Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

הכנת שלפוחית ​​הממברנה פלסמה מן העצם Mesenchymal תאי גזע עבור פוטנציאל החלפת ציטופלזמה

Published: May 18, 2017 doi: 10.3791/55741
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Multidisciplinary Research Center, Shantou University

Summary

מחלות הקשורות לגיל קשורות למספר פגמים במרכיבי הציטופלזמה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת שלפוחית ​​הממברנה פלזמה מתאי גזע העצם mesenchymal. טכניקה זו יכולה לשמש כאמצעי טיפולי החלפת ציטופלסמה כדי לשפר או אפילו הפנוטיפים הקשורים לגיל הקשורים.

Abstract

יש לנו בעבר דיווחו על הדור של שלפוחית ​​הממברנה פלזמה (PMVs) באמצעות שחול מכני של תאים יונקים. היתוך של PMVs עם תאים Rho0 לקוי המיטוכונדריה משוחזרת פעילות מיטוטית בתנאים התרבות הרגילה. טרשת עורקים, סוכרת מסוג 2, מחלת האלצהיימר וסרטן הן מחלות הקשורות לגיל, אשר דווחו כי הן קשורות למספר פגמים מכניים ופונקציונליים בציטוזול ובאברונים של מגוון סוגי תאים. תאי גזע מוחיים mesenchymal (BMSCs) מייצגים אוכלוסיית תאים ייחודית ממח העצם, בעלת יכולות התחדשות עצמית, תוך שמירה על ריבוי המרכיבים שלהם. התוספת של תאים ההזדקנות עם cytoplasm צעירים מ BMSCs אוטולוגיים באמצעות היתוך של PMVs מספק גישה מבטיחה כדי לשפר או אפילו הפנוטיפים הקשורים לגיל הקשורים. פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין PMVs מ BMSCs באמצעות שחול באמצעות קרום פוליקרבונט עם 31, נקבוביות, לקבוע את קיומה של המיטוכונדריה ולבחון את תחזוקת הפוטנציאל הממברנה בתוך PMVs באמצעות מיקרוסקופ confocal, להתרכז PMVs על ידי צנטריפוגה, ולבצע את הזרקת vivo של PMVs לשריר gastrocnemius של עכברים.

Introduction

כמות עצומה של מאמץ הוקדשה להקמת גישות לטיפול בגנים, באנזים ובתאי החלפת תאים. זה הביא פריצות דרך גדולות ואפילו יישומים קליניים 1 , 2 , 3 . לאחרונה, טיפול מחליף מיטוכונדריה שנוי במחלוקת המבוסס על טכנולוגיית העברת גרעין הוחל על הפריה חוץ גופית עבור נשים בגיל מבוגר או נושא מוטציה דנ"א מיטוכונדריאלית קטלנית 4 . פגמים שנמצאו במחלות הקשורות לגיל, כולל טרשת עורקים, סוכרת מסוג 2, מחלת האלצהיימר וסרטן, הם לרוב רב פנים. זה כבר מתועד כי הצטברות של טיפות השומנים; את התצהיר של חלבון עמילואיד; שימור חלבונים שהתגלגלו בתוך הרשת האנדופלסמית; ו פרוטאזום פגום, autophagosome, ו המיטוכונדריה לתרום להתפתחות או להחמרה של מחלות אלה"Xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . כיום, אין מנגנון זמין שמטרתו תיקון ישיר של תקלה ב cytosol ו organelles, אשר גורם ההזדקנות ו פנוטיפים ההזדקנות.

יש לנו בעבר דיווחו על הדור של שלפוחית ​​הממברנה פלזמה (PMVs) באמצעות שחול מכני של תאים יונקים 12 . למעט הגרעין, נמצאו המרכיבים בממברנה או בציטוסול, כולל חלבונים ורנ"א, כמו גם את האברונים, כמו המיטוכונדריה, ב- PMV. בעיקרו של דבר, PMV יכול להיחשב לתא אנקלאציה מיניאטורי. חשוב יותר, היתוך של PMVs עם תאים Rho0 לקוי המיטוכונדריה משוחזרת פעילות מיטוטית בתנאים התרבות הרגילה. זהו הדו"ח הראשון על establiShing גישה יעילה פוטנציאלית לטיפול החלפת ציטופלסמה.

