Summary
Цель этого протокола состоит в том, чтобы наметить сбор и обработку человеческих хирургических образцов для нескольких нисходящих приложений в вестибулярной шванноме и исследованиях клеток Шванна.
Abstract
Вестибулярные шванномы являются наиболее распространенными новообразованиями угла мозжечка, составляя 6-8% всех интракраниальных ростков. Хотя эти опухоли вызывают сенсорную потерю слуха у 95% пациентов, молекулярные механизмы, лежащие в основе этой потери слуха, остаются неуловимыми. В этой статье описываются этапы, установленные в нашей лаборатории для облегчения сбора и обработки различных первичных образцов тканей человека для последующих исследований, интегральных для изучения вестибулярных шванномов. В частности, эта работа описывает унифицированную методологическую основу для сбора, обработки и культивирования клеток Шванна и шванномы из хирургических образцов. Это интегрировано с параллельными этапами обработки, которые сейчас считаются необходимыми для текущих исследований: сбор опухолей и нервных секретов, сохранение РНК и экстракция белка из собранных тканей, фиксация ткани для подготовки секций,D воздействие первичных клеток человека на адено-ассоциированные вирусы для применения в генной терапии. Кроме того, в этой работе подчеркивается трансбрабиринтный хирургический подход, чтобы собрать эту опухоль как уникальную возможность получить сенсорный эпителий человека из внутреннего уха и перилимфа. Предусмотрены советы по улучшению качества эксперимента и выделены общие проблемы.
Introduction
Vestibular schwannomas (VS) являются наиболее распространенными новообразованиями угла мозжечка, диагностированными в 1 из каждых 100 000 особей. Хотя они и не являются метастатическими, эти опухоли серьезно влияют на качество жизни пациента 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Пострадавшие люди обычно живут с потерей слуха, тиннитусом и чувством слуховой полноты. Симптомы становятся все более истощающими, когда опухоль растет, вызывая проблемы с балансом, лицевой паралич и ухудшение функций других черепных нервов. Также могут возникнуть опасные для жизни осложнения, связанные с компрессией мозга.
Варианты управления для ВС в основном ограничены внимательным ожиданием статических опухолей и стереотаксической лучевой терапии или хирургической резекцией для роста опухолей Поскольку VS возникают из периферического сенсорного нерва ( т. Е. Вестибулярного нерва), важно сравнить VS-ассоциированные наблюдения с данными, полученными из соответствующего контрольного нерва, например, у человека с большим аурикулярным нервом (GAN). Здоровые ГАН регулярно жертвуют при паротидэктомии или диссекции шеи и могут использоваться в качестве надежных моделей для здоровой физиологии клеток Шванна 9 . Поскольку нет лекарств, одобренных FDA для лечения или профилактики спорадических ВС, крайне важно, чтобы исследователи выяснили основные молекулярные мехиЧтобы определить терапевтические цели. Белки, которые, как было показано, играют роль в патогенезе VS, включают в себя мерлин, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), циклооксигеназу 2 (COX-2), ядерный фактор каппа B (NF-κB), фактор некроза опухолей альфа (TNF-альфа) , Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) и связанные сигнальные молекулы 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Недавние достижения расширили и улучшили протоколы сбора, обработки, культивирования и последующего исследования первичных вестибулярных шванномов человека и здоровых нервных тканей 18 , 19 . Однако большинство существующих протоколов предназначены для( Например, только клеточная культура). В этой статье представлена унифицированная методологическая основа для одновременной обработки одного первичного человеческого VS или образца GAN для нескольких последующих приложений: клеточная специфическая культура, экстракция белка, сохранение РНК, сбор опухолевых секретов и фиксация тканей. В этой работе также подробно описывается хирургический сбор и обработка спинномозговой жидкости человека (CSF) и перилимф во время трансабиринтной VS-резекции, поскольку эти тесно связанные ткани могут служить важными источниками биомаркеров для VS. Наконец, этот протокол представляет собой шаги для вирусной трансдукции первичных человеческих VS-клеток в культуре в качестве нового применения этой ткани для использования в генной терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Письменное информированное согласие на сбор всех образцов было получено до операции, и эксперименты проводились в соответствии с Кодексом этики Всемирной медицинской ассоциации (Хельсинская декларация). Все разделы протокола исследования были одобрены Управлением по надзору за исследованиями Массачусетской больницы для глаз и ушей и Массачусетса.
ПРИМЕЧАНИЕ. Разделы 1-7, приведенные ниже, предназначены для последовательного выполнения после получения первичного образца VS или GAN человека из операционной. Обработка всегда должна начинаться с раздела 1. Затем, как правило, сначала необходимо сохранить РНК (раздел 2), а затем подготовить ткань для сбора секретов (раздел 3) и экстракции белка (раздел 4). Ткани, подлежащие культивированию (раздел 5 для VS, раздел 6 для GAN), могут находиться в добавленной культуральной среде, тогда как секции 2, 3 и 4 выполняются. Фиксация ткани для секционирования (раздел 7) очень короткая и cВыполняются на любой стадии центрифугирования. Раздел 8 (обработка перилимфа) и раздел 9 (обработка CSF) может быть осуществлен после приема perilymph или CSF из операционной во время трансабиринтной VS-резекции. Раздел 10 (вирусная трансдукция) может быть проведен при выращивании клеток VS или Schwann в культуре.
