter.
4. LC-MS Kvantifisering og Data Analyse
- Tilsett 160 μl 1: 1 metanol: acetonitril inneholdende 500 ng / ml diklofenak eller 10 ng / ml verapamil (intern standard) til hvert rør og hvirvel for å utfelle proteiner. Sentrifuger ved 10 000 xg i 5 minutter for å sedimentere utfellingen og overføre supernatanter til 96-brønn dypbrønnplater for væskekromatografi-massespektrometri-analyse (LCMS). 7
- Bygg kalibreringskurver fra 1-1000 nM for hver testforbindelse mens du holder samme matriksammensetning som prøvene ovenfor. Kvantifiser konsentrasjonen av testforbindelse i prøver fra donor- og mottakerkamrene ved bruk av en LC-MS-metode.
- Beregn den ubundne fraksjonen ( f u ) oF stoffet i fortynnet matrise ved bruk av ligning 1. Beregn f u i ufortynnet matrise ved bruk av ligning 2 ( D = fortynningsfaktor på 10). 14
- Kontroller gjenopprettingen (massebalanse) for hver forbindelse ved å bruke ligning 3 for å identifisere forbindelser med stabilitet / metabolisme / ikke-spesifikke bindingsproblemer.
MERK: Gjenoppretting faller vanligvis mellom 70% og 130%. 15
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne protokollen har vi testet hundrevis av tuberkulose-stoffutviklingsforbindelser for deres forventede effektivitet ved penetrerende caseum. Figur 1 visualiserer de grunnleggende konseptene i RED-analysen. Dialysemembranen til de RØDE innsatsene tillater at ubundne små molekyler diffunderer fra donorbrønnen til mottakerbrønnen og til slutt oppnår en likevekt mellom begge rom. Små molekyler som er bundet til makromolekyler som proteiner eller lipider, er fanget i donorbrønnen. Kvantitativ analyse av prøvene fra begge rom tillater beregning av ubundet fraksjon ( f u ) av hvert lite molekyl i caseum eller surrogatmatrisen. Denne fraksjonen har vist seg å være direkte korrelert med legemiddelpenetrasjon i caseum in vivo . 7 Som figur 2 illustrerer ved bruk av MALDI-massespektro (Matrix-Assisted Laser Desorption / ionization)Metriske bilder, jo høyere f u , jo mer omfattende sprer stoffet seg inn i caseum. Derfor er dette enstemmig med hypotesen om at som medikamentmolekyler diffunderer i den ytre kant av caseum fra grensesnittet med cellulære lag av lesjonen, bindes bindingen til kaseøse makromolekyler medikamentet, slik at det ikke lenger diffunderer i caseous-kjerne. Et prøvepanel av 18 anti-tuberkulosemedisiner er oppført i tabell 1 sammen med deres f u i både caseum og surrogatet. Som illustrert i figur 3 , er matrisen fremstilt fra THP-1-avledede skumaktige makrofager en effektiv surrogat til ekte caseum. Binding i begge matriser korrelerer sterkt med hverandre.
Figur 1: Illustrasjon av RØD-analysen. Under inkubasjon blir legemolekyler som forblir ubundet til makromolekyler iMatrisen diffunderer over dialysemembranen. Over tid etableres en likevekt mellom konsentrasjonen av ubundne legemiddelmolekyler i både donor- og mottakerbrønnene. Alle makromolekyler (proteiner, lipider, etc. ) og bundet legemiddelmolekyler er fanget i donorkammeret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Drug penetrasjon in vivo . Forholdet mellom fraksjonen ubundet ( f u ) og diffusjon i caseum in vivo , bestemt ved MALDI (matrixassistert laser desorption / ionisering) massespektrometri-bildebehandling for seks anti-tuberkulose-legemidler. Ion-kartene er av representative lungesår, og signalintensiteten er angitt av skalaen til venstre. H Ematoksylin og Eosin (H & E) -farging av tilstøtende deler er vist under ionekartene. Svart / hvitt konturlinjer markerer caseous-senteret for hver lesjon. Reprinted (tilpasset) med tillatelse fra Sarathy et al . 7 Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Korrelasjon mellom ubundne fraksjoner ( f u ) av 18 anti-tuberkulosemedisiner i caseum og surrogatmatrisen. Den best egnet linjen ble bestemt ved bruk av lineær regresjon. Godhet av passform uttrykkes som R2-verdien. Reprinted (tilpasset) med tillatelse fra Sarathy et al . 7K "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Caseum f u (%) | Surrogat f u (%) | |
| Ethambutol | 35,2 ± 4,4 | 38,8 ± 5,6 |
| isoniazid | > 99,9 | > 99,9 |
| Acetyl-isoniazid | > 99,9 | > 99,9 |
