Biotinylation을 사용하여 기본 Astrocyte 문화에서 단백질의 세포 표면 표현 및 Endocytic 속도를 결정

이 비디오에서는 세포 표면 비오틴화(cell-surface biotinylation)와 펄스 추적 비오틴화(pulse-chase biotinylation)의 두 가지 방법을 제시합니다. 다음 시연에서는 성상교세포를 사용합니다. 이들은 뇌에서 가장 풍부한 신경교세포(glial cell) 유형이며, 관심 단백질인 아쿠아포린-4(Aquaporin-4)를 발현합니다.

이 논문에서 사용하는 방법은 다양한 세포 유형에 적용할 수 있으며, 여기에는 현탁 세포 또는 부착 세포가 포함될 수 있습니다. 이러한 기술은 비오틴이 접근할 수 있는 세포 외 도메인을 가지고 있는 한 거의 모든 막관통 단백질의 세포 표면 발현 및 내재화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 세포 표면 비오틴화(biotinylation) 분석의 전반적인 목표는 성상세포의 원형질막에서 수분 투과성 채널 Aquaporin-4의 발현에 대한 라미닌의 효과를 측정하는 것입니다.

이 절차를 시작하려면 인큐베이터에서 성상세포 배양물을 제거하고 흡인에 의해 배지를 폐기합니다. 식힌 CM-PBS 4ml로 세포를 세 번 씻고 으깬 얼음 위에 접시를 놓습니다. 흡인에 의해 CM-PBS를 제거한 다음 각 웰에 2ml의 비오틴 완충액을 피펫으로 주입합니다.

접시를 앞뒤로 몇 번 부드럽게 기울여 완전히 덮일 수 있도록 한 후 배양물을 얼음 위에 30분 동안 놓습니다. 그런 다음 비오틴 완충액을 제거하고 4ml의 담금질 완충액으로 교체한 다음 배양액을 얼음 위에 10분 동안 보관합니다. 다음으로, 흡인하고 동일한 양의 담금질 완충액으로 교체한 후 배양물을 얼음에 10분 동안 그대로 둡니다.

그런 다음 담금질 완충액을 버리고 4ml의 냉각된 CM-PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 그런 다음 세포를 1ml의 냉각된 CM-PBS로 긁어내고 현탁액을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 섭씨 4도로 설정된 냉장 마이크로 원심분리기에서 100g의 원심분리로 세포를 3분 동안 펠릿화합니다.

그 후, 상등액을 버리고 500마이크로리터의 용해 완충액에 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 샘플을 얼음 위에 30분 동안 그대로 두면서 5분마다 소용돌이칩니다. 그 다음, 14, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 000 g에 용해물을 어떤 세제 및 녹는 물자든지 펠릿으로 만들기 위하여 원심 분리하십시오.

그런 다음 상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 50 마이크로 리터의 용해물을 저장하고 25 마이크로 리터의 3 X 로딩 버퍼를 추가하십시오. 그 후, 건조한 수조에서 섭씨 95도로 가열하여 변성시킵니다.

이것은 비오틴화된 세포 표면 단백질과 비오틴화된 세포질 단백질을 모두 포함하는 입력 분획입니다. 절단된 피펫 팁을 사용하여 75마이크로리터의 스트렙타비딘 아가로스 비드를 용해액으로 옮기고 셰이커에서 섭씨 4도에서 3시간 동안 배양합니다. 그 후, streptavidin agarose beads를 1, 500g에서 섭씨 4도에서 30초 동안 원심분리하여 펠릿

50마이크로리터의 상등액을 저장하고 25마이크로리터의 3X 로딩 버퍼를 추가합니다. 그런 다음 수조 또는 가열 블록에서 섭씨 95도에서 변성시킵니다. 이것은 세포 내 분획을 나타내며 주로 비오틴화 세포질 단백질로 구성됩니다.

그 후, 펠릿 비드를 1ml의 세척 버퍼에 다시 매달아 섭씨 4도에서 3분 동안 흔듭니다. 비드를 펠렛으로 만들고 상층액을 버립니다. 이 과정을 4회 더 반복하여 비오틴화된 세포질 단백질의 비특이적 결합을 최소화합니다.

용해 완충액을 사용하여 하나의 X로 희석된 50마이크로리터의 로딩 완충액을 추가합니다. 비드에서 비오틴과 스트렙타비딘을 섭씨 95도에서 변성시켜 방출합니다. 이 분획은 비오틴화된 세포 표면 단백질만 포함해야 합니다.

그 후, SDS-PAGE에 의해 입력, 세포 표면 및 세포 내 분획을 분리하고 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 분석합니다. 펄스 추적 비오틴화(biotinylation) 실험의 전반적인 목표는 성상세포에서 Aquaporin-4의 대략적인 내재화 속도를 측정하는 것입니다. 먼저, 인큐베이터에서 성상세포 배양액을 제거하고 배지를 흡인합니다.

그런 다음 식힌 CM-PBS 4ml로 세포를 세 번 씻고 으깬 얼음 위에 접시를 놓습니다. CM-PBS를 흡입한 다음 각 접시에 3ml의 비오틴 완충액을 피펫으로 주입합니다. 버퍼가 잘 분포되도록 접시를 앞뒤로 몇 번 기울이고 30분 동안 얼음 위에 둡니다.

그런 다음 비오틴 완충액을 흡인하고 5ml의 따뜻한 배지로 교체합니다. 한 배양 접시는 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하고 두 번째 접시는 같은 온도에서 30분 동안 배양합니다. 섭씨 4도의 다른 요리를 0분 샘플로 둡니다.

배양 기간이 끝나면 배지를 버리고 4ml의 냉각된 CM-PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 그 후, CM-PBS를 흡인하고, 그 후에 6ml의 환원 완충액을 세포 위에 피펫으로 싣고, 검체를 얼음 위에 15분 동안 방치한다. 그런 다음 배지를 6ml의 새 환원 버퍼로 교체하고 샘플을 얼음 위에 15분 더 놓습니다.

이 단계는 환원 완충액 내에 포함된 글루타티온이 세포 표면에 남아 있는 비오틴 moasis를 절단하기 때문에 매우 중요합니다. 이렇게 하면 내재화된 단백질만 비오틴 라벨링이 이루어집니다. 그런 다음 환원 용액을 제거하고 6 밀리리터의 담금질 완충액으로 교체하십시오.

샘플을 얼음 위에 15분 더 놓고 담금질 단계를 한 번 더 반복합니다. 그런 다음 담금질 완충액을 버리고 4ml의 냉각된 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. CM-PBS를 흡인한 다음 세포 리프터를 사용하여 세포를 1ml의 냉각된 PBS로 긁어내고 현탁액을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

100g에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 3분 후, 상등액을 버리고 500마이크로리터의 용해 완충액에 세포를 재현탁합니다. 샘플을 얼음 위에 30분 동안 그대로 두고 5분마다 소용돌이치게 합니다.

14, 000 g에 용해물을, 4 섭씨 온도에 10 분 동안, 세제 및 녹는 물자를 펠릿으로 만들기 위하여 원심 분리하십시오. 그런 다음 상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 이 용해액 50 마이크로 리터를 저장하고 로딩 버퍼를 추가하십시오.

그 후, 건조한 욕조에서 섭씨 95도에서 세포를 변성시킵니다. 이것은 비오틴화된 세포작용된 단백질과 비비오틴화된 단백질을 모두 포함하는 입력 분획입니다. 절단된 피펫 팁을 사용하여 150마이크로리터의 스트렙타비딘 아가로스 슬러리를 용해물에 넣고 셰이커에서 섭씨 4도에서 3시간 동안 배양합니다.

3 시간 후에, streptavidin agarose 구슬을 원심 분리에 의해, 1, 4 섭씨 온도에 30 초 동안 500 g 펠릿. 구슬을 1ml의 세척 버퍼에 다시 현탁시키고 섭씨 4도에서 3분 동안 흔듭니다. 비드를 펠렛으로 만들고 상층액을 버립니다.

이 과정을 4회 더 반복하여 비오틴화된 세포질 단백질의 비특이적 결합을 최소화합니다. 다음, 1에 원심분리에 의하여 구슬을 펠릿, 4 섭씨 온도에 30 초 동안 500 g, 팥알. 위에 있는 세척 버퍼를 버리고 50마이크로리터의 1개 x 로딩 버퍼를 추가합니다.

비드에서 비오틴과 스트렙타비딘을 섭씨 95도에서 변성시켜 방출합니다. 이 분획은 내재화된 세포 표면 단백질만 포함해야 합니다. 그런 다음 SDS-PAGE로 입력, 세포 표면 및 결합되지 않은 분획을 분리하고 웨스턴 블로팅으로 분석합니다.

여기에 표시된 것은 처리되지 않은 성상세포의 세포 표면, 세포 내 및 총 분획과 Aquaporin-4 및 beta-dystroglycan에 대해 조사된 24 나노몰 라미닌으로 처리된 성상세포입니다. 이 히스토그램은 베타-디트로글리칸에 대해 정규화된 미처리 및 라미닌 처리된 성상세포에서 Aquaporin-4의 세포 표면 수준 차이를 보여줍니다. 이 그림에서 0분, 15분 및 30분에 수집된 내재화된 단백질 분획은 Aquaporin-4에 대해 조사되었습니다.

그리고 이 히스토그램은 4개의 독립적인 실험에 대한 Aquaporin-4의 내재화를 요약하며, 0분 시점의 값에 대해 정규화되었습니다. 별표는 15분에서 30분 사이에 세포내이입된 Aquaporin-4의 양이 통계적으로 유의하게 증가했음을 나타냅니다. 글루타티온을 사용하여 절단 가능한 비오틴 유사체에서 이황화 결합을 끊으면 비오틴화 분획에 대한 세포 표면 Aquaporin-4의 기여도가 급격히 감소합니다.

그 결과 0분 샘플과 15분 샘플 간에 명확한 차이가 발생합니다. 이 단계가 생략되면 세포 표면 풀에서 발생하는 신호는 두 시점 사이의 변화를 감지할 수 없게 만듭니다. 이 절차에 따라 면역형광 및 TIRF 현미경 검사와 같은 다른 방법을 적용하여 화물의 물리적 운송을 포함한 추가 질문에 답할 수 있습니다.