תאי גזע מוחיים mesenchymal העצם (BMSCs) הם תאים אב multipotent כי הם נוצרים באופן שגרתי ממח העצם והם מורחבים בקלות בתרבות. תאים עובריים של תאי גזע Oct4, Nanog ו- SOX2 התגלו ברמות נמוכות ב- MSC 13 . פעילות הטלומראז ניתנת למדידה. בנוסף, היעדרם של מולקולות מעוררות-גומלין ומולקולות מחלקה II של לויקוציטים אנושיים (HLA), כמו גם ביטוי נמוך של HLA Class I ב- MSC, הופכים אותם לתאים אידיאליים לשימוש באלוגני או "מדף" רפואה משובי ויישומים אימונומודולטוריים 14 .

כאן, אנו מתארים כיצד להכין PMVs מ BMSCs העכבר באמצעות שחול באמצעות קרום פוליקרבונט עם 3 מיקרוגרם הנקבוביות, לקבוע את קיומו של המיטוכונדריה ולבחון את תחזוקת הפוטנציאל הממברנה ב PMVs באמצעות קונפוקאל מיקרוסקופיה, להכין מרוכזים אך לא מצטברים PMVs על ידי צנטריפוגה, ולבצע את הזרקת vivo של PMVs לשריר gastrocnemius של עכברים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

8 עד 12 שבועות BALB / c עכברים נרכשו מ שנחאי ניסיוני בעלי חיים מרכז (שנחאי, סין) וגדל ב פתוגן ללא מתקן ממוזג ללא תשלום. טיפול בבעלי חיים ונהלים ניסיוניים היו בקנה אחד עם הנחיות לשימוש וטיפול של חיות מעבדה שהוקמה על ידי אוניברסיטת שאנטו.

1. הרכבה של המנגנון

  1. כדי להבטיח סטריליות, להדליק את האור UV של ברדס תרבות רקמה במשך 30 דקות לפני השימוש.
  2. לפרק יחידת 25 מ"מ מסנן חד פעמיות להטביע את הכובע ואת החלק התחתון של היחידה לתוך כוס זכוכית 200 מ"ל מלא באתנול 75% במשך 30 דקות. היחידה מורכבת מפוליפרופילן רפואי.
  3. להרים את הכובע ואת החלק התחתון של המכשיר באמצעות מלקחיים, לנער את האתנול הנותר ביד, ולאפשר את החלקים לאוויר יבש במשך 10 דקות במכסה המנוע.
  4. רטוב 19 מ"מ קוטר פוליקרבונט ב PBS ומניחים אותו בזהירות על גבי המטריצה ​​התומכת של בוטומ 'של היחידה. הסרט פולימר יש משטח חלק, שטוח לעקוב חרוט 3 נקבוביות מיקרומטר.
  5. הרכב מחדש את היחידה על ידי הברגה של הכובע בחוזקה על הקרקעית. ודא כי הממברנה אינה משוחררת מהמרכז.
  6. הסר את המחט של מזרק 1 מ"ל אינסולין לצייר 1 מ"ל של PBS. צרף את המזרק ליחידת המסנן ולאחר מכן לדחוף PBS דרך היחידה כדי להרטיב את הרכבה כדי לבדוק אם יש דליפה כלשהי.

2. הדור של שלפוחית ​​קרום פלזמה (PMVs)