1. Подготовка и получение хирургического образца
ПРИМЕЧАНИЕ. Следующие шаги должны выполняться в стерильной среде, такой как капюшон для тканевой культуры или ламинарный вытяжной шкаф. Ожидается знакомство с базовой стерильной техникой.
- Получение среды для первичной человеческой клеточной культуры человека или Шванна
- Оттепель 50 мл аликвоты замороженной эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) в 37 ° C водяной бане.
- Добавьте 5 мл смеси пенициллин / стрептомицин в 500 мл флакон DMEM / F-12, в результате чего окончательное разведение составляет 1: 100.
- Добавьте 50 мл талой FBS в 500 мл флакон DMEM / F-12,Что приводит к окончательному разведению 1:10.
- Напишите дату, инициалы исследователя и дополнительную информацию ( например, 1% P / S, 10% FBS) на бутылке.
- Поместите новую культуральную среду в холодильник (4 ° C).
- Получение и очистка образца VS или GAN
- В операционной комнате поместите только что собранный образец VS или GAN в стерильный солевой раствор в контейнер для образцов. Транспортируйте образец на льду из операционной в ламинарный вытяжной шкаф в лаборатории.
ПРИМЕЧАНИЕ. Размеры и вес образцов значительно варьируются между пациентами в зависимости от размера соответствующей опухоли или количества вырезанного нерва. - Удалите из морозильника аликвоты щелочных растворов гиалуронидазы (25 000 Ед / мл) и коллагеназы (3200 Ед / мл) и заморозите ферменты при комнатной температуре (требуется для этапа 5.1.4 или 6.1.6 в зависимости от того, является ли образец VS или GAN).
ПРИМЕЧАНИЕ. Ресуспендирование лиофилизированных ферментов iПодробно описанные в информационных листах продуктов. Коллагеназу можно ресуспендировать в любом сбалансированном солевом растворе без кальция и гиалуронидазе в растворе 0,02 М фосфатного буфера (рН 7,0), 77 мМ NaCl и 0,01% 1 мг / мл бычьего сывороточного альбумина. Специфическая активность для каждого лиофилизированного фермента зависит от партии и должна быть проверена до ресуспендирования. - Используя серию из трех пробирки объемом 1,5 мл, заполненных 1,4 мл 1x стерильного PBS, три раза промывайте образец VS или GAN. Осторожно передайте образец из трубки в трубку с помощью стерильных щипцов. Закройте каждую трубку, когда она содержит образец, и осторожно встряхните, чтобы вымыть.
ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы избежать наводнения 1,5-мл пробирки, менее 1,4 мл PBS можно использовать на пробирку, если опухолевая часть является большой. - Поместите образец в сухую 60-миллиметровую чашку Петри и используйте щипцы для удаления всех мертвых тканей ( например, прижигаемых участков, которые обычно белые или непрозрачные по цвету) и области с видными кровеносными сосудами.
- Используйте fOrceps или скальпелевое лезвие для разделения образца на отдельные куски для сохранения РНК, экстракции белка, сбора секреции, фиксации и клеточной культуры (см. Разделы 2-6 ниже).
- Перенесите часть образца, предназначенную для культивирования клеток (раздел 5/6), на новую культуральную чашку 60 мм, содержащую 5-8 мл холодной, дополненной среды DMEM / F-12 (альтернативно, крышка первой чашки для культивирования может быть Используется для этого шага).
ПРИМЕЧАНИЕ. Требуемое количество среды DMEM / F-12 (начиная со стадии 1.1) будет зависеть от размера опухоли или нерва, но оно должно упасть от 5 до 8 мл. Этот кусок может находиться в культуральной среде, а последующие шаги выполняются.
- В операционной комнате поместите только что собранный образец VS или GAN в стерильный солевой раствор в контейнер для образцов. Транспортируйте образец на льду из операционной в ламинарный вытяжной шкаф в лаборатории.
2. Сохранение РНК ткани VS и GAN (также подходит для сенсорного эпителия человека)
- Под ламинарным вытяжным потоком переносите 1-1,2 мл раствора для стабилизации РНК в новую пробирку 1,5 мл.
- После промывки образца PBS (шаг 1.2.3), коротко окуните маленький пирогЦеллюлозы, предназначенной для сохранения РНК (приблизительно 3 мм 3 ВС или 5 мм длины ГАН) в раствор для стабилизации РНК. Убедитесь, что образец полностью погружен в раствор.
- Подготовьте и отметьте новую трубку объемом 1,5 мл. Извлеките образец из раствора для стабилизации РНК, перенесите его в новую пробирку и храните в морозильнике -80 ° C.