| P- aminosalicylsyre | 54,7 ± 1,4 | 51,1 ± 11,2 |
| rifampicin | 5,13 ± 0,2 | 7,3 ± 0,6 |
| rifapentin | 0,5 ± 0,1 | 1,1 ± 0,1 |
| Moxifloxacin | 13,5 ± 3,7 | 16,8 ± 1,8 |
| Levofloxacin | 8,34 ± 0,4 | 16,3 ± 3,1 |
| gatifloksacin | 16,3 ± 4,2 | 18,8 ± 2,9 |
| linezolid | 29,3 ± 3,6 | 27,9 ± 2,2 |
| Posizolid | 10,7 ± 1,7 | 17,6 ± 4,5 |
| Sutezolid | 30,1 ± 8,7 | 21,7 ± 1,7 |
| Radezolid | 5,2 ± 0,8 | 7,6 ± 1,9 |
| Tedizolid | 8,8 ± 1,8 | 13,7 ± 2,7 |
| clofazimine | <0.01 | <0.01 |
| Bedaquiline | <0.01 | <0.01 |
| PA-824 | 7,31 ± 2,2 | 3,6 ± 0,2 |
| OPC67683 | 0,04 ± 0,02 | 0,02 ± 0,002 |
Tabell 1: Fraksjon ubundet ( f u ) av 18 TB-legemidlene testet i caseum- og surrogatbindingsanalysen. Alle resultater uttrykkes som gjennomsnittlig ± standardavvik. Reprinted (tilpasset) med tillatelse fra Sarathy et al . 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pulmonale nekrotiske lesjoner og hulrom hos tuberkuloseinfiserte pasienter inneholder subpopulasjoner av bakterier som er motstridende for behandling av legemidler. Caseous kjerner av disse strukturer er spesielt ansvarlig for harboring disse persisters i et ekstracellulært miljø. 16 Gunstig fordeling av antibakterielle midler i disse avsidesliggende stedene antas å være en viktig determinant for tuberkulose narkotika effekt. Før valideringen av denne protokollen var det ingen tilgjengelige in vitro- teknikker som kunne forutsi fordelingen av stoffforskjningsforbindelser i caseous lesjoner. Som et resultat var evalueringen av legemiddelfordeling i disse kritiske foci sterkt avhengig av dyreinfeksjonsmodeller, lesjons-sentriske farmakokinetiske studier og MALDI massespektrometri imaging teknikker. 5 , 17
In vitro- analysen beskrev hanRe er en rask og effektiv måte å forutsi dopinginntrengning i tuberkulose lesjoner uten tedium og kostnaden av farmakokinetiske studier in vivo . Protokollen er en modifikasjon av plasmaproteinbindingsanalysen som opprinnelig var den tilsiktede bruken av den RØDE anordningen. Homogenisering av vevsprøver til en pipettbar konsistens gjør det mulig for vevsproteinbinding å måles ved bruk av samme enhet. Denne protokollen kan utføres med caseum hvis den er tilgjengelig fra dyr infeksjonsmodeller. Som illustrert i figur 1 binder legemiddelmolekyler til makromolekyler i caseum / surrogat-homogenat, idet det holdes i donorkammeret, mens de ubundne legemiddelmolekyler er frie til å diffundere over den semipermeable membranen i mottakerkammeret. Den ubundne brøkdel ( f u ) balanserer mellom begge delene i inkubasjonsperioden. Som figur 2 illustrerer, svært høybundne forbindelser ( f u <1%) som er almoSt helt fanget i donorkammeret, er ikke effektivt ved permeating caseum. På den annen side er mindre bindte forbindelser (1% < f u <100%) i stand til å diffundere i caseous kjerne i varierende grad; Jo høyere f u , jo mer gjennomtrengende gjennomsyrer det det nekrotiske området.
Protokollen kan også brukes med en surrogatmatrise avledet fra lipidbelastede THP-1 makrofager som er blitt indusert med oljesyre. Flere betingelser for induksjon av lipidkroppsakkumulering ble testet på THP-1s. Disse inkluderer hypoksi, eksponering for bestrålet M. tuberculosis og eksponering for trehalose 6,6'-dimykolat (TMD) avledet fra mycobakterielle cellevegg. Den endelige oljesyreinkubasjonskonsentrasjonen på 400 μM ble vist å indusere topplipidkroppdannelse uten å kompromittere cellens levedyktighet og adhesjon. 7 Fortynning av oljesyre i forvarmet medium er viktig for å sikre maksimaL oppløsning av fettsyren. Den resulterende surrogatmatrisen har et sammenlignbart kolesterolinnhold til sann caseum, henholdsvis henholdsvis høyere og lavere triglyserid og proteininnhold. 7 Som illustrert i figur 3, binder bindingen av 18 anti-tuberkuloseforbindelser til surrogatmatrisen sterkt sammen med deres binding til kaseum. Den nylige studien som også inkluderte ikke-kommersielle forbindelser med udefinert bakteriedrepende aktivitet, viste at den FM-avledede matrisen er en effektiv surrogat til caseum. 7 Ved å fjerne behovet for dyreinfeksjonsmodeller øker surrogatmatrisen vellykket gjennomgangen av denne analysen samtidig som den gjør den mer kostnadseffektiv.