  1. להקים תרבות BMSC, כפי שדווח על ידי Nemeth et al. 15 , במדיום התרבות DMEM המכיל 15% FBS ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין. לטפח את התאים בצלחת 6-היטב חממה humidified המכיל 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. כדי להפיץ את התאים, להסיר את המדיום תרבות לשטוף היטב עם 0.5 מ"ל של סידן ללא PBS.
  3. הוסף 0.5 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA ו דגירה התאים על 37 מעלות צלזיוסבמשך 3 דקות. הקש על צלחת על כף היד כמה פעמים כדי להקל על ניתוק התא. עצור עיכול על ידי הוספת 1 מ"ל של המדיום תרבות.
  4. איסוף התאים צינור חרוטי 15 מ"ל ספין ב XG 200 דקות 2 בצנטריפוגה הדף הספסל. Resuspend התאים 4 מ"ל של המדיום תרבות aliquot התאים לתוך שתי בארות של צלחת 6-היטב.
    הערה: תאים מגיעים בדרך כלל ל -24 שעות.
  5. כדי לייצר PMVs, קציר התאים מבאר אחד (כ 5 x 10 5 תאים) של צלחת 6-היטב על ידי עיכול טריפסין monodisperse התאים 0.5 מ"ל של המדיום תרבות.
  6. טען את התאים לתוך מזרק האינסולין, לצרף אותו יחידת מסנן, ולדחוף את הבוכנה במהירות כדי לסחוט את התאים דרך המסנן. מחק את המדיום extruded כי צריך להיות רק כמה PMVs בתוכו.
  7. טען 0.5 מ"ל נוספת של המדיום לתוך המזרק במהירות לדחוף אותו דרך המסנן. אסף את המדיום של שחול השני, אשר מכיליםS PMVs בגודל שונה.
  8. טען 150 μL של המדיום שנאסף לתוך צלחת זכוכית בתחתית 35 מ"מ ולאפשר PMVs להתיישב לתחתית במשך כ 10 דקות. לבחון את PMVs תחת מיקרוסקופ בניגוד שלב הפוכה מצויד במצלמת CCD באמצעות עדשה אובייקטיבית 20X.

3. בחינת התוכן בתוך PMVs באמצעות מיקרוסקופיה Confocal

  1. כדי לבצע transfection ב BMSCs, לדלל 2 מיקרוגרם של DNA פלסמיד supercoiled ו 6 μL של מגיב transfection קטיוני ( למשל, PolyJet) ב 50 μL של DMEM חינם בסרום. מערבולת לערבב היטב ספין בקצרה לאסוף את כל הנוזל מן הצדדים של הצינור.
  2. מוסיפים את הפתרון מדולל (מ שלב 3.1) dropwise לתוך פתרון DNA מדולל, מערבולת חזקה במשך 1 דקות, ספין בקצרה, ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  3. החלף את המדיום הישן על BMSCs, אשר כבר seeded על 30% מפגש לילה, עם 2 מ"ל של מדיום תרבות טרי להוסיף DNתערובת transfection dropwise.
  4. החלף עם 2 מ"ל של מדיום טרי לאחר 12 שעות של transfection.
  5. כדי לעקוב אחר cytoplasmically חלבונים מקומיים, transfect התאים עם פלסמיד המכיל קלטת ביטוי EGFP (pEGFP-N1), כמתואר לעיל. קציר התאים על ידי עיכול טריפסין 48 שעות לאחר transfection עבור הדור PMV, כמתואר לעיל.
  6. כדי לעקוב אחר המיטוכונדריה, כתם התאים עם צבע המיטוכונדריה (1 מיקרומטר, MitoTracker) במדיום תרבות טרי במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  7. כדי לזהות את הפוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה, כתם את התאים עם צבע cyanine JC-1 (5,5 ', 6,6'-tetrachloro-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine יודיד) (10 מיקרוגרם / מ"ל) במדיום תרבות טרי 30 דקות ב 37 ° C.
    1. לשטוף את התאים עם 0.5 מ"ל של PBS שלוש פעמים ולאחר מכן למסוק את התאים על ידי עיכול טריפסין עבור הדור PMV, כמתואר לעיל.
    2. טען 150 μL של התרופות שנאספוIum לתוך צלחת זכוכית בתחתית 35 מ"מ ולאפשר PMVs להתיישב לתחתית במשך כ 10 דקות. לבחון את PMVs תחת מיקרוסקופ confocal באמצעות העדשה 100X שמן אובייקטיבי.
  8. כדי לזהות EGFP או צבע המיטוכונדריה, להפעיל את הלייזר 488 ננומטר ולאסוף את האות ב 505-530 ננומטר. כדי לזהות JC-1, להפעיל את 488 ננומטר ו 543 ננומטר לייזרים ולאסוף אותות ב 505-530 ננומטר 560-615 ננומטר. הגדר את ערך החור ל -1.4.