3. Сбор секретов ВС и ГАН
- 1 день
- После промывания образца PBS (шаг 1.2.3) поместите часть VS или GAN, предназначенную для сбора секретов, в пустую трубку объемом 1,5 мл.
- Подготовьте два дополнительных 1,5 мл пробирки и пипетку в каждую пробирку 500 мкл DMEM (не дополненной FBS).
ПРИМЕЧАНИЕ. Первая трубка DMEM будет использоваться для сбора опухолевых секретов, а вторая трубка DMEM будет использоваться в качестве согласованного контроля. Секреции можно собирать в DMEM, любой другой типичной культуральной среде, а неС добавлением сыворотки или PBS. - Поместите одну из пробирок DMEM в градуированную цифровую шкалу. Тара масштаба, так что, когда трубка сидит на шкале, он читает 0 мг.
- Удалите трубку DMEM из шкалы, поместите образец образца, предназначенный для сбора выделений в трубку, и взвесьте его. Обратите внимание на результат, который будет представлять собой вес только ткани.
- Под ламинарным вытяжным потоком отрегулируйте объем DMEM в пробирке до 100 мкл на 10 мг образца.
- Поместите пробирку, содержащую образец ткани, и соответствующий им контроль (только DMEM) в инкубатор (37 ° C, 5% CO 2 ) в течение периода, соответствующего планам этого эксперимента. Инкубируйте ткань в течение по меньшей мере 72 часов для сбора биологически полезных количеств опухолей или нервных секретов 15 .
- День 4
- После инкубации в течение 72 ч удаляют содержащую секрецию среду из( Т. Е. Ткани с кондиционированной средой) с использованием 1 мл пипетки. Чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания, аликвотируйте среду в новые пробирки в соответствии с запланированными анализами ниже по течению ( например, для запуска ELISA с 4 лунками, требующими по 50 мкл каждый, могут быть получены аликвоты 210 мкл).
- При необходимости замораживайте кусочек ткани, оставшийся в исходной трубке (уже маркированной в День 1) при -80 ° C для дополнительных анализов, таких как извлечение ДНК, на более поздний срок.
- Храните ткань, выделения и контролируйте DMEM в морозильнике -80 ° C до тех пор, пока не начнутся нисходящие приложения ( например, ELISA, LC-MS / MS, цитокиновые массивы и т . Д. ).
4. Экстракция белка из ткани VS или GAN
- Получение обогащенного буфера RIPA
- Добавьте одну таблетку ингибитора фосфатазы и одну таблетку ингибитора протеазы в 10 мл буфера RIPA в пробирке объемом 15 мл; Это укрепленоБуфер RIPA.
ПРИМЕЧАНИЕ. Храните буфер RIPA при 4 ° C и добавляйте таблетки непосредственно перед использованием.
- Добавьте одну таблетку ингибитора фосфатазы и одну таблетку ингибитора протеазы в 10 мл буфера RIPA в пробирке объемом 15 мл; Это укрепленоБуфер RIPA.
- Выделение белков
- Перенесите 210 мкл обогащенного буфера RIPA (этап 4.1.1) в новую 1,5 мл пробирку.
- После промывки образца с помощью PBS (шаг 1.2.3) переносите небольшой кусочек ткани, предназначенный для экстракции белка (приблизительно 3 мм 3 ВС или длиной 5 мм GAN) в трубку, содержащую буфер RIPA, и помещайте ее на лед В течение не менее 10 мин. При изучении фосфорилированных форм белков добавьте буфер RIPA ингибиторами протеазы и фосфатазы 14 . Тем временем могут быть выполнены шаги для других компонентов обработки ткани, такие как фиксация (раздел 7).
- Предварительно охладить центрифугу до 4 ° C.
- Используя пластиковый пестик, гомогенизируйте ткань в буфере, содержащей буфер RIPA. Сонатируйте ткань в течение 10-15 с при 20% амплитуде. Убедитесь, что образецОстается на льду даже во время обработки ультразвуком.
- Центрифугируют в течение 10 мин при 15000 × и 4 ° С.
- Выровняйте супернатант с шагом 50 мкл в новые 0,5 мл трубки (в зависимости от предполагаемых нижестоящих приложений можно выбрать любой размер приращения).
- Храните аликвоты белкового лизата в морозильнике -80 ° C до тех пор, пока не начнутся нисходящие приложения ( например, ELISA или вестерн-блоты) 20 , 21 .
5. Первичная культура ВС ВС
- 1 день
- Отделите ткань VS, предназначенную для культуры клеток (которая сидит в культуральной среде, как описано на стадии 1.2.6), приблизительно до 1 мм 3 штуки, используя пару щипцов в каждой руке.
- Аспирируйте среду, содержащую опухоль, с помощью 10 мл серологической пипетки и переносите все содержимое в коническую трубку емкостью 15 мл.
- Центрифуга в течение 3 мин при1000 xg и 25 ° C.