Denne allsidige protokollen kan også brukes til å teste flere forbindelser samtidig (kassettprøving). Vi har tidligere vist at testing 5 medisinske kombinasjoner, alt ved 5 μM, i hver innsats ved hjelp av denne protokollen kan effektivt rangere sammensetningenS basert på deres bindemiddelbindende bindinger mens du sparer tid og materialer. En sjette kontrollforbindelse som moxifloxacin kan tilsettes til kassetten som en intern kontroll for å sikre konsistens mellom analyser og partier av caseum / surrogat. 7 Det er viktig at protokollen kjøres med så lite som 20 μl av en 10 mM sammensatt bestanddel (<< 1 mg av en forbindelse). Dette er en stor fordel tidlig i stofffunnsprosessen når kjemikere syntetiserer begrensede mengder av hver forbindelse for screeningsformål. RØD enhetsapparat er automatiseringsvennlig; Mikroplatefotavtrykk på basisplaten gjør den kompatibel med automatiserte systemer designet for å håndtere standard 96-brønnplater.
Selv om surrogatmatrisen har vist seg å lykkes med å etterligne bindingsegenskapene til ex vivo- kaseum ( Figur 3 ), bekrefter vi at det kan unøyaktig profilere bestemte forbindelser. THP-1 makrofager er vanligvis brukt i Caseum-surrogatbindingsassayet er et nyttig verktøy i tuberkulose-legemiddelfunn og brukes i flere blyoptimaliseringsprogrammer. Det kan også bidra til å designe mer efFektive kombinasjonsregimer basert på individuelle legers evne til å skille seg inn i de forskjellige lagene av flere lesjontyper. Protokollen kan også tilpasses for å lette oppdagelse av narkotika for andre sykdommer som er preget av dannelse av lesjoner eller abscesser hvor legemiddelinntrengning er begrenset, men kritisk for vellykket behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Johnson & Johnson, TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X og Trius Therapeutics for å gi bedaquiline, henholdsvis PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid og tedizolid. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li og Danielle Weiner ga støtte med MALDI-analyse, bioanalytiske metoder, forberedelse av caseum surrogat, kjemisk syntese og isolering av kanin caseum. Dette arbeidet ble utført med finansiering fra Bill og Melinda Gates Foundation, pris # OPP1044966 og OPP1024050 til V. Dartois, NIH Felles Instrumentation Grant S10OD018072, samt felles finansiering fra Bill og Melinda Gates Foundation og Wellcome Trust for A Center of Excellence For blyoptimalisering for sykdommer i utviklingsverdenen til P. Wyatt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| New Zealand White Rabbits | Covance | - | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| THP-1 monocytic cell line | ATCC | ATCC TIB-202 | |
| 175 cm² TC-Treated Flask (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
| RPMI 1640 media w/o glutamine | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
| Hyclone L-glutamine, 200 mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Oleic acid | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
| Pierce RED Device Reusable Base Plate | Fisher Scientific | PI-89811 | |
| Pierce RED Device Inserts, 50/box | Fisher Scientific | PI-89809 | |
| Pierce RED insert removal tool | Fisher Scientific | 89812 | |
| Adhesive plate seal | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco) | Life Technologies | 10010-049 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | |
| Acetonitrile | Sigma | 34998 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma | V4629 | |
| Diclofenac sodium salt | Sigma | 93484 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| 2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
| Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
| 484R Cobalt 60 Irradiator | JL Shepard | 7810-484-1 | |
| INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
| Upright Light Microscope | Leica | DM1000 | |
| Binary Liquid Chromatography system | Agilent | 1260 | Multi-compenent |
| Mass spectrometer | AB Sciex | 4000 |
References
- Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).
- Zhang, Y. Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).
- Aber, V. R., Nunn, A. J. Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy. Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).
- Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).
- Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells. Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
- Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
- Sarathy, J. P., et al. Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions. ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).
- Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding. J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).
- Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma. J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).
- Liu, X., et al. Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid. Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).
- Able, S. L., et al. Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat. Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).
- Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).
- Via, L. E., et al. Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates. Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).
- Kalvass, J. C., Maurer, T. S. Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery. Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).
- Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis. J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).
- Lenaerts, A. J., et al. Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910. Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).
- Prideaux, B., et al. High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions. Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).