4. הכנת PMVs מרוכזים על ידי צנטריפוגה

  1. קציר התאים על ידי עיכול trypsin וליצור PMVs, כמתואר לעיל, ב 0.5 מ"ל של המדיום תרבות.
  2. ספין PMVs ב 1200 xg בצנטריפוגה benchtop במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend גלולה μL 100 של המדיום תרבות עם סחרור עדין.
  3. טען 50 μL של PMVs לתוך צלחת זכוכית בתחתית 35 מ"מ ולאפשר להם להתיישב בטמפרטורת החדר למשך כ 10 דקות. בחן את PMVsתחת מיקרוסקופ confocal באמצעות העדשה 40X שמן אובייקטיבי.
  4. מוסיפים את הסדרה של polyethylenimine מדולל (PEI) פתרון לתרבות BMSC עבור 1 שעות ולבדוק סימנים של cytotoxicity.
    הערה: כאן, PEI ב 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​נבחר מאז שום סימן של רעילות זוהה BMSCs.
  5. קציר התאים על ידי עיכול trypsin ולהוסיף PEI ב 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​במשך 1 שעות לחייב את קרום התא כאמצעי למניעת צבירה. ליצור PMVs, כמתואר לעיל, ב 0.5 מ"ל של המדיום תרבות. לרכז את PMVs ולבחון אותם תחת מיקרוסקופ confocal, כמתואר לעיל.

5. הזרקה של PMVs לתוך שריר Gastrocnemius

  1. כדי הכתם את הממברנה, להוסיף CM-DII (chloromethyl dialkyl-indocarbocyanine) (10 מיקרומטר) צבע 1 מ"ל של מדיום תרבות טרי BMSCs למשך 30 דקות.
  2. קציר התאים (על 5 x 10 5 ) על ידי עיכול טריפסין resuspend אותם 0.5 מ"ל של המדיום תרבות. הוסף PEI (2 מיקרוגרם / מ"ל) עבור 1ח. ליצור ולרכז את PMVs μL 100 של המדיום תרבות, כמתואר לעיל.
  3. להרדים עכבר BALB / C על ידי הזרקת סודיום barbital (10 מ"ג / ק"ג) לאחר 12 שעות של צום.
  4. נקה את החלק החיצוני של שריר gastrocnemius עם 75% אתנול. לאט לאט להזריק את PMVs (100 μL) לשריר gastrocnemius באמצעות מזרק 30 G אינסולין.
  5. לאחר מתן ההרדמה, במקום גזה רטוב על העיניים למשך הניסוי ולחמם את העכבר עם אור ליבון עד שהוא מתעורר. בית העכבר לבד בכלוב אוורור הפרט.
  6. כדי לקצור את שריר gastrocnemius 12 שעות לאחר הניתוח, להרוג את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם.
  7. מפזרים 75% אתנול על שריר gastrocnemius, לפתוח את העור עם מספריים, לחתוך את שריר gastrocnemius כולו בשני הקצוות.
  8. שוטפים את השריר עם PBS ולבחון אותו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות העדשה 20X אובייקטיבי.
  9. לחתוך את השריר עםסכין גילוח חד להסיר את החלקים ללא פלואורסצנטי. חותכים את החלקים עם פלואורסצנטי אדום חזק לתוך כ 9 מ"מ 3 קוביות.
  10. שבץ כל קובייה במדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלי (אוקטובר), לטבול אותו חנקן נוזלי במשך 5 דקות, ולאחסן אותו במקפיא -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  11. חותכים את החלקים הקפואים לחתיכות 20 מיקרומטר עבה באמצעות cryostat ו לדבוק כל קטע לשקופית זכוכית. שוטפים את החלק פעם עם PBS.
  12. צייר מעגל סביב הקטע עם עט מעגל הכתם ולהוסיף 100 μL של DAPI (1 מיקרוגרם / מ"ל). לשאוב את הפתרון DAPI לאחר 10 דקות הדגירה בטמפרטורת החדר בחושך לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
  13. זרוק הרכבה שמן על הדגימה, לכסות אותו עם להחליק זכוכית, ואת החותם את השקופית עם לק. לבחון את הקטע תחת מיקרוסקופ confocal באמצעות העדשה 100X שמן אובייקטיבי.
  14. כדי לזהות CM-DiI, להפעיל את הלייזר 543 ננומטר ולאסוף את האות ב 560-615 ננומטר. כדי לזהות DAPI, הפעל את ה- 405Nm לייזר ולאסוף את האות ב 420-480 ננומטר. הגדר את ערך החור על כ 1.4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המפתח ההכנה המוצלחת של PMVs תלוי במידה רבה על הרכבה נכונה של יחידת המסנן ( איור 1 ), אשר ניתן לבדוק על ידי דחיפת 1 מ"ל של PBS דרך הממברנה. אם מתרחשת דליפה, חבר מחדש את יחידת המסנן ובדוק שוב. עם זאת, דליפה ניתן רק לבדוק באופן מהימן כאשר תאים נדחפים דרך הממברנה. אם רק כמה PMVs מזוהים תחת מיקרוסקופ רגיל באמצעות המטרה 10X, או אם גודל של PMVs הוא בעיקר סביב 1 מיקרומטר, זה יעיד כי רוב התאים נלכדים בתוך היחידה בשל הרכבה שגוי. PMVs עם גודל בטווח של כ 3 מיקרומטר בקוטר היו דומיננטי כאשר נבדק תחת מיקרוסקופ בניגוד שלב באמצעות המטרה 20X ( איור 2 ). מאז PMVs בגודל של ננומטר לא דמיינו בקלות, אחוז גדול PMVs במונחים של מספר היה נמוך. זה נמצא כדי להיות מועיל ללחוץ על מזרק במהירות כדי reDuce כמות של פסולת ממברנה, אשר כנראה נכשל טופס PMVs כדורית. יתר על כן, PMVs של גדלים קטנים יותר (פחות מ 1 מיקרומטר) נמצאו המדיום שחול הראשון, עם PMVs גדול התאושש שחול השני.