- Подготовьте среду для дезинтеграции в новой 60-миллиметровой культуральной чашке, объединив 4,7 мл добавленной среды DMEM / F-12 с 250 мкл коллагеназы (конечная концентрация: 160 ед / мл) и 50 мкл гиалуронидазы (конечная концентрация 250 Ед / мл) , Для конечного объема 5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ. Оба фермента следует хранить в морозильнике -20 ° C, но размораживать перед приготовлением этой среды (шаг 1.2.2). - После центрифугирования кусочки опухоли образуют гранулу на дне конической трубки. Тщательно удалите пипеткой и выбросьте супернатант.
- Добавить 2 мл свежеприготовленной ферментсодержащей дезинтегрирующей среды (этап 5.1.4) в опухолевую таблетку. Несколько раз пипетируйте вверх и вниз, чтобы мобилизовать ткань и перенести среду, содержащую опухоль, в культуральную посуду 60 мм.
- Поместите культуральную чашку в инкубатор (37 ° C, 5% CO 2 ) в течение 18 часов.
- День 2
- Теплый DСреда MEM / F-12 с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина (полученного на стадии 1.1) в водяной бане с температурой 37 ° C.
- Удалите чашку Петри, содержащую VS-культуру, из инкубатора (шаг 5.1.7). Используя иглу 22 G, прикрепленную к шприцу объемом 6 мл, аспирируйте культурально-содержащую среду и перенесите ее в новую 15-миллилитровую коническую трубку.
- Центрифугируют в течение 5 мин при 1000 мкг и 37 ° С.
- Тем временем, используйте стерильные щипцы, чтобы поместить необходимое количество покровных покрытий с поли-D-лизином и ламинином в 24-луночный планшет.
ПРИМЕЧАНИЕ. Количество колодцев, подлежащих культивированию, зависит от размера образца; Приблизительно 24-32 лунки можно культивировать с 1 см 3 опухоли, поэтому для большинства меньших опухолей целесообразно планировать 8-16 лунок культивируемых клеток. - После центрифугирования отбрасывают супернатант ( то есть среду, обогащенную ферментами) и ресуспендируют остаточный клеточный осадок в свежей, дополненной среде DMEM / F-12, предварительно нагретойНа этапе 5.2.1.
ПРИМЕЧАНИЕ. Объем ресуспендирования гранулы определяется количеством скважин, запланированных на этапе 5.2.4, с оценкой 1 мл среды в плановой скважине. - Аспирируют 2 мл ресуспендированной клеточной среды (этап 5.2.5) с использованием 5 мл серологической пипетки. Поместите 1 мл среды, содержащей опухолевые клетки, в каждую подготовленную лунку 24-луночного планшета.
- Продолжайте аспирирование и осаждение среды, содержащей опухолевые клетки (аспирация с шагом 2 мл, из которой 1 мл осаждается в каждую запланированную скважину) до тех пор, пока суспензия опухолевых клеток не будет поделена поровну между всеми подготовленными лунками.
- Поместите 24-луночный планшет в инкубатор с температурой 37 ° С в течение ночи.
- День 3
- Если на дне колодцев отмечается значительный обломки, осторожно измените среду в каждой лунке на новую добавленную культуральную среду DMEM / F-12, стараясь не выщелачивать адгезивные клетки. Если нет, верните пластину в инкубатор и измените ееПервый в первый раз на 5-й день.
- Дни 5-7 и после
- Изменяйте среду каждые 3 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ. Первичные клетки VS и GAN человека обычно поддерживаются в культуре до тех пор, пока они не будут использованы в нисходящих приложениях в возрасте 14 дней или около 14 лет. После этого чистота культуры уменьшается.
- Изменяйте среду каждые 3 дня.
6. Первичная культура человеческого GAN
- 1 день
- Под рассекающим микроскопом выделяют пучки из ткани, обозначенной для культуры GAN (которая сидит в культуральной среде, как указано на этапе 1.2.6).
- Выделите пучки из эпинеурия и волокнистой оболочки, потянув за перинеурий, используя нет. 5 щипцов, сжимая эпиневриум, нет. 3 пинцета.
- Как только пучки достаточно изолированы от окружающего эпинеурия, перенесите их в новое блюдо для культуры, содержащее 2 мл свежего суп.
- Отрежьте пучки на 1 - 2 мм сегменты, используя лезвие скальпеля.
- Пипеткой мелкие кусочки и окружающая среда в 15 мл пробирку, содержащую 3 мл свежей добавленной культуральной среды, так что общий объем в 15-мл пробирке становится 5 мл.
- Центрифугируйте образец в течение 3 минут при 1000 xg и 25 ° C.
- Тем временем сделайте среду культивирования клеток Шванна в новой 60-миллиметровой чашке Петри, объединив 4,7 мл добавленной среды DMEM / F-12, 250 мкл коллагеназы и 50 мкл гиалуронидазы для конечного объема 5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ. Храните оба фермента при -20 ° C; Оттаивают их при комнатной температуре перед приготовлением этой среды (этап 1.2.2). - После центрифугирования образца пучки будут конденсироваться в небольшой шарик в конической трубке. Отбросьте супернатант.
- Добавьте 2 мл свежеприготовленной ферментсодержащей дезинтегрирующей среды (этап 6.1.6) в нервную таблетку. Пипеткой и dНесколько раз, чтобы мобилизовать ткань и перенести ее на новое блюдо культуры 60 мм.
- Поместите блюдо в инкубатор (37 ° C, 5% CO 2 ) в течение 20-22 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ. Это более длительная инкубация, чем требуется для образцов VS (шаг 5.1.7).
- Под рассекающим микроскопом выделяют пучки из ткани, обозначенной для культуры GAN (которая сидит в культуральной среде, как указано на этапе 1.2.6).
- День 2
- Теплая добавленная среда DMEM / F-12 в водяной бане с температурой 37 ° C.
- Используя иглу 22 G, прикрепленную к 6-мл шприцу, аспирируйте среду, содержащую культуру клеток, и перенесите ее в новую 15-миллилитровую коническую пробирку.
- Центрифугируют в течение 5 мин при 1000 мкг и 37 ° С.
- Удалите супернатант и повторно суспендируйте образец в новой, предварительно нагретой, дополненной среде DMEM / F-12.
- Используйте стерильные щипцы, чтобы поместить необходимое количество покровных покрытий с покрытием в лунки 24-луночного культурального планшета.
ПРИМЕЧАНИЕ. Вычисление двух лунок культивируемых клеток на 1-сантиметровый образец нерва способствует устойчивому росту культуры. - Добавьте 1 мл среды, содержащей культуру, в каждуюХорошо обозначен в 24-луночном планшете.
- Поместите 24-луночный планшет в инкубатор при температуре 37 ° C и 5% CO 2 .
- День 3
- Если в лунках отмечается значительный мусор, тщательно замените среду новой добавленной культуральной средой DMEM / F-12, стараясь не выщелачивать адгезивные клетки. Если нет, верните пластину в инкубатор и сначала замените носитель в день 5.
- Дни 5-7 и после
- Изменяйте среду каждые 3 дня.
7. Фиксация ткани VS & GAN
- Внесите 1-1,2 мл 4% параформальдегида (PFA, ВНИМАНИЕ) в новую пробирку 1,5 мл.
- После промывки опухоли или нерва PBS (шаг 1.2.3) перенесите небольшой кусочек ткани (приблизительно 3 мм 3 VS или 5 мм длины GAN) в 4% PFA и поместите пробирку на шейкер при 4 ° C. Убедитесь, что образец полностью погружен в tОн решение.
- После не менее 2 ч фиксации извлеките трубку из шейкера и продолжайте дальнейшую обработку ( например, встраивание в парафин или оптимальное количество для резки (OCT) для последующей иммуногистохимии или иммунофлуоресценции) 22 , 23 , 24 . Альтернативно, ткань можно замораживать, как описано ранее 25 , 26 .
8. Сбор и хранение человеческого перилимфа во время транслябиринтинной VS-резекции
- Поместите три стерильных 1,5 мл трубки на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ. Одна трубка будет храниться как резервная копия в случае загрязнения. - Заполните одну 1,5 мл пробирку примерно 1,2 мл раствора PBS, который дважды фильтруют с использованием фильтра 0,22 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы собрать perilymph во время transabyrinthine VS резекции, хирург должен сначала убедиться, что хирургиКалорийное поле не содержит костной пыли, крови или физиологического раствора. Для этой цели хирург может использовать всасывающую трубку Schuknecht 21 или 24 G в не доминирующей руке.
Типичным местом для извлечения перилимф является боковой полукруглый канал (однако, задний полукруглый канал или мембрана с круглым окном также могут быть доступны в зависимости от предпочтения хирурга). Хирург должен тщательно удалить лабиринтную кость с помощью алмазного бура (при использовании непрерывного всасывающего орошения), чтобы идентифицировать синюю линию ( т. Е. Мембранный лабиринт) полукруглого канала. Полукруглый канал проникает через синюю линию, используя длинную иглу 27 G, прикрепленную к 1 мл туберкулиновому шприцу. - Попросите хирурга осторожно аспирировать небольшое количество перилимфа, а затем пропустите шприц и прикрепите иглу к хирургической медсестре.
ПРИМЕЧАНИЕ. Как правило, выпадает капля perilymph или меньше. Если наблюдаемый объем больше, образец, вероятно, загрязнен другими fLUID. - Откройте подготовленную, пустую трубку объемом 1,5 мл и пробирку, заполненную PBS непосредственно перед использованием. Будьте осторожны, чтобы не прикасаться к внутренней части крышек труб при их открытии.
- Получите шприц и прикрепленную иглу от хирургической медсестры и полностью очистите жидкость до пустой трубки, стараясь не касаться самой трубки иглой.
- Осторожно отсоедините иглу от шприца. Не загрязняйте наконечник иглы и продолжайте удерживать ее в одной руке.
ПРИМЕЧАНИЕ. Очень маленький объем перилимфы собран, поэтому некоторые жидкости могут оставаться на длинном кончике иглы. - С другой стороны, используйте сам шприц (без иглы), чтобы сосать 0,2 мл отфильтрованного раствора PBS из подготовленной трубки в корпус шприца.
- Верните иглу в шприц. Полностью эвакуируйте шприц в трубку, содержащую перилимф, используя стерильный PBS для промывки наконечника иглы.
- Закройте пробирку, содержащую перилимф и PBS, и место Это на льду.
- Утилизируйте иглу в контейнере для острых предметов.
- Поместите трубку, содержащую перилимф, в морозильник -80 ° C как можно скорее.
9. Сбор и хранение CSF человека
- Поместите три (или более) стерильных 1,5 мл пробирки на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ. Одна трубка будет резервной в случае загрязнения или объема образца, который больше, чем ожидалось. - После открытия твердой мозговой оболочки попросите хирурга собрать CSF с 3 мл шприцем (без прикрепленной иглы).
ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы предотвратить загрязнение, сбор CSF должен происходить сразу же после открытия твердой мозговой оболочки. - Попросите хирурга передать шприц хирургической медсестре.
- Получите шприц от хирургической медсестры и полностью эвакуируйте необходимый объем CSF в пробирку (и).
- Закройте трубку (ы) и поместите их на лед.
- Поместите трубку (-и) в морозильник -80 ° C как можно скорее.
- Используя концентрацию вирусного запаса в качестве эталона, вычислите требуемое количество генома (gc) и множественность инфекции (MOI), необходимые для предлагаемого эксперимента по трансдукции; Вирусный материал можно развести непосредственно в добавленную культуральную среду.
ПРИМЕЧАНИЕ. Любой вирусный вектор, подходящий для первичной клеточной трансдукции, может быть использован; См. Landegger et al. (2017) для детального сравнения шести различных серотипов, связанных с адено-ассоциированными вирусами 27 . Кроме того, при культивировании первичных клеток человека количество клеток обычно не определяется перед нанесением покрытия на покровные стекла. Первичные VS-клетки плохо реагируют на трипсинизацию и пассирование, поэтому для надежного расчета MOI количество адгезивных клеток на лунку можно оценить с помощью фазово-контрастного микроскопа. Альтернативно, если ячейки близки к слиянию, их числа могут быть надежно оценены с использованием стандартных значений плотности ячеек для24-луночный планшет ( например, 5 × 10 4 клетки на лунку). - Под ламинарным вытяжным потоком подготовьте добавленную среду, содержащую требуемое количество вируса, в 15 мл конической лабораторной пробирке, так что 1 мл вируссодержащей среды готовят для каждой лунки клеток, подлежащих трансмутации. Пипеткой, содержащей вирусы, вверх и вниз, чтобы перемешать осторожно, но тщательно.
- Используя стерильные щипцы, перенесите покровные стекла, содержащие первичные клетки VS (этап 5.2.8), из исходной 24-луночной планшеты на новую 24-луночную планшета. После переноса каждого покровного лица добавьте 1 мл вирусосодержащей среды. Закручивайте пластину каждый раз, когда добавляется среда, чтобы обеспечить равномерное покрытие клеток вирусом.
- Инкубируйте при 37 ° C и 5% CO 2 в течение всего запланированного эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ. Инкубации в пределах от 48 до 120 ч показали многообещающие результаты трансдукции 27 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Первичные человеческие ВС-клетки в культуре, как установлено в разделе 5, можно рассматривать как информативные модели связанных с болезнями процессов во многих последующих исследовательских приложениях ( рисунок 1 ). Здоровые клетки Шванна, культивированные в разделе 6, обеспечивают прямую и поучительную точку сравнения. Как указано ниже, обширные данные от VS и GAN, обработанных в соответствии с этой унифицированной методологической структурой, доступны в нескольких статьях, ранее опубликованных 12 , 13 , 14 , 15 , 27 .
Здесь впервые представлена успешная трансдукция первичных клеток VS с адено-ассоциированными вирусами для генной терапии ( рисунок 2 ). Первичные VS-клетки трансдуцировали в культуре w С GFP-выражающим Anc80, предсказанным предком адено-ассоциированных вирусов 28 . Показано, что Anc80 является максимально эффективным вектором переноса гена в тканях кохлеарной ткани человека in vitro и in vivo 27 . Эффективная трансдукция первичных клеток человека с этим вектором несет важные последствия для будущих набегов на генную терапию для VS.
Рисунок 1: Изображения с ярким полем первичных человеческих чешуйчатых шванномальных культур.
Можно идентифицировать типичные шаблоны в организации VS-клеток в культуре. Шкала шкалы = 200 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
2 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55827 / 55827fig2.jpg "/>
Рисунок 2: Представитель иммунофлюоресцентного изображения первичных человеческих вестибулярных шванномальных культур после воздействия GFP-экспрессирующего Anc80 в течение 48 ч при множественности инфекции (MOI) в 250 000.
Зеленый = GFP; Красный = фаллоидин / F-актин (окрашивает цитоскелет); Синий = DAPI (окрашивает ядро). Шкала шкалы = 50 мкм (А) и 100 мкм (В). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой рукописи описывается унифицированная методологическая основа исследования VS, в которой описывается одновременная обработка образцов VS и GAN человека для последующих исследований. Поскольку исследование VS входит в эпоху прецизионной медицины, подготовка одного и того же образца в формах, способных отвечать на многочисленные исследовательские вопросы, позволит обнаружить молекулярные, клеточные, генетические и протеомические свойства, характерные для отдельных пациентов.
Чистоту человеческих клеток Шванна и VS-культур тщательно оценивали с течением времени с помощью иммуноцитохимии, используя отношение клеток, положительное для маркера S100, к позитивным для ядерного окрашивания DAPI 19 . Соответственно, рекомендуется проводить эксперименты на первичных человеческих клеточных культурах Шванна в течение первых двух недель после покрытия клеток, поскольку чистота этих клеток является самой высокой в этот период; После этого начинают преобладать фибробластоподобные клетки. тыКультуры клеток gh VS также максимально чисты через две недели в культуре, VS-клетки не имеют контакт-опосредованного ингибирования и будут продолжать размножаться на более поздних стадиях. Кроме того, непосредственное сравнение микрочипов экспрессии белка из ткани VS (раздел 4) и клеток VS в культуре из тех же опухолей (раздел 5) успешно показало, что культуры ВС демонстрируют удовлетворительно высокий уровень биологического сходства с их соответствующими родительскими опухолями 19 . Успешную количественную оценку представляющих интерес белков можно осуществлять через вестерн-блот белковых лизатов, продуцируемых в разделе 4, и количественную оценку транскриптов РНК через qRT-ПЦР РНК, экстрагированной из тканей, сохраненных раствором стабилизации РНК (раздел 2) 12 , 13 , 14 .
Клетки VS и GAN в культуре могут подвергаться воздействию химически активных веществ, таких как нестероидные противовоспалительные препараты, смазкаL интерферирующие РНК (siRNAs) или природные органические соединения для выяснения специфических для болезни молекулярных механизмов или для тестирования терапевтической мишени 13 , 14 , 29 . Соединения, представляющие интерес, могут быть непосредственно добавлены к клеткам в культуре после соответствующих разведений в обычной добавленной культуральной среде. Чтобы оценить влияние таких веществ на важные аспекты клеточной физиологии, маркирование бромдезоксиуридином (BrdU) для пролиферации, концевую дезоксинуклеотидилтрансферазу dUTP с концевой мечением (TUNEL) для апоптоза и 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) Уменьшение 2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ) для жизнеспособности метаболизма - это надежные анализы, которые можно уверенно использовать в этих клетках 19 . Культуральную среду из обработанных клеток можно также тщательно отсасывать, хранить при -20 ° С и тестировать для количественного определения относительных уровней секретируемых веществ, таких как простагландин Е2, секреция которых сНа него влияет лечение наркотиками 13 . Кроме того, фиксация ткани (раздел 7) и последующее введение в OCT или парафин обеспечивает надежную основу для иммунофлюоресцентных анализов 13 , 14 .
Опухолевая или нервная среда, генерируемая в разделе 3, обеспечивает простой и эффективный способ оценки VS-секретируемых растворимых молекул и экстракции внеклеточных везикул. Цитокиновые массивы или ELISA могут проводиться на этих выделениях, как указано в протоколах производителей, изложенных в двух опубликованных исследованиях 9 , 12 . Внеклеточные везикулы могут быть очищены от этих секретов с использованием ультрацентрифугирования, как описано в предыдущей публикации 30 . Альтернативно, сами секреции могут быть использованы в качестве реагентов, специфичных для пациента, для последующих исследований. Например, в эксперименте, который показываетНаряду с новым механизмом, связанным с сенсоневральной потерей слуха, связанной с VS, секреции были собраны из ткани VS пациентов с плохим слухом и пациентов с ВС с хорошим слухом после инкубации в DMEM в течение 72 часов (раздел 3). Эти опухолевые выделения затем применяли к мышиным кохлеарным эксплантам, и было обнаружено, что выделения опухолей у пациентов с ВС с плохим слухом нанесли больший урон кохлеарным эксплантам, чем выделения из пациентов с ВС с хорошим слухом 15 . Важно отметить, что выделения, собранные в моменты времени до 72 часов, не приводили к существенному ущербу.
Человеческий перилимф, собранный у пациентов, перенесших трансабиринтную VS-резекцию (раздел 8), представляет собой захватывающий новый путь для открытия биомаркеров VS. Образцы, собранные в соответствии с разделом 8, анализировали с помощью жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (LC-MS / MS) для картирования протеома человека perilymph и 15 кандидатов биомаркеров VS были успешноDentified 31 . Подобный анализ может быть возможен с использованием человеческого CSF, собранного у пациентов с ВС (раздел 9).
