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Neuroscience

बायोटिनिलेशन का उपयोग करते हुए प्राइमरी एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों में प्रोटीन की कोशिका-सतह अभिव्यक्ति और एन्डोसाइटिक दर निर्धारित करना

Published: July 3, 2017 doi: 10.3791/55974
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cellular and Physiological Sciences, University of British Columbia

Summary

प्लाज्मा झिल्ली पर व्यक्त प्रोटीनों की कोशिका-सतह अभिव्यक्ति और एन्दोयोटीक दर निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किए गए दो बायोटिनिलेशन आधारित विधियों को इस रिपोर्ट में प्रस्तुत किया गया है।

Abstract

कोशिका-सतह प्रोटीन कार्य की एक विस्तृत सरणी में मध्यस्थता करता है। कई मामलों में, उनकी गतिविधि एंडोकैटिक प्रक्रियाओं द्वारा नियंत्रित होती है जो प्लाज्मा झिल्ली पर अपने स्तर को व्यवस्थित करती हैं। यहां, हम ऐसे 2 तरीकों के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो ऐसी प्रक्रियाओं के अध्ययन की सुविधा देते हैं, जो दोनों कोशिका-सतह प्रोटीन के बायोटिनेलिटिंग के सिद्धांत पर आधारित हैं। पहले सेल-सतह पर एक विशेष प्रोटीन के रिश्तेदार स्तरों के अर्द्ध-मात्रात्मक निर्धारण के लिए अनुमति देने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इसमें, प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन कोशिकाओं के लाइसिन अवशेषों को पहले बायोटिन आधा भाग के साथ लेबल किया जाता है। एक बार कोशिका लिस्ड हो जाने के बाद, इन प्रोटीन को बायोटिन के बाद के प्राकृतिक आत्मीयता का शोषण करके एगरोज़-अचल सफ़ेदविदिन के उपयोग के द्वारा विशेष रूप से उपजी हो सकता है। ऐसे तरीके से पृथक प्रोटीनों को एक मानक पश्चिमी ब्लोटिंग दृष्टिकोण के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है। दूसरी विधि एक particul के एंडोसिटिक दर का निर्धारण करने के साधन प्रदान करती हैसमय की अवधि में सेल सतह लक्ष्य। कोशिका-सतह प्रोटीन को पहले बायोटिन व्युत्पन्न के साथ संशोधित किया गया था जिसमें क्लेविएबल डाइस्फ़ाफ़ाइड बॉन्ड होता था। तब कोशिकाओं को फिर से सामान्य संस्कृति की स्थिति में स्थानांतरित कर दिया जाता है, जिससे बायोटिनिलेटेड प्रोटीन के अनुपात में एन्डोसाइटैटिक तेज होता है। इसके बाद, गैर-आंतरीकृत बायोटिन समूहों के डिस्लाफ़ाइड बांड झिल्ली-अभेद्य कम करने वाले एजेंट ग्लुटाथियोन का उपयोग करके कम हो जाते हैं। इस दृष्टिकोण के माध्यम से, एन्डोसाइटेटेड प्रोटीन को पृथक किया जा सकता है और उच्च स्तर की विशिष्टता के साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।

Introduction

सेल की सतह पर प्रोटीन कोशिका फ़ंक्शन को बनाए रखने के लिए केंद्रीय रूप से भिन्न भूमिका निभाते हैं। कई उदाहरणों में, उनकी गतिविधि अंतःकाशीय प्रक्रियाओं पर निर्भर करती है, या उनको नियंत्रित करती है जो कि अस्थायी रूप से इंट्रासेल्युलर साइट्स में अलग-थलग कर देते हैं या 1 , 2 , 3 , 4 , 5 की दिशा में दिशा में हैं। यहां, हम 2 बायोटिनिलेशन-आधारित दृष्टिकोण को हाइलाइट करते हैं, जो उपयोगकर्ता को प्लाज्मा झिल्ली पर व्यक्त प्रोटीनों को विशेष रूप से टैग और अलग करने की अनुमति देने के लिए डिज़ाइन किया गया है, इन तरीकों के माध्यम से, किसी भी प्रोटीन की ब्याज की कोशिका-सतह की अभिव्यक्ति और एन्डोकीटिक दर मात्रा निर्धारित की जा सकती है, इस प्रकार इस प्रकार इसकी विनियमन का स्पष्ट आकलन प्राप्त करने की अनुमति मिल सकती है।

Biotinylation द्वारा सापेक्ष सेल-सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति का निर्धारण करना

बायोटिन, या विटामिन बी 7, जिसे पहले विटामिन एच 6 कहा जाता है, एक छोटे से पानी घुलनशील अणु है जिसे रासायनिक रूप से प्रतिक्रियाशील अमाइन, सल्फ़हाइड्रील, और जैविक अणुओं के कार्बोक्सील समूह को संशोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कोशिका-सतह बायोटिनिलेशन अभिकर्मकों की वर्तमान फसल में मुख्य रूप से झिल्ली-अवरुद्ध सल्फोनेटेड एन-हाइड्रोक्सिसुकिनिमाइड (सल्फो-एनएचएस) बायोटिन या इसके डेरिवेटिव के एस्टर शामिल होते हैं, जो कि प्रोटीन के लाइसिन अवशेषों के साइड-चेन पर उपस्थित एमी के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए डिज़ाइन होते हैं। कोशिका की सतह जब इन्हें मूल स्थितियों के तहत वंचित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप उत्परिवर्तक बायोटिन मुक्ति 7 के साथ एमेड बांड बनाते हैं। इस प्रकार से संशोधित, कोशिका-सतह प्रोटीन को एविडिन के प्रयोग से अलग किया जा सकता है, एक 66 - 69 केडीए टेट्रामेरिक प्रोटीन जिसे बायोटिन के लिए बहुत अच्छा लगा है, लगभग 10 -15 की असंतुलन स्थिरता के साथ बाध्यकारी है, इसे एक के रूप में चिह्नित करता है सबसे मजबूत noncovalent बातचीत 8 ज्ञात , 9

पिछले अध्ययनों में कोशिका की सतह पर प्रोटीन की अभिव्यक्ति को मापने के कई वैकल्पिक तरीकों का इस्तेमाल किया गया है। उदाहरण के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से विज़ुअलाइज़ेशन के बाद, ब्याज की प्रोटीन के लिए विशेष रूप से फ्लोरोसेंटली टैग एंटीबॉडी का इस्तेमाल करते हुए अनपरिबाइलाइज्ड कोशिकाओं का लेबलिंग, आमतौर पर नियोजित दृष्टिकोण है, लेकिन एंटीबॉडी की उपलब्धता पर भारी निर्भर है जो बाह्य कोशिकाओं से बाँध सकते हैं। हाल ही में, अम्लीय मीडिया के संपर्क में आने के लिए प्रतिक्रिया करने वाले पीएच-संवेदनशील फ्लोरोफोर्स वाले क्रोमरिक प्रोटीन के प्रयोग से जुड़े तरीकों को भी सफलतापूर्वक 10 को नियोजित किया गया है। हालांकि, ऐसे assays आमतौर पर सेल लाइनों में इन constructs के exogenous अभिव्यक्ति शामिल है जिसमें ब्याज की प्रोटीन natively पाया नहीं है इन तरीकों के बावजूद subcellular स्थानीयकरण और exocytic यात्रा कार्यक्रम के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान करने में सक्षम हैंलक्ष्य प्रोटीन, और इसलिए यहां वर्णित बायोटिनिलेशन-आधारित तरीकों के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किया जाना चाहिए यदि उपकरण उपलब्ध हैं

एक ठेठ बायोटिनिलेशन परख में, कोशिकाओं को पहले 4 डिग्री सेल्सियस पीबीएस में अच्छी तरह से धोया जाता है। इससे संस्कृति माध्यम द्वारा शुरू की गई सीरम प्रोटीन के किसी भी निशान को हटा दिया जाता है, इस प्रकार यह सुनिश्चित करता है कि ये अगले चरण में बायोटिन की अधिक मात्रा का उपभोग नहीं करेंगे। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि, तापमान में कमी से एन्डोसाइटोसिस का कारण बढ़ने से काफी कम हो जाता है तब बायोटिनिलेशन अभिकर्मक जोड़ा जाता है। इसके बाद, कोशिकाओं को फिर से धोया जाता है, और फिर या तो ग्लाइसीन या एनएच 4 सीएल युक्त शमन बफर के साथ उकसाया जाता है, जिसके उद्देश्य से अनरेक्टेड बायोटिन के सभी शेष निशानों को निष्क्रिय करना है। तब कोशिकाओं को लियड किया जाता है, जिसके बाद बायोटीनिलेटेड प्रोटीन का वेग बढ़ने के लिए agarose-immobilized streptavidin को जोड़ा जाता है। विश्लेषण आमतौर पर पश्चिमी ब्लोटिंग के माध्यम से किया जाता है, जिससे विभिन्न जनसंपर्क के रिश्तेदार सेल-सतह अभिव्यक्ति की अनुमति मिलती हैओटीएन्स को मापने के लिए

इस परख के आधार के कारण, यह बाहरी वातावरण के संपर्क में आने वाले भाग रखने वाले प्रोटीनों के उपयोग के लिए उपयुक्त है। Multipas ट्रांसमैमब्रन प्रोटीन, जो कि उनके लूप क्षेत्रों के भीतर कई प्रतिक्रियाशील lysines के पास हैं, इस पद्धति के लिए सबसे अधिक अनुकूल हैं, जबकि एकल पास प्रोटीन बायोटिनिलाटेड होने के लिए कम संवेदी होते हैं। यहां तक ​​कि इन मामलों में, एक संभावना बनी हुई है कि गठनात्मक बदलाव या इंटरमॉलेक्यूलर इंटरैक्शन कुछ प्रतिक्रियाशील साइटें प्रदर्शित कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप कम-अपेक्षित बायोटिनेलिटी उपज उत्पन्न होता है।

बायोटिनिलेशन द्वारा सेल-सतह प्रोटीन की आंतरिकता दर निर्धारित करना

इस परख के सिद्धांत बड़े पैमाने पर सेल-सतह बायोटिनिलेशन के समान हैं, जिनमें कई अपवाद हैं, जिनमें से सबसे महत्वपूर्ण प्रतिवर्ती बायोटिनिलेशन अभिकर्मकों का उपयोग होता है। बायोटिन समूह (इनमें से) के पास अनुशासन हैएलफाईड बॉन्ड्स, उनके ढांचे के भीतर, जो एजेंटों को कम करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं; इसका उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है कि परख अवधि के दौरान इंट्रासेल्युलर साइट्स में ले जाने वाले सेल-सतह प्रोटीनों को बायोटिनिलाटेड छोड़ दिया जाएगा। एक परख आम तौर पर निम्नलिखित तरीके से होता है: कोशिकाओं को पहले धोया जाता है और ठंड अभिकर्मकों के साथ बायोटिनिलाटेड होता है, फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृति माध्यम को पुन: पेश किया जाता है, और कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में वापस कर दिया जाता है; यह लेबल सेल-सतह प्रोटीन को एन्डोकिटोसिस से गुजरना पड़ता है। कम करने वाले एजेंट ग्लुटाथिऑन - जो झिल्ली को घुसना नहीं कर सकते हैं - फिर कोशिका की सतह पर शेष प्रोटीन से जुड़े बायोटिन मोएटियों के डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड को तोड़ने के लिए जोड़ा गया है। अंत में, टूटी डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड को आयोडोएसिटामाइड से प्रतिक्रिया दी जाती है, लेबिल थियोल समूहों का सेवन करती है और सुधारों से बांड को रोकता है। पहले की तरह, कोशिकाओं को लिसाइड किया जाता है, और लेबल प्रोटीन स्ट्रैपटैविंडिन-एगरोज़ का उपयोग कर उपजी होते हैं।

सीमा डिस्कपिछले खंड में ussed यहां भी लागू होते हैं क्योंकि समानता के बीच साझा तरीके इसके अलावा, यह ध्यान में लायक है कि तापमान पर इस परख में शामिल बदलावों का सटीक निर्धारण है कि समय के प्रत्येक वेतन वृद्धि के लिए प्रोटीन कितना प्रोटीन होता है, खासकर तेजी से आंतरिक या तेजी से रीसाइक्लिंग प्रोटीन के मामले में। इस परख केवल एन्डोकितिक दर के एक semiquantitative अनुमान प्रदान करता है कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्रत्येक भारित पुटिका की तेजता को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है और एंडोसायटोसिस के कैनेटीक्स का अधिक सटीक माप प्रदान करता है। इसलिए यह इस परख के लिए एक बहुत ही उपयोगी पूरक प्रदान कर सकता है, यह मानते हुए कि ब्याज की प्रोटीन का फ्लोरोसेंटली टैग चिरात्मक निर्माण उपलब्ध है 11 ।

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Protocol

1. बायोटिनिलेशन द्वारा एस्ट्रोसाइट्स में सापेक्ष सेल-सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति का निर्धारण करना

नोट: यहां, हम इस बायोटिनिलैशन तकनीक के आवेदन को स्पष्ट करते हैं कि जल-पारगम्य चैनल एक्वाफॉरिन -4 (एक्यूपी 4) के सेल-स्पेस स्थानीयकरण पर बाह्य मैट्रिक्स अणु लमिनिन के प्रभाव के अध्ययन के लिए। इस परख के लिए आवश्यक विशेष सामग्री में सल्फो-एनएचएस-एलसी-बायोटिन और स्ट्रेप्टिविन-एगरोज़ राल शामिल हैं ( सामग्री की तालिका देखें)।

  1. नोएल एट अल में उल्लिखित विधि का उपयोग करना 12 , कोटेलिक एस्ट्रोकसाइट्स की संस्कृतियों को लगभग 2 हफ्ते पहले परखने की तैयारी करते हैं, और उन्हें 75 सेमी 2 वेंटित कल्चर फ्लास्क में बढ़ाना। जब एस्ट्रोकइट्स 80-90% संगम होते हैं, तो उन्हें 0.05% ट्रिप्सिन का उपयोग करके संस्कृति की सतह से अलग कर दें, और फिर उन्हें 1: 3 का मार्ग दिखाएं।
  2. परख से पहले 48 घंटे में, जब कोशिकाएं फिर से 80-90% संयुग्मित होती हैं, तो एस्ट्रोसाइट्स 1: 3 (सी के लिए लेखांकन)60 मिमी कोशिका संस्कृति व्यंजन पर संस्कृत के स्वरूप में हंगे) ताकि वे> 70% संगम को उस दिन ले जाएं जहां प्रयोग होना है। सुनिश्चित करें कि व्यंजनों के बीच कोशिकाओं को समान रूप से वितरित किया जाता है
  3. परख से 16 घंटे पहले, पिपेट लैमिनिन को संस्कृति माध्यम से 24 एनएम की अंतिम एकाग्रता में ले जाया जाता है, और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. परख के तुरंत बाद, निम्नलिखित को तैयार करें, और फिर बर्फ पर रखें या सर्द कर लें: CM-PBS (100 मिलीग्राम / एल एमजीएल 2 ∙ 6 एच 2 ओ और 100 मिलीग्राम / एल CaCl 2 में 1X पीबीएस, पीएच 7.4 में), बायोटिन बफर (0.5 सीएम-पीबीएस में मिलीग्राम / एमएल सल्फो-एनएचएस-एलसी-बायोटिन), शमन बफर (सीएम-पीबीएस में 50 एमएम एनएच 4 सीएल), लिसीस बफर (25 एमएम ट्रिस, पीएच 7.4, 25 एमएम ग्लाइसिन, 150 एमएम नाओकल और 5 एमएम ईडीटीए, 1% ट्रिपन एक्स -100, 1 एक्स प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल), 3 एक्स लोडिंग बफर (150 एमएम ट्रिस, पीएच 6.8, 6% एसडीएस, 30% ग्लिसरॉल, 300 एमएम डीटीटी और 0.01% ब्रोमोफिनॉल नीला), और वॉश बफर (10 एमएम ट्राइस (पीएच 7.4), 1.5 मिमी ईडीटीए, 150 एमएम नाओकल, 1% ट्राइटन एक्स -100, 1 एक्स प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल)।
  5. रेमइनक्यूबेटर से एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों को पकड़े हुए व्यंजन हैं, और मध्यम त्यागें।
  6. कोशिकाओं को तीन बार 4 मिलीलीटर ठंडा सीएम-पीबीएस के साथ धोएं और कुचल बर्फ पर व्यंजन डालें।
  7. प्रत्येक अच्छी तरह से पिपेट 2 एमएल बायोटिन बफर, और पूरी तरह से कवरेज सुनिश्चित करने के लिए धीरे-धीरे कुछ समय बाद के व्यंजनों का झुकाव करें। 30 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें
  8. एस्पिरेटर का उपयोग करके बायोटिन बफर निकालें और 4 एमएल शमन बफर के साथ बदलें। 10 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें
  9. शमन बफर का आकांक्षा, और उसी की एक समान मात्रा के साथ बदलें। फिर, 10 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें
  10. शमन बफर को त्यागें, और तीन एमओएल ठंडा सीएम-पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  11. 1 एमएल में स्क्रेप कोशिकाओं में एक सेल चोर का उपयोग करके सीएम-पीबीएस ठंडा किया जाता है, और निलंबन को माइक्रोसेंट्रिव्यू ट्यूब में स्थानांतरित कर सकता है।
  12. 3 मिनट के लिए 100 xg पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं सतह पर तैरनेवाला को त्यागें, और 500 μL lysis बफर में कोशिकाओं को पुनः निलंबित करें।
  13. 30 मिनट के लिए बर्फ पर नमूनों को छोड़ें, हर 5 मिनट में वार्नेटिंग करें, या पीएल4 डिग्री सेल्सियस पर अंत-ओवर-एंड रोटेटर पर उन्हें इक्का करें
  14. कोई डिटर्जेंट-अघुलनशील सामग्री को गोली के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 14,000 xg पर लिसेडेट अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला को एक नया माइक्रोसेंट्रफ़्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    1. इस lysate के 50 μL बचाओ और लोड करने के लिए बफर जोड़ने। फिर इसे एक सूखा स्नान में 95 डिग्री सेल्सियस पर ताप से भिगोना; यह "इनपुट" अंश है, जिसमें बायोटिनिलाटेड कोशिका-सतह प्रोटीन, साथ ही साथ गैर बायोटिनिलेटेड साइटोसोलिक प्रोटीन शामिल हैं।
  15. तेज कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके इसके अंत से लगभग 0.5 सेंटीमीटर सामग्री को काटने के द्वारा विंदुक टिप खोलना। इस विंदुक टिप का प्रयोग, लेटेस्ट के लिए 75 μL स्ट्रेक्टिविडिन-एगारोज मोती (सामान्य रूप से 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) को स्थानांतरित करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर थरथानेवाला / घुमाव पर 3 घंटे के लिए सेवन करें।
    1. चूंकि स्ट्रेप्टिविडिन-एगरोज अक्सर मात्रा में 50% मोती युक्त घोल के रूप में बेचा जाता है, एक रोगाणुरोधी समाधान में निलंबित किया जाता है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि घोंसलेसमान रूप से निलंबित कर दिया जाता है, और फिर प्रत्येक नमूने में निलंबन के 150 μL विंदुक होता है।
  16. सेंटीफिगेशन द्वारा गोली स्ट्रेप्टिविडिन-अग्रोसे मोती 30 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1500 xg
    1. सतह पर तैरने वाले 50 μL (लोडिंग बफर जोड़ें और इसे पानी के स्नान या हीटिंग ब्लॉक में 95 डिग्री सेल्सियस पर डालना) बचाएं; यह "इंट्रासेल्युलर" अंश का प्रतिनिधित्व करता है, और इसमें मुख्य रूप से गैर बायोटिनिलेटेड साइटोसोलिक प्रोटीन शामिल हैं
  17. 1 एमएल वॉश बफर में पेलेट किए गए मोती को फिर से खोलें, और यह 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रॉक करें गोली मोती (चरण 1.16 के रूप में), और सतह पर तैरनेवाला त्यागें Nonbiotinylated साइटोसोलिक प्रोटीन की गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को कम करने के लिए इस प्रक्रिया को 4x दोहराएं।
  18. सेंटीफ्यूगेशन (30 डिग्री सेल्सियस से 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 1500 xg) की मोती गोली मारो और ओवरलिंग वॉश बफर को त्यागें। 50 μL 1X लदान बफर (lysis बफर का उपयोग करके पतला) जोड़ें। मोती से बायोटिन और स्ट्रेक्टिविडिन को 95 डिग्री सेल्सियस पर निरूपित करके; यह अंश शॉउलटे में बायोटिनिलाटेड कोशिका-सतह प्रोटीन केवल ("सेल-सतह" अंश) होता है।
    1. एसडीएस पृष्ठ 13 के द्वारा पृथक इनपुट, सेल-स्पेस और इंट्रासेल्युलर अंश, और पश्चिमी ब्लॉटिंग 14 द्वारा विश्लेषण।
      नोट: जब हमने हमारे प्रयोगों में 4 - 20% प्रीकाइड ग्रेडिएंट जेल का इस्तेमाल किया, तो इस अध्ययन में रुचि के प्रोटीन के लिए 4% स्टैकिंग परत (प्रत्येक में 0.1% एसडीएस युक्त) के साथ 12-14% से अलग जेल होना चाहिए। उपयुक्त आकार सीमा का एक आणविक वजन मानक भी इस्तेमाल किया जाना चाहिए। ध्यान दें कि कभी-कभी बायोटिनिलेटेड प्रोटीन के स्पष्ट आणविक द्रव्यमान में एक अवलोकनत्मक अपिशफा हो सकता है।

2. बायोटिनिलेशन द्वारा एस्ट्रोसाइट्स में सेल-सतह प्रोटीन का आंतरिकता दर निर्धारित करना

नोट: निम्नलिखित में, हम एस्ट्रोसाइट्स में AQP4 के एन्डोकिटोसिस को ट्रैक करने के लिए इस उदाहरण में प्रयोग किया जाने वाला एक विशिष्ट पल्स-चेस बायोटिनिलेशन प्रयोग का वर्णन करते हैं। इसविधि मैड्रिड एट अल द्वारा इस्तेमाल पर आधारित है 15 आवश्यक विशेष सामग्रियों में सल्फो-एनएचएस-एसएस-बायोटिन, स्ट्रेप्टिविडिन-एगरोज़ राल, कम ग्लूटाथिऑन, और आयोडोएसिटामाइड ( सामग्री की तालिका देखें) शामिल हैं।

  1. पिछले अनुभाग में उल्लिखित विधियों का उपयोग करके 60 मिमी व्यंजनों में माउस कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स की संस्कृतियां तैयार करें। सुनिश्चित करें कि परख के दिन कोशिकाओं को लगभग 70% मिला हुआ है, और यह कि प्रत्येक डिश में सेल की समान संख्या होती है।
  2. परख के तुरंत बाद, निम्नलिखित को तैयार करें, और बर्फ या सर्द में रखें: सीएम-पीबीएस (100 मिलीग्राम / एल एमजीएल 2 ∙ 6 एच 2 ओ और 100 मिलीग्राम / एल 2 Ca 2 पीबीएस, पीएच 7.4 में CaCl), बायोटिन बफर (0.5 CM-PBS में मिलीग्राम / एमएल सल्फो-एनएचएस-एसएस-बायोटिन), बफर (50 एमएम कम ग्लूटाथियोन, 75 मिमी NaCl और 75 मिमी NaOH), शमन बफर (50 एमएम आयोडोसिटामाइड, 1% बीएसए, सीएम-पीबीएस में) को कम करना, Lysis बफर (25 मिमी त्रि), पीएच 7.4, 25 मिमी ग्लाइसिन, 150 मिमी NaCl और 5 मिमी EDTA, 1% ट्रिपन एक्स -100, 1एक्स प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल), 3 एक्स लोडिंग बफर (150 मिमी ट्रिस, पीएच 6.8, 6% एसडीएस, 30% ग्लिसरॉल, 300 मिमी डीटीटी और 0.01% ब्रोमोफिनॉल नीला), और धो बफर (10 एमएम ट्रिस, पीएच 7.4, 1.5 एमएम ईडीटीए, 150 मिमी NaCl, 1% ट्रिपन एक्स -100, 1 एक्स प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल)।
  3. ताजा सेल संस्कृति माध्यम तैयार करें (डीएमईएम 10% भ्रूण बीबीआईवीर सीरम (एफबीएस), 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 1% एल-ग्लूटामाइन) के साथ पूरक है, और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पानी के नहाने में रख दिया गया है।
  4. इनक्यूबेटर से astrocyte संस्कृतियों को निकालें, और एक aspirator का उपयोग करके मध्यम aspirate।
  5. कोशिकाओं को तीन बार 4 मिलीलीटर ठंडा सीएम-पीबीएस के साथ धोएं और कुचल बर्फ पर व्यंजन डालें।
  6. प्रत्येक डिश में पिपेट 3 एमएल बायोटिन बफर, बफर को अच्छी तरह से वितरित करने के लिए कुछ समय आगे और पीछे व्यंजनों को झुकाएं, और इसे 30 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें।
  7. बायोटिन बफर को तरक्की करें, और इसे 5 एमएल गर्म मध्यम के साथ बदलें। 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक संस्कृति डिश, और 30 मिनट के लिए एक ही तापमान पर एक दूसरा डिश सेते हैं। 4 पर एक और डिश छोड़ दें6; सी 0 मिनट के नमूने के रूप में।
  8. ऊष्मायन अवधि के अंत में, मध्यम त्यागें, और कोशिकाओं को तीन बार 4 एमएल ठंडा सीएम-पीबीएस के साथ धोएं। पिपेट 6 एमएल कोशिकाओं पर बफर को कम करने, और 15 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें।
  9. बफर कम करना निकालें और फिर 6 एमएल ताजा कम करने वाले बफर के साथ बदलें। एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए बर्फ पर रखें
  10. समाधान को कम करने और 6 एमएल शमन बफर के साथ बदलें। 15 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें
  11. एक बार फिर शमन चरण दोहराएं
  12. शमन बफर को त्यागें, और 3 एमएल ठंडा पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  13. एक सेल भक्षक का उपयोग करके 1 एमएल में ठंडा पीबीएस कोशिकाओं को खिसकाना और एक माइक्रोसेंट्रिव्यूज ट्यूब में निलंबन को स्थानांतरित करना।
  14. 3 मिनट के लिए 100 xg पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और 500 μL lysis बफर में कोशिकाओं को पुन: resppend।
  15. इसे 30 मिनट और भंवर के प्रत्येक 5 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें। वैकल्पिक रूप से, इस अवधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंत-ओवर-एंड रोटेटर पर नमूनों को रखें।
  16. ली अपकेंद्रित्रडिटर्जेंट-अघुलनशील सामग्री को गोली के लिए 14 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सैट करें, फिर सतह पर तैरनेवाला को एक नया माइक्रोप्रोसीव्यू ट्यूब में स्थानांतरित करें। इस lysate के 50 μL बचाओ, यह करने के लिए बफर लोड हो रहा है और एक स्नान स्नान में 95 डिग्री सेल्सियस पर denature जोड़ें; यह "इनपुट" अंश है, जिसमें बायोटिनिलेटेड एंडोसाइटेटेड प्रोटीन, साथ ही साथ गैर-बीओटीयनिलेटेड प्रोटीन शामिल हैं
  17. एक कट विंदुक टिप का उपयोग करके, स्ट्रेप्टिविडिन-एगरोज़ स्लरी के 150 μL को लाइसेेट में जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर थरथानेवाला / घुमाव पर 3 घंटे के लिए सेवन करें। इस कदम पर अतिरिक्त विवरण के लिए 1.15 देखें
  18. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए 1500 XG पर centrifugation द्वारा गोली streptavidin-agarose मोतियों
  19. 1 एमएल वॉश बफर में रेसस्पेंड मोती, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए रॉक गोली मोती (चरण 2.18 के अनुसार), और सतह पर तैरनेवाला को त्यागें। Nonbiotinylated साइटोसोलिक प्रोटीन की गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को कम करने के लिए इस प्रक्रिया को 4x दोहराएं।
  20. सेंटीफ्यूगेशन द्वारा गोली मोती 30 एस के लिए 1,500 x ग्रा पर, 4 डिग्री सेल्सियस पर और ओव्स को छोड़ देंधोने वाला बफर 50 μL 1X लदान बफर (lysis बफर का उपयोग कर पतला) जोड़ें। 9 0 डिग्री सेल्सियस पर चिह्नित करके मोती से बायोटिन और स्ट्रेक्टिविडिन रिलीज़ करें; इस अंश में आंतरिक सेल-सतह प्रोटीन केवल ("एन्डोकीटॉस्ड" अंश) होना चाहिए।
  21. एसडीएस पृष्ठ 13 द्वारा पृथक इनपुट, सेल-स्पेस और अनबाउंड भिन्न, और पश्चिमी ब्लॉटिंग 14 द्वारा विश्लेषण।
    नोट: जब हमने हमारे प्रयोगों में 4 - 20% प्रीकाइड ग्रेडिएंट जेल का इस्तेमाल किया, तो इस अध्ययन में रुचि के प्रोटीन के लिए 4% स्टैकिंग परत (प्रत्येक में 0.1% एसडीएस युक्त) के साथ 12-14% से अलग जेल होना चाहिए। उपयुक्त आकार सीमा का एक आणविक वजन मानक भी इस्तेमाल किया जाना चाहिए। ध्यान दें कि कभी-कभी बायोटिनिलेटेड प्रोटीन के स्पष्ट आणविक द्रव्यमान में एक अवलोकनत्मक अपिशफा हो सकता है।

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Representative Results

एस्ट्रोसाइट्स में AQP4 की प्लाज्मा झिल्ली अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए सेल-सतह बायोटिनिलेशन का उपयोग करना
वर्णित वर्णों का उपयोग करके लैमिनिन से इलाज वाली एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों और अनुपचारित नियंत्रण कक्ष सेल-सतह बायोटिनेलिटी के अधीन थे बायोटिनिलेटेड प्रोटीन agarose-conjugated streptavidin के साथ उपजी थे, और फिर एसडीएस पृष्ठ के माध्यम से अलग हो गए सेल-सतह लोडिंग कंट्रोल के रूप में एक्यूपी 4 और β-dystroglycan (β-DG) के लिए कोशिका-सतह के अंशों की जांच हुई, जबकि लोडिंग कंट्रोल के रूप में एक्यूपी 4 और बीटा-एक्टिन ( चित्रा 1 ए ) के लिए इनपुट और इंट्रासेलुलर अंश को मिटा दिया गया था। कोशिका-सतह के अंश के लिए बैंड तीव्रता को घनत्वमिति के माध्यम से मात्राबद्ध किया गया, और कोशिकाओं के प्रत्येक सेट के लिए AQP4 के स्तर को पहले बीओ-डीजी मानों के विरुद्ध सामान्यीकृत किया गया, और इन अनुपातों को तब नियंत्रण कोशिकाओं के लिए सामान्यीकृत किया गया। हिस्टोग्राम ( चित्रा 1 बी ) तीन स्वतंत्र प्रयोगों के लिए ± SEM के माध्य मान का प्रतिनिधित्व करता है लैमिनिन उपचार, औसतन, सेल की सतह पर व्यक्त AQP4 में करीब 2 एक्स वृद्धि का कारण बनता है।

बायोटिनेलिटीकरण का उपयोग करते हुए AQP4 के एंडोसिटिक दर की जांच करना
एस्ट्रोसाइट्स में एपीपी 4 एन्डोसाइटिस का 30 मिनट की अवधि के दौरान ट्रैक किया गया था। संक्षेप में, एक cleavable बायोटिन एनालॉग पहली बार astrocytes के 3 व्यंजन में सतह प्रोटीन लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। कोशिकाओं क्रमशः 0, 15, और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थानांतरित कर दिए गए थे, जिसके दौरान लेबल प्रोटीनों को अन्तररित किया गया था। उस सतह पर बने लेबल को फिर से घटाने वाले एजेंट का उपयोग कर हटा दिया गया था, और एन्डोसाइटेटेड प्रोटीन agarose-conjugated streptavidin के साथ उपजी थे। एसडीएस पृष्ठ के माध्यम से अलग होने के बाद, इन्हें एक्यूपी 4 ( चित्रा 2 ए ) के लिए जांच कर लिया गया। एएक्सपी 4 स्तरों को घनत्वमिति के माध्यम से मात्रा में मापा गया था0 मिनट के नमूने के लिए उन लोगों के लिए 15 और 30 मिनट का समय अंक सामान्यीकृत थे। हिस्टोग्राम ( चित्रा 2 बी ) चार ऐसे प्रयोगों के लिए औसत मूल्यों को ± SEM दर्शाता है।

आकृति 1
चित्रा 1 एल्यूमीनिन की उपस्थिति में सेल-सतह पर AQP4 अभिव्यक्ति (ए) 24 एनएम लामीनिन -111 (+ एलएन) के साथ इलाज किए गए अनुपचारित एस्ट्रोसाइट्स (-एलएन) और एस्ट्रोसाइटों से कोशिका-सतह, इंट्रासेल्यूलर और कुल (इनपुट) अंशों की जांच ए.क्यू.पी 4 और बी-डीजी के लिए की गई। (बी) हिस्टोग्राम AQP4 के सेल-स्पेस स्तर में अंतर को दर्शाता है, जो कि β-DG स्तरों के खिलाफ सामान्यीकृत और लैमिनिन-उपचार वाले एस्ट्रोसाइट्स होते हैं। मान सामान्यीकृत पिक्सल तीव्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं ± एसईएम, नियंत्रण कोशिकाओं के लिए मूल्यों के सापेक्ष व्यक्त किए गए। तारांकन एक स्टेटिस्टिका को इंगित करता हैएक दो-पूंछ छात्र की टी -टेस्ट (एन = 3, * पी = 0.033) के आधार पर निर्धारित AQP4 में महत्वपूर्ण वृद्धि हुई है। यह आंकड़ा थाम एट अल से संशोधित किया गया है 16 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 एस्ट्रोसाइट्स में एक्यूपी 4 आंतरिककरण। (ए) 0, 15 और 30 मिनट में एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों द्वारा एटिबूट प्रोटीन की जांच AQP4 के लिए की गई। (बी) हिस्टोग्राम, 4 स्वतंत्र प्रयोगों के लिए AQP4 की आंतरिकता दरों को संक्षेप में प्रस्तुत करता है, 0 मिनट के समय-बिंदु के लिए मूल्यों के बीच सामान्यीकृत। एस्टीसिस इंगित करता है कि एपीपी 4 की मात्रा में एक सांख्यिकीय रूप से उल्लेखनीय वृद्धि 15 और 30 मिनट के बीच है, जो कि दो पूंछ से निर्धारित हैएड स्टूडेंट्स टी- टेस्ट (एन = 3, * पी = 0.017) (सी) जब ग्लूटाथियोन का उपयोग क्लेविएबल बायोटिन एनालॉग में डिस्लाफ़ाइड बॉन्ड को तोड़ने के लिए किया जाता है, तो बायोटिनिलेटेड फ्रैक्चर में सेल-सतह ए.क्यू 44 का योगदान तेजी से कम हो जाता है, जिसके परिणामस्वरूप 0 और 15 मिनट के नमूनों (सी, ऊपर बाएं ) जब यह कदम छोड़ा जाता है, तो सेल-स्पेस पूल से उत्पन्न होने वाला संकेत 2 समय-बिंदुओं को अनभिज्ञनीय (सी, शीर्ष दाएं) के बीच में बदलाव को प्रदान करता है। यह आंकड़ा थाम एट अल से संशोधित किया गया है 16 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें

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Discussion

संशोधन:
जैसा कि इन विधियों को पक्षपाती कोशिकाओं के साथ उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, हमने पीबीएस के उपयोग को 100 मिलीग्राम / एल एमजीसीएल 2 ∙ 6 एच 2 ओ और

100 मिलीग्राम / एल CaCl 2 (सीएम-पीबीएस) वॉशिंग चरण के लिए और कुछ बफ़र्स के आधार के रूप में ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोशिकाएं संस्कृति की सतह से जुड़ी रहती हैं और सेल-सेल जंक्शनों में बाधित नहीं होते हैं। हालांकि, प्रोटोकॉल को गैर-आधारिक सेल प्रकारों पर भी लागू किया जा सकता है यदि प्रक्रिया के प्रत्येक चरण के बीच कोशिकाओं को पेलेट किया जाता है। इन उदाहरणों में, सीएम-पीबीएस को पीबीएस से बदला जा सकता है।

इसके अतिरिक्त, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यहां उल्लेख की गई प्रत्येक शर्त इस प्रोटोकॉल के लिए विशिष्ट है, और अन्य अनुप्रयोगों के लिए तरीकों को नियोजित करने के लिए केवल तभी दिशानिर्देश माना जाना चाहिए। विशेष रूप से, स्वतंत्र रूप से यह सत्यापित करना चाहिए कि डिटर्जेंट निष्कर्षण प्रक्रिया उनके लिए उपयुक्त हैसेल प्रकार, और यह कि अपकेंद्रित्र सेटिंग्स सेल प्रकार के लिए उपयुक्त हैं, और स्ट्रेप्टिविडिन-एगरोज मोती के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है।

अंत में, यदि गैर-विशिष्ट बाध्यकारी और / या अत्यधिक पृष्ठभूमि से संबंधित चिंताएं हैं, तो बाजार पर वर्तमान में उपलब्ध विभिन्न एविडिन रूपों के साथ स्ट्रेप्टिविन को स्थानांतरित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, डिग्लिकोसिलेटेड एविडिन, लैक्टिन्स के लिए काफी कम आत्मीयता है, और डीएनए जैसे नकारात्मक आरोप लगाए गए अणुओं के लिए।

समस्या निवारण और नियंत्रण:
हालांकि इस रिपोर्ट में समीक्षा की गई प्रक्रियाएं काफी सीधा हैं, एक को कई महत्वपूर्ण मुद्दों पर ध्यान देना चाहिए जो प्रयोग के परिणाम को संभावित रूप से प्रभावित कर सकते हैं। सबसे पहले, जबकि दोनों assays झिल्ली पर अत्यधिक निर्भर करते हैं - sulfated biotinylation अभिकर्मकों की impermeant प्रकृति, कुछ शर्तों कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली बाधित हो सकता है, जिससे कुछ intracellular proteइन बायोटिनिलाटेड होने पर इस संभावना के लिए नियंत्रण करने के लिए, यह सुझाव दिया जाता है कि बायोटीनिलेटेड अंशों की जांच की जानी चाहिए जो कि प्लाज्मा झिल्ली पर व्यक्त नहीं किए जाने वाले लक्ष्य हैं, जैसे β-actin।

बायोटिनिलेशन अभिकर्मकों (आमतौर पर 4 या -20 डिग्री सेल्सियस, अवसादन के कुछ फार्म के साथ) के लिए उचित भंडारण की स्थिति का पालन करने के लिए सावधानी बरतनी चाहिए, क्योंकि ये उनकी अत्यधिक संवेदनशील प्रकृति के कारण अन्यथा असफल हो सकती है। फिर भी, स्ट्रेप्टिविडिन-एचआरपी के साथ इनपुट, बायोटिनिलेटेड, और गैर-बीओटीइनेलेटेड अंशों की जांच करने के लिए यह अच्छा अभ्यास है कि यह सुनिश्चित करने के लिए कि बायोटिनिलेशन वास्तव में हुई है, और यह कि बायोटिनिलेटेड प्रोटीन कुशलता से उपजी हो गए हैं (जो कि एक संकेत के अभाव से स्पष्ट होगा गैर बायोटिनिलेटेड अंश)। ऐसा करने से दोषपूर्ण अभिकर्मकों की संभावना को समाप्त करने की अनुमति मिलनी चाहिए।

एंडोसाइटेटिक बायोटिनिलेशन प्रक्रिया में डिस्फ़ाइड बांड में कमी एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि यह सुनिश्चित करता हैकि बायोटिनिलेटेड अंश में केवल आंतरिक प्रोटीनों को पृथक किया जाएगा। नियंत्रित नियंत्रण जिसमें कम करने वाले अभिकर्मक को छोड़ दिया गया है ( चित्रा 1 सी ) एक उपचार की प्रभावकारिता के प्रभाव को प्राप्त करने की अनुमति देता है।

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Disclosures

ऑथर ने किसी हित संघर्ष की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस परियोजना को कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान पीजी # 20R47867 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium chloride (NH4Cl) Fisher Scientific A661-500
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647-50
Bromophenol blue Bio-Rad #1610404
cOmplete protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11697498001
Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA) Bio-Rad #1610729
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad #1610611
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco/Thermo Fisher Scientific 11960-044
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Fisher Scientific #21335
EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin Thermo Fisher Scientific #21331
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco/Thermo Fisher Scientific 16000-044
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Glycine Sigma-Aldrich G8898 
Iodoacetamide Bio-Rad #163-2109
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane Sigma-Aldrich L2020 Thaw on ice.
L-glutamine Gibco/Thermo Fisher Scientific 25030-081
Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15) Sigma-Aldrich A5441
Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5) Leica Biosystems B-DG-CE
Penicillin/streptomycin Gibco/Thermo Fisher Scientific 15140-122
Peroxidase AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 715-035-150
Peroxidase AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-045
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Gibco/Thermo Fisher Scientific 10010-023
Reduced glutathione Sigma-Aldrich G6529
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 862010 
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S318-100
Streptavidin agarose resin Thermo Fisher Scientific #20347
Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody Alomone AQP-004
Tris base (Trizma base) Fisher Scientific BP152-1
Tris-HCl Fisher Scientific BP153-1
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 125 कोशिका-सतह अभिव्यक्ति एन्डोकिटोसिस बायोटिनिलेशन एस्ट्रोसाइट्स एक्वापोरीन -4 प्लाज्मा झिल्ली
बायोटिनिलेशन का उपयोग करते हुए प्राइमरी एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों में प्रोटीन की कोशिका-सतह अभिव्यक्ति और एन्डोसाइटिक दर निर्धारित करना
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Tham, D. K. L., Moukhles, H.… More

Tham, D. K. L., Moukhles, H. Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation. J. Vis. Exp. (125), e55974, doi:10.3791/55974 (2017).

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