ההיבט הייחודי ביותר של PMVs היה סגירת המרכיבים הסלולר מלבד הגרעין 12 . BMSCs היו transfected עם ביטוי קלטת של EGFP במשך 48 שעות לפני בשימוש להכנת PMV. התוצאות מראות כי חלבון EGFP מקומי cytoplasmically ניתן לתמצת ב PMVs ( איור 3 א ). המתחם של המיטוכונדריה היה עדות על ידי מכתים של צבע המיטוכונדריה, מראה כי חלק גדול של, אבל לא כל, PMVs מכילים נקודות פלואורסצנט ירוק, המעיד על המיטוכונדריה ( איור 3 ). חלק PMVs, גם אלה עם קוטר גדול כמו 3 מיקרומטר, לא הראו עדויות של מיטוכונדריה המכיל, מציעב אילוצים מכניים מסוימים עשויים למנוע את אנקפסולציה של המיטוכונדריה לתוך PMVs. פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה זוהה על ידי מכתים JC-1, אשר פולט הקרינה האדומה כאשר המיטוכונדריה יש פוטנציאל נורמלי. התוצאה מראה כי פלואורסצנטי אדום אכן זוהה PMVs ( איור 3 ), בעוד הקרינה הירוקה לא היה לגילוי (נתונים לא מוצג), מה שמרמז כי המיטוכונדריה בתוך PMVs היו פונקציונליים.

תהליך ריכוז עבור PMVs יש צורך, במיוחד עבור היישום vivo כדי להקטין את נפח כמו גם כדי להסיר את הרכיבים הסלולר שפורסמו במהלך שחול. לאחר צנטריפוגה ב 1200 xg במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, מעט מאוד PMVs של גודל קטן יותר נמצאו supernatant. כדי להקל על resuspension של גלולה, צינור 2-מ"ל עגול התחתונה שימש צנטריפוגה. עם זאת, רוב PMVs היו מצטברים גלולה, במיוחד PMVs של גדלים קטנים יותר ( איור 4 ). זה כנראה בגלל מולקולות הדבקה על הממברנה. לפיכך, המדיום הושלם ב- PEI (2 מיקרוגרם / מ"ל), אשר ריכוזו הותאם ללא ציטוטוקסיות ניכרת. החיוב החיובי של PEI המצורפת קרום התא מנע את הצבירה של PMVs במהלך צנטריפוגה ( איור 4 ).