Важным аспектом исследования VS является выбор подходящей контрольной ткани. Предыдущие исследования использовали кохлеарный нерв, вестибулярный нерв и неродственные периферические нервы (например, седалищный нерв), к переменному эффекту 22 , 32 . Однако несколько причин приводят к поддержке использования ГАН в качестве максимально релевантных контролей 15 . Подобно вестибулярному нерву, GAN представляет собой периферический сенсорный нерв с аксонами, зажатыми клетками Шванна. Важно отметить, что в литературном поиске обнаружено, что шванномы никогда не были развиты из ГАН, что делает неопластические изменения в этой ткани невероятными. Кроме того, GAN регулярно жертвуют при доступе к структурам более глубокой шеи, что позволяет больным пациентам легко получить доступ к здоровьюУ образцов во время рутинной диссекции шероховатости и паротипэктомии. Хотя кохлеарный нерв часто приносится в жертву во время операции VS и может быть легко доступен, его близкая близость к вестибулярным нервам рискует делить одну и ту же микросреду, что может продемонстрировать доопухолевые молекулярные изменения 33 . Другие лаборатории также успешно использовали ГАН в качестве адекватного контроля для исследований VS, и рекомендуется продолжить эту практику 20 , 21 , 22 , 34 .
Один важный, но часто упущенный шаг в клеточных протоколах по культуре (разделы 5 и 6) - это правильное удаление нежизнеспособных тканей и кровеносных сосудов. Удаление этих неопухолевых тканей имеет решающее значение для создания устойчивых культур максимальной чистоты. Кроме того, при покрытии клеточной культуральной среды на покровные, важноОбратите пристальное внимание на количество ткани, передаваемой в каждую лунку. Достижение четкого, мягко плотного распределения клеток, содержащих несколько «кусков» более плотной ткани в каждой лунке, особенно важно для клеток Шванна, для которых требуется достаточное количество адгезивных клеток. Покрытие покровных с поли-D-лизином и ламинином также позволяет эффективно выращивать клетки. Клетки размножаются более устойчиво, когда покровные стекла покрыты в лаборатории, по сравнению с коммерчески доступными предварительно покрытыми продуктами.
Чтобы обеспечить высококачественную экстракцию белка и РНК, убедитесь, что ткань остается при температуре ниже 4 ° C на участках 2 и 4. Кроме того, поскольку литература, касающаяся анализа секретов ВС, является недостаточной (раздел 3), возможно, потребуются новые проекты Дальнейшие инновации и различные длины инкубации.
Поскольку методы решения VS-патобиологии продолжают продвигаться, использование этойВыложенная комбинация фундаментальных методов позволит получить максимальный объем информации из одного образца человека. Сообщаемая одновременная обработка тканей VS и GAN станет неотъемлемой частью генерации эффективных фармакологических и генетических методов лечения против этой изнурительной опухоли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным институтом глухоты и других расстройств связи грантов R01DC015824 (KMS) и T32DC00038 (поддержка JES и SD), грант Министерства обороны W81XWH-14-1-0091 (KMS), Фонд Bertarelli (KMS) , Фонд Нэнси Сэйлса (KMS), Исследовательский центр Lauer Tinnitus Research (KMS) и Фонд Барнса (KMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 German Glass Coverslip | Corning | 354087 | Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
| CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile | Corning | 3526 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| DMEM/F-12, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prior to use |
| Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prior to use |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer |
| Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets | Roche | 04906845001 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
| Pipettes and pipette tips, 5/10/25 mL | Variable | Variable | |
| Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0 mL Microtubes | E&K Scientific | EK-10539 | |
| PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| RNAlater (RNA stabilization solution) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Saline - 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 mL | Hospira | 0409-1966-05 | |
| Scalpel Blades - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Schuknecht Suction Tube 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker |
| Specimen Container, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 mL, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 mL | BD | 309659 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 mL | BD | 309656 | |
| Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe | Cole-Parmer | CP25013 |
References
- Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
- Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma. Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).
- Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S.
- Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P.
- Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. What is the real incidence of vestibular schwannoma? Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).
- Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas. Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).
- Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS. Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).
- Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L.
- Dilwali, S., et al. Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size. Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).
- Caye-Thomasen, P., et al. VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate. Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).
- Koutsimpelas, D., et al. The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).
- Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells. Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).
- Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas. Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).
- Dilwali, S., et al. Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth. Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).
- Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
- Blakeley, J. Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).
- Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations. Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).
- Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary culture of human vestibular schwannomas. J Vis Exp. (89), (2014).
- Dilwali, S., et al. Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol. Hear Res. , 25-33 (2014).
- Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).
- Cioffi, J. A., et al. MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival. Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).
- Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy. Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).
- Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1. Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).
- Cattoretti, G., et al. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).
- Hung, G., et al. Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation. Glia. 38 (4), 363-370 (2002).
- Archibald, D. J., et al.
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
- Kim, B. G., et al. Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 36215 (2016).
- Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).
- Lysaght, A. C., et al.
- Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).
- Schulz, A., et al. The importance of nerve microenvironment for schwannoma development. Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).
- Torres-Martin, M., et al. Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32. PLoS One. 8 (6), e65868 (2013).