לבסוף, את קרום BMSCs היו שכותרתו עם צבע CM-DiI לפני הכנת PMVs ( איור 5 ). לאחר ריכוז, PMVs הוזרקו לתוך השרירים gastrocnemius של עכברים, אשר נקצרו 12 שעות לאחר הניתוח נבדק תחת מיקרוסקופ confocal. קטעים קפואים של שריר הגסטרוקנמיום נבדקו לנוכחות של הקרינה האדומה, אשר זוהה בתוך myofiber ( איור 5 ), הוכחת כי PMVs נמסרו הציטופלזמה, כנראה באמצעות אנדוציטוזה. שימו לב, פלואורס אדום Cence נמצא סביב הפריפריה של myofiber (נתונים לא מוצגים), המציין כי חלק גדול של PMVs היו גם לא endocytosed או היו רק בתחילת endocytosis ב 12 שעות לאחר ההזרקה.

איור 1
איור 1: הרכבה של יחידת המסנן. ( א ) זמינים פוליקרבונט קרום מסחרית. ( ב ) עקוב אחר הנקבוביות של 3 מיקרומטר בקוטר, שנצפו תחת מיקרוסקופ אופטי עם מטרה 20X. סולם בר = 50 מיקרומטר. ( ג ) הממברנה הונחה על גבי המטריצה ​​התומכת של יחידת סינון חד פעמי. ( ד ) יחידת הסינון המורכבת עם קרום בפנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

עמוד = "1"> איור 2
איור 2: הדור של PMVs מ BMSCs. ( A ) BMSCs מן העכברים היו מעובדים בצלחת 6-היטב. ( B ) BMSCs (5 x 10 5 ) נקצרו על ידי עיכול טריפסין ו monodispersed μL 500 של המדיום תרבות. תמונות של BMSCs המצורפת resuspended נלקחו תחת מיקרוסקופ אופטי עם מטרה 20X. ( ג ) תאים הועמסו לתוך מזרק אינסולין לפני חיבורו ליחידת המסנן. ( D ) PMVs שנוצר מ BMSCs נטענו לתוך צלחת זכוכית התחתונה 35 מ"מ נבדק תחת מיקרוסקופ בניגוד שלב הפוך באמצעות עדשה אובייקטיבית 20X. סולם ברים = 40 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Les / ftp_upload / 55741 / 55741fig3.jpg "/>
איור 3: זיהוי של תוכן PMV ידי מיקרוסקופיה confocal. PMVs נוצרו מ ( A ) BMSCs transfected עם pEGFP-N1 במשך 48 שעות כדי לעקוב אחר חלבון EGFP מקומי cytoplasmically, ( B ) BMSCs מוכתמים צבע המיטוכונדריה (1 מיקרומטר) במשך 30 דקות כדי לעקוב אחר קיומה של המיטוכונדריה, או ( ג ) BMSCs מכתים עם JC-1 (10 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 30 דקות כדי לאשר את פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה. PMVs שנוצר מ BMSCs הועמסו על צלחת זכוכית בתחתית 35 מ"מ נבדק על ידי מיקרוסקופ confocal באמצעות עדשה אובייקטיבית 100X שמן. סולם ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: ריכוז PMV S על ידי צנטריפוגה. BMSCs (5 x 10 5 ) נקצרו על ידי עיכול טריפסין resuspended ב 0.5 מ"ל של המדיום תרבות, אשר נוספה עם או בלי 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​של PEI. PMVs שנוצר נוצרו ב 1,200 גרם במשך 5 דקות, resuspended ב 100 μL של המדיום תרבות, נבדק תחת מיקרוסקופ confocal עם מטרה שמן 40X. ( א ) סכמטי של צבירה PMV כנראה נגרמת על ידי אינטראקציה של מולקולות הדבקה לאחר צנטריפוגה. ( ב ) סכמטי של PMVs שמירה על monodispersion לאחר מחויב PEI. ( ג ) ממוצבים PMVs לאחר צנטריפוגה. ( D ) PMVs להראות פחות צבירה לאחר צנטריפוגה בשל חיוב חיובי עם PEI. סולם ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Gure 5 "src =" / files / ftp_upload / 55741 / 55741fig5.jpg "/>
איור 5: משלוח של CM-DiI שכותרתו PMVs לשריר gastrocnemius. PMVs נוצרו 5 x 10 5 BMSCs, מרוכז על ידי צנטריפוגה לתוך נפח של 100 μL, והזריק לאט לשריר gastrocnemius של עכבר BALB / C. ( א ) סכמטי של הזרקת PMV. ( B ) BMSCs שכותרתו עם CM-DII; סולם בר = 20 מיקרומטר. ( ג ) PMVs שנוצר מ CM-DiI שכותרתו BMSCs ונבחן על ידי מיקרוסקופיה confocal; סולם בר = 10 מיקרומטר. ( ד ) שריר Gastrocnemius שנקטפו 12 שעות לאחר הניתוח; סולם בר = 20 מיקרומטר. ( E - H ) סעיף קפוא של שריר gastrocnemius נבדק על ידי מיקרוסקופיה confocal; סולם בר = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי קרן לי שאנג שינג, פרויקט גואנגדונג ברמה גבוהה אוניברסיטת "ירוק טכנולוגיות לתעשיות ימית", הקרן למדעי הטבע של סין (http://www.nsfc.gov.cn/ מענק מס '30971665, 81172894, 81370925), ואת מחלקת החינוך של גואנגדונג (http://www.gdhed.edu.cn/ מענק No.cxzd1123).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IsoporeTM membranes Millipore TSTP04700 3 mm pore
Disposable filter unit Xinya, Shanghai, China 25 mm Medical grade polypropylene
Insulin syringe BD 328446 1 mL
pN1-EGFP Clontech  6085-1
MitoTracker Molecular Probes M7514 Green FM, 1 μM
JC-1 Beyotime, Haimen, China C2006 10 mg/mL
CM-DiI Beyotime, Haimen, China C1036 10 mM
PEI Sigma P3143 Mn = 75,000
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse TE 2000 With CCD camera
Confocol Microscope Carl Zeiss LSM 510 Meta
PolyJet SigaGen SL100688 For cell transfection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein. J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).
  2. Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs. Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).
  3. Torchilin, V. P. Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).
  4. Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine. Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).
  5. López-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  6. Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis. Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).
  7. Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus. N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).
  8. Jagust, W. Is amyloid-β harmful to the brain? Insights from human imaging studies. Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).
  9. Naidoo, N. The endoplasmic reticulum stress response and aging. Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).
  10. Cuervo, A. M. Autophagy and aging: keeping that old broom working. Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).
  11. Bratic, A., Larsson, N. G. The role of mitochondria in aging. J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).
  12. Lin, H. P., et al. Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria. Biomed Microdevices. 18 (3), 41 (2016).
  13. Riekstina, U., et al. Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis. Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).
  14. Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells. Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).
  15. Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells. Curr Protoc Immunol. 102, Unit 22F.12 (2013).
  16. Shahabipour, F., et al. Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery. J Cell Physiol. , [Epub ahead of print (2017).
  17. Lamichhane, T. N., et al. Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).
  18. Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).
  19. Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
  20. Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).
  21. Pandey, A. P., Sawant, K. K. Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 123 שלפוחית ​​קרום פלסמה מיטוכונדריה החלפת ציטופלסמה תאי שחול תאי גזע של מוח עצם מחלות הקשורות לגיל התחדשות
הכנת שלפוחית ​​הממברנה פלסמה מן העצם Mesenchymal תאי גזע עבור פוטנציאל החלפת ציטופלזמה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, L. q., Lin, M. j., Li, Y. p.,… More

Xu, L. q., Lin, M. j., Li, Y. p., Li, S., Chen, S. j., Wei, C. j. Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy. J. Vis. Exp. (123), e55741, doi:10.3791/55741 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter