Summary
Två biotinyleringsbaserade metoder, utformade för bestämning av cellytans uttryck och endocytiska hastighet av proteiner uttryckta i plasmamembranet presenteras i denna rapport.
Abstract
Cell-ytproteiner förmedlar ett brett spektrum av funktioner. I många fall regleras deras aktivitet av endocytiska processer som modulerar sina nivåer vid plasmamembranet. Här presenterar vi detaljerade protokoll för 2 metoder som underlättar studier av sådana processer, vilka båda bygger på principen om biotinylering av cellytproteiner. Den första är utformad för att möjliggöra den semikvantitativa bestämningen av de relativa nivåerna av ett visst protein vid cellytan. Därvid märks lysinresterna av plasmamembranproteinerna av celler först med en biotindel. När cellerna lyser, kan dessa proteiner sedan specifikt utfällas via användning av agarosimmobiliserad streptavidin genom att utnyttja den naturliga affiniteten hos den senare för biotin. Proteinerna isolerade på ett sådant sätt kan sedan analyseras via en standard western blotting approach. Den andra metoden tillhandahåller ett sätt att bestämma endocytisk hastighet hos ett partikelAr cell-yta mål över en tidsperiod. Cell-ytproteiner modifieras först med ett biotinderivat innehållande en klyvbar disulfidbindning. Cellerna skiftas därefter tillbaka till normala odlingsbetingelser, vilket orsakar endocytisk upptagning av en andel biotinylerade proteiner. Därefter reduceras disulfidbindningarna hos icke-internaliserade biotingrupper med användning av det membranogenomträngliga reduktionsmedlet glutation. Via detta tillvägagångssätt kan endocyterade proteiner sålunda isoleras och kvantifieras med en hög grad av specificitet.
Introduction
Proteiner vid cellytan spelar en rad roller som är centrala för att upprätthålla cellfunktionen. I många fall är deras aktivitet beroende av eller modulerad av endocytiska processer som antingen temporärt sekvestrerar dem på intracellulära ställen eller som leder dem mot nedbrytningsvägarna 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Här framhäver vi 2 biotinylationsbaserade tillvägagångssätt som är utformade för att tillåta användaren att specifikt märka och isolera proteiner uttryckta i plasmamembranet och de nyligen internaliserade. Via dessa metoder kan cellytans uttryck och endocytisk hastighet för vilket protein som helst av intresse kvantifieras, så att en tydligare bedömning av dess reglering kan uppnås.
Bestämning av relativ cell-ytproteinuttryck genom biotinylering
Biotin eller vitamin B7, tidigare känt som vitamin H6, är en liten vattenlöslig molekyl som kan användas för att kemiskt modifiera reaktiva amin-, sulfhydryl- och karboxylgrupper av biologiska molekyler. Den aktuella grödan av biotinyleringsreagenser av cellytor består huvudsakligen av membran-impermeant sulfonerade N-hydroxisuccinimidestrar av biotin eller dess derivat, utformade för att reagera med aminerna närvarande på sidokedjorna av lysinrester av proteiner uttryckta i Cellytan när dessa blir deprotonerade under basiska betingelser, vilket resulterar i att de senare bildar ett amidbindning med biotindelen 7 . Således modifierade cell-ytproteiner kan sedan isoleras via användningen av avidin, ett 66-69 kDa tetrameriskt protein som har stor affinitet för biotin, bindande till den senare med en dissociationskonstant av approximativt 10-15 , vilket markerar den som en av de Starkaste icke-kovalenta interaktioner kända 8 , 9 .
Ett antal alternativa metoder för att kvantifiera proteinuttryck vid cellytan har använts i tidigare studier. Märkningen av opermeabiliserade celler med användning av fluorescensmärkta antikroppar specifika för proteinet av intresse, följt av visualisering via fluorescensmikroskopi, är till exempel ett allmänt använda tillvägagångssätt, men är starkt beroende av tillgängligheten av antikroppar som kan binda till extracellulära epitoper. Mer nyligen har metoder som involverar användningen av chimära proteiner med pH-känsliga fluoroforer som reagerar på att utsättas för sura medier har använts framgångsrikt 10 . Sådana analyser innefattar emellertid vanligen det exogena uttrycket av dessa konstruktioner i cellinjer, i vilka proteinet av intresse inte är nativt hittat. Dessa tillvägagångssätt kan ändå ge värdefull information om subcellulär lokalisering och exocytisk resväg avMålprotein och bör därför användas tillsammans med de biotinyleringsbaserade metoder som beskrivs här om verktygen är tillgängliga.
I en typisk biotinyleringsanalys tvättas cellerna först noggrant i 4 ° C PBS. Detta avlägsnar eventuella spår av serumproteiner som införs av odlingsmediet, vilket säkerställer att dessa inte kommer att förbruka överskott av biotin i nästa steg. Ännu viktigare, reduktionen av temperaturen orsakar endocytos för att decelerera signifikant. Biotinyleringsreagenset tillsättes därefter. Därefter tvättas cellerna igen och inkuberas sedan med en släckningsbuffert innehållande antingen glycin eller NH4Cl, vars syfte är att inaktivera alla återstående spår av oreagerat biotin. Cellerna lyseras därefter, varefter agarosimmobiliserad streptavidin tillsätts för att fälla ut de biotinylerade proteinerna. Analys utförs vanligtvis via western blotting, vilket tillåter det relativa cellytans uttryck av olika prOteiner att kvantifieras.
På grund av grunden för denna analys är den endast lämplig för användning med proteiner som har delar som exponeras för den extracellulära miljön. Multipass-transmembranproteiner, vilka sannolikt har ett antal reaktiva lysiner inom sina slingregioner, är mest mottagliga för denna metod, medan en-pass-proteiner tenderar att vara mindre mottagliga för att biotinyleras. Även i dessa fall finns det kvar en möjlighet att konformationsförändringar eller intermolekylära interaktioner kan utesluta vissa reaktiva ställen, vilket resulterar i ett lägre än förväntat biotinyleringsutbyte.
Bestämning av internaliseringshastigheten för cell-ytproteiner genom biotinylering
Principerna för denna analys är i stor utsträckning liknande de för cellytbiotinylering, med ett antal undantag, varav den viktigaste är användningen av reversibla biotinyleringsreagenser. Biotingrupperna (av dessa) har disuLfidbindningar, inom deras strukturer, som är mottagliga för reduktionsmedel; Detta utnyttjas för att säkerställa att endast cellytproteiner som tas in i intracellulära ställen under analysperioden lämnas biotinylerade. En analys utförs vanligtvis på följande sätt. Cellerna tvättas först och biotinyleras med kalla reagenser, därefter återintroduceras cellodlingsmedium vid 37 ° C och cellerna returneras till inkubatorn; Detta medför att de märkta cell-ytproteinerna genomgår endocytos. Reduktionsmedlet glutation - som inte kan penetrera membranet - tillsättes därefter för att bryta disulfidbindningarna hos biotindelarna fästa vid proteiner kvar på cellytan. Slutligen omsätts de brutna disulfidbindningarna med jodacetamid, förbrukar de labila tiolgrupperna och förhindrar bindningarna från att reformera. Som tidigare lyseras cellerna sedan och de märkta proteinerna utfälles med användning av streptavidin-agaros.
Begränsningarna skivanAnvänds i föregående avsnitt gäller också här på grund av likheterna som delas mellan metoderna. Dessutom är det värt att komma ihåg att temperaturförskjutningarna involverade i denna analys utesluter den exakta bestämningen av hur mycket protein som endocyteras för varje tidstakt, särskilt när det gäller snabbt internaliserade eller snabbt återvinningsproteiner. Analysen ger därför endast en semiquantitativ uppskattning av endocytiska hastigheter. Total intern reflektionsfluorescensmikroskopi kan användas för att spåra upptaget av varje laddad vesikel och ge en mer exakt mätning av kinetiken för endocytos. Det kan därför tillhandahålla ett mycket användbart komplement till denna analys, förutsatt att en fluorescensmärkt taggad chimär konstruktion av proteinet av intresse är tillgängligt 11 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bestämning av relativ cell-ytproteinuttryck i astrocyter genom biotinylering
OBS: Här illustrerar vi tillämpningen av denna biotinyleringsteknik på studien av effekterna av den extracellulära matrismolekylen laminin på lokalisering av cellytan av den vattenpermeabla kanalen aquaporin-4 (AQP4). Specialmaterial som krävs för denna analys innefattar sulfo-NHS-LC-biotin och streptavidin-agarosharts (se tabell över material ).
- Genom att använda metoden som skisseras i Noel et al. 12 , bereda kulturer av kortikala astrocyter ungefär 2 veckor före analysen och odla dem i 75 cm 2 ventilerade odlingsflaskor. När astrocyter är 80 - 90% konfluenta, lossa dem från odlingsytan med hjälp av 0,05% trypsin och sedan passera dem 1: 3.
- Vid 48 h före analysen, då cellerna igen är 80-90% konfluenta, passerar astrocyter 1: 3 (redovisning för cHänger i odlingsformatet) på 60 mm cellodlingsdiskar så att de är> 70% konfluenta på dagen då experimentet ska äga rum. Se till att cellerna fördelas jämnt mellan rätterna.
- Vid 16 timmar före analysen pipetteras laminin i odlingsmedium till en slutlig koncentration av 24 nM och inkuberas vid 37 ° C.
- Omedelbart före analysen, förbereda följande och placera sedan på is eller kylskåp: CM-PBS (100 mg / L MgCl2 · 6H2O och 100 mg / L CaCl2 i 1X PBS, pH 7,4), biotinbuffert (0,5 Mg / ml sulfo-NHS-LC-biotin i CM-PBS), släckningsbuffert (50 mM NH4CI i CM-PBS), lysbuffert (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM glycin, 150 mM NaCl och 5 mM EDTA, 1% triton X-100, 1X proteashämmare-cocktail), 3X laddningsbuffert (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% glycerol, 300 mM DTT och 0,01% bromfenolblått) och tvättbuffert Tris (pH 7,4), 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1X proteashämmare-cocktail).
- RemOve-skålar som håller astrocytkulturerna från inkubatorn och kasserar mediet.
- Tvätta cellerna tre gånger med 4 ml kyld CM-PBS och placera disken på krossad is.
- Pipettera 2 ml biotinbuffert i varje brunn och lut försiktigt skålarna fram och tillbaka några gånger för att säkerställa fullständig täckning. Lämna på is i 30 minuter.
- Ta av biotinbufferten med hjälp av en aspirator och ersätt med 4 ml släckningsbuffert. Lämna på is i 10 minuter.
- Aspirera släckningsbufferten och ersätt med en ekvivalent volym av samma. Återigen, lämna på is i 10 min.
- Kassera släckningsbufferten och tvätta celler tre gånger med 4 ml kyld CM-PBS.
- Skrapa celler i 1 ml kyld CM-PBS med hjälp av en cellliftare och överför suspensionen till mikrocentrifugröret.
- Pelletsceller genom centrifugering vid 100 xg under 3 min. Kassera supernatanten och re-suspendera cellerna i 500 | il lysisbuffert.
- Lämna prov på is i 30 minuter, vortexa var 5: e minut eller plAce dem på en end-end-end rotator vid 4 ° C.
- Centrifugera lysatet vid 14 000 xg under 10 min vid 4 ° C för att pelletsa eventuella detergentolösliga material. Överför supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör.
- Spara 50 μL av detta lysat och tillsätt laddningsbuffert till det. Därefter denatureras genom upphettning vid 95 ° C i ett torrt bad; Detta är "ingångsfraktionen", innehållande både biotinylerade cellytproteiner, såväl som icke-biotinylerade cytosoliska proteiner.
- Förbättra öppningen av en pipettspets genom att avskurna cirka 0,5 cm material från sin ände med hjälp av ett par skarpa saxar. Med hjälp av denna pipettspets överför 75 μL streptavidin-agaros-pärlor (normalt lagrad vid 4 ° C) till lysatet och inkubera vid 4 ° C i 3 timmar på skakan / vippan.
- Eftersom streptavidin-agaros ofta säljs som en uppslamning innehållande 50 volymprocent pärlor, suspenderad i en antimikrobiell lösning, tritureras uppslamningen för att säkerställa att pärlornaSuspenderas jämnt och pipetterar sedan 150 μl suspensionen i varje prov.
- Pellets streptavidin-agaros-pärlor genom centrifugering vid 1500 xg i 30 s vid 4 ° C.
- Spara 50 μL av supernatanten (tillsätt laddningsbuffert och denaturera den vid 95 ° C i ett vattenbad eller värmeblock); Detta representerar den "intracellulära" fraktionen och består huvudsakligen av icke-biotinylerade cytosoliska proteiner.
- Resuspendera de pelleterade pärlorna i 1 ml tvättbuffert och rocka detta under 3 minuter vid 4 ° C. Pelletspärlor (som i steg 1.16) och kassera supernatanten. Upprepa denna process 4x för att minimera icke-specifik bindning av nonbiotinylerade cytosoliska proteiner.
- Pellera pärlorna genom centrifugering (1500 xg i 30 s vid 4 ° C) och kassera den överliggande tvättbufferten. Tillsätt 50 μl 1X laddningsbuffert (utspädd med lysbuffert). Släpp biotin och streptavidin från pärlor genom att denaturera detta vid 95 ° C; Den här fraktionen shoUld innehåller endast biotinylerade cell-ytproteiner ("cell-yta" fraktion).
- Separata inmatningar, cellyta och intracellulära fraktioner genom SDS-SIDA 13 och analysera genom western blotting 14 .
OBS! Medan vi använde en 4 - 20% precast gradientgel i våra experiment bör en 12-14% separeringsgel med ett 4% staplingslager (vardera innehållande 0,1% SDS) räcka för proteiner av intresse i denna studie. En molekylviktstandard av lämpligt storleksintervall bör också användas. Observera att det ibland kan vara en observerbar uppväxling i de uppenbara molekylmassorna av biotinylerade proteiner.
- Separata inmatningar, cellyta och intracellulära fraktioner genom SDS-SIDA 13 och analysera genom western blotting 14 .
2. Bestämning av interna-tionshastighet för cellytaproteiner i astrocyter genom biotinylering
OBS! I det följande beskriver vi ett typiskt puls-chase biotinyleringsexperiment som används i detta fall för att spåra endocytos av AQP4 i astrocyter. DettaMetoden är baserad på den som används av Madrid et al. 15 . Specialmaterial som krävs är sulfo-NHS-SS-biotin, streptavidin-agarosharts, reducerad glutation och jodacetamid (se Materialetabellen ).
- Förbered kulturer av muskortikala astrocyter i 60 mm diskar med hjälp av metoderna som beskrivits i föregående avsnitt. Se till att cellerna är ungefär 70% konfluenta på analysdagen och att varje maträtt innehåller ett ekvivalent antal celler.
- Omedelbart före analysen, förbereda följande och placera på is eller kylskåp: CM-PBS (100 mg / L MgCl2 × 6H2O och 100 mg / L CaCl2 i 1X PBS, pH7,4), biotinbuffert (0,5 Mg / ml sulfo-NHS-SS-biotin i CM-PBS), reducerande buffert (50 mM reducerad glutation, 75 mM NaCl och 75 mM NaOH), släckningsbuffert (50 mM jodacetamid, 1% BSA, i CM-PBS) Lysisbuffert (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM glycin, 150 mM NaCl och 5 mM EDTA, 1% triton X-100, 1X-proteashämmare-cocktail), 3X laddningsbuffert (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% glycerol, 300 mM DTT och 0,01% bromfenolblått) och tvättbuffert (10 mM Tris, pH 7,4, 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% triton X-100, 1X proteashämmare-cocktail).
- Förbered färskcell odlingsmedium (DMEM kompletterat med 10% Fetal Bbovine Serum (FBS), 1% penicillin / streptomycin och 1% L-glutamin) och placera det i ett 37 ° C vattenbad.
- Ta bort astrocytkulturer från inkubatorn och aspirera mediet med hjälp av en aspirator.
- Tvätta cellerna tre gånger med 4 ml kyld CM-PBS och placera disken på krossad is.
- Pipettera 3 ml biotinbuffert i varje maträtt, luta disken fram och tillbaka några gånger för att säkerställa att bufferten är välfördelad och lämna den på is i 30 minuter.
- Aspirera biotinbuffert och ersätt det med 5 ml varmt medium. Inkubera en odlingsskål vid 37 ° C i 15 minuter och en andra skål vid samma temperatur i 30 min. Lämna en annan maträtt på 46; C som 0 min-provet.
- Vid slutet av inkubationsperioden, kassera mediet och tvätta cellerna tre gånger med 4 ml kyld CM-PBS. Pipettera 6 ml reducerande buffert över cellerna och låt på is under 15 minuter.
- Ta bort reducerande buffert och ersätt sedan med 6 ml färsk reduktionsbuffert. Placera på is i ytterligare 15 minuter.
- Ta bort reducerande lösning och ersätt med 6 ml släckningsbuffert. Lämna på is i 15 minuter.
- Upprepa släckningssteget en gång till.
- Kassera släckningsbuffert och tvätta celler tre gånger med 4 ml kyld PBS.
- Skrapa celler i 1 ml kyld PBS med hjälp av en celllyftare och överför suspensionen till ett mikrocentrifugrör.
- Pelletsceller genom centrifugering vid 100 xg under 3 min. Kassera supernatanten och resuspendera cellerna i 500 μl lysisbuffert.
- Låt detta på is i 30 min och virvel varje 5 min. Alternativt kan du placera proverna på en roterare med slut-ände vid 4 ° C under denna varaktighet.
- Centrifugera lySate vid 14 000 xg i 10 min vid 4 ° C för att pelleta det detergentolösliga materialet och sedan överföra supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör. Spara 50 μl av detta lysat, tillsätt laddningsbuffert till det och denaturera vid 95 ° C i ett torrt bad; Detta är "ingångsfraktionen", innehållande både biotinylerade endocytoserade proteiner, såväl som nonbiotinylerade proteiner.
- Lägg till 150 μL av streptavidin-agaros-uppslamningen till lysatet och inkubera vid 4 ° C i 3 timmar på skakan / vippan. Se 1.15 för ytterligare information om detta steg.
- Pellets streptavidin-agarospärlor genom centrifugering vid 1500 xg i 30 s vid 4 ° C.
- Resuspendera pärlor i 1 ml tvättbuffert och rocka i 3 minuter vid 4 ° C. Pelletspärlor (enligt steg 2.18) och kassera supernatanten. Upprepa denna process 4x för att minimera icke-specifik bindning av nonbiotinylerade cytosoliska proteiner.
- Pelletspärlor genom centrifugering vid 1 500 xg i 30 s vid 4 ° C och kassera oveKvarvarande tvättbuffert. Tillsätt 50 μl 1X laddningsbuffert (utspädd med lysbuffert). Släpp biotin och streptavidin från pärlor genom denaturering vid 95 ° C; Denna fraktion bör endast innehålla internerade cell-ytproteiner ("endocytoserad" fraktion).
- Separata inmatningar, cellyta och obundna fraktioner genom SDS-SIDA 13 och analysera med western blotting 14 .
OBS! Medan vi använde en 4 - 20% precast gradientgel i våra experiment bör en 12-14% separeringsgel med ett 4% staplingslager (vardera innehållande 0,1% SDS) räcka för proteiner av intresse i denna studie. En molekylviktstandard av lämpligt storleksintervall bör också användas. Observera att det ibland kan vara en observerbar uppväxling i de uppenbara molekylmassorna av biotinylerade proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Användning av cellytbiotinylering för att utvärdera plasmamembranuttrycket av AQP4 i astrocyter
Lamininbehandlade astrocytkulturer och obehandlade kontrollceller utsattes för cellytabiotinylering med användning av de beskrivna metoderna. Biotinylerade proteiner utfälldes med agaros-konjugerad streptavidin och separerades sedan via SDS-PAGE. Cellytafraktioner undersöktes för AQP4 och p-dystroglykan (P-DG) som en cellöverladdningskontroll, medan de inmatade och intracellulära fraktionerna blottades för AQP4 och p-aktin ( Figur 1 A ) som en laddningskontroll. Bandintensiteter för cellytafraktionen kvantifierades via densitometri och AQP4-nivåer för varje uppsättning av celler normaliserades först mot p-DG-värden, och dessa förhållanden normaliserades sedan mot de för kontrollcellerna. Histogrammet ( Figur 1 B ) representerar medelvärdena ± SEM för tre oberoende experiment. Lamininbehandling ger i genomsnitt en nära 2X ökning i AQP4 uttryckt vid cellytan.
Undersökning av endocytisk frekvens av AQP4 med användning av biotinylering
AQP4 endocytos i astrocyter spårades under en 30 min period. I korthet användes en klyvbar biotinanalog för att märka ytproteiner i 3 skålar av astrocyter. Cellerna skiftades till 37 ° C under 0, 15 respektive 30 minuter, under vilka de märkta proteinerna internaliserades. Märkning som förblev på ytan avlägsnades sedan med användning av ett reduktionsmedel och endocytoserade proteiner fälldes ut med agaros-konjugerad streptavidin. Efter separering via SDS-PAGE undersöktes dessa sedan för AQP4 ( Figur 2 A ). AQP4-nivåer kvantifierades med användning av densitometri och de värden som motsvarar15 och 30 min tidpunkter normaliserades till de för 0 min-provet. Histogrammet ( Figur 2 B ) representerar de genomsnittliga värdena ± SEM för fyra sådana experiment.
Figur 1 . AQP4-uttryck vid cellytan i närvaro av laminin. (A) Cell-ytan, intracellulär och total (Input) fraktioner från obehandlade astrocyter (-LN) och astrocyter behandlade med 24 nM laminin-111 (+ LN) undersöktes för AQP4 och P-DG. (B) Histogram som illustrerar skillnaderna i cellytnivåerna hos AQP4 obehandlade och lamininbehandlade astrocyter, normaliserade mot p-DG-nivåer. Värden representerar normaliserade genomsnittliga pixelintensiteter ± SEM, uttryckt i förhållande till värdena för kontrollcellerna. Asterisken anger en statisticaLikt signifikant ökning av AQP4, bestämd av en två-tailed studentens t- test (n = 3, * p = 0,033). Denna siffra har modifierats från Tham et al. 16 Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 . AQP4-internalisering i astrocyter. (A) Proteiner interna-rade av astrocytkulturer vid 0, 15 och 30 min undersöktes för AQP4. (B) Histogram som sammanfattade internaliseringshastigheterna för AQP4 för 4 oberoende experiment, normaliserade mot värden för 0 min-tidpunkten. Asterisken indikerar en statistiskt signifikant ökning av mängden AQP4 endocytoserad mellan 15 och 30 minuter, bestämd av en två-svansEd Studentens t- test (n = 3, * p = 0,017). (C) När glutation används för att bryta disulfidbindningen i den klyvbara biotinanalogen reduceras bidraget från cellytan AQP4 till den biotinylerade fraktionen kraftigt, vilket resulterar i en tydlig skillnad mellan 0 och 15 min-proverna (C, övre vänstra ) . När detta steg utelämnas, gör signalen som härstammar från cellytans poolen förändringen mellan de 2 tidspunkterna som inte kan detekteras (C, övre högra) . Denna siffra har modifierats från Tham et al. 16 Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ändringar:
Eftersom dessa metoder var konstruerade för användning med vidhäftande celler har vi specificerat användningen av PBS innehållande 100 mg / L MgCl2 · 6H20 och
100 mg / 1 CaCl2 (CM-PBS) för tvättstegen och som bas av vissa buffertar för att säkerställa att cellerna förblir bundna till odlingsytan och att cellcellsförbindelserna inte störs. Protokollen kan emellertid också appliceras på icke-adherenta celltyper om cellerna pelleteras mellan varje steg i proceduren. I dessa fall kan CM-PBS ersättas med PBS.
Dessutom är det viktigt att notera att alla de villkor som nämns här är specifika för detta protokoll och bör endast betraktas som grova riktlinjer om metoderna ska användas för andra tillämpningar. Särskilt bör man självständigt kontrollera att detergentutvinningsförfarandet är lämpligt för dettaR-celltyp och att centrifuginställningarna är lämpliga för celltypen och för streptavidin-agaros-pärlorna som används.
Slutligen, om det finns farhågor angående icke-specifik bindning och / eller överdriven bakgrund, kan man ersätta streptavidin med de olika andra avidinformer som för närvarande finns tillgängliga på marknaden. Deglykosylerad avidin har till exempel signifikant lägre affinitet för lektiner och för negativt laddade molekyler, såsom DNA.
Felsökning och kontroller:
Medan de förfaranden som granskas i denna rapport är ganska enkla bör man vara medveten om ett antal kritiska problem som potentiellt kan påverka resultatet av experimentet. För det första, under det att båda analyserna är starka beroende av de membran-impermeanta naturen hos de sulfaterade biotinyleringsreagenserna, kan vissa betingelser förorsaka att plasmamembranet i cellerna störs, vilket resulterar i ett visst intracellulärt proteinIns biotinylerade. För att kontrollera för denna möjlighet föreslås det att biotinylerade fraktioner ska sonderas för mål som inte är uttryckta i plasmamembranet, såsom p-aktin.
Man bör vara försiktig med att följa de korrekta lagringsförhållandena för biotinyleringsreagenserna (vanligen 4 eller -20 ° C, med någon form av uttorkning), eftersom dessa kan misslyckas på annat sätt på grund av deras högkänsliga natur. Det är emellertid god praxis att sondra de ingående, biotinylerade och nonbiotinylerade fraktionerna med streptavidin-HRP för att fastställa att biotinylering faktiskt har inträffat och att de biotinylerade proteinerna har utfällts effektivt (vilket kommer att framgå av avsaknaden av en signal i Icke-biotinylerad fraktion). Detta bör göra det möjligt att eliminera risken för defekta reagens.
Reduktion av disulfidbindning är ett viktigt steg i det endocytiska biotinyleringsförfarandet, eftersom det säkerställerAtt endast internaliserade proteiner kommer att isoleras i den biotinylerade fraktionen. Införande av kontroller där det reducerande reagenset utelämnas ( Figur 1 C ) medger att man får ett intryck av effekten av behandlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta projekt stöddes av Canadian Institute of Health Research PG # 20R47867.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50 | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | #1610404 | |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA) | Bio-Rad | #1610729 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610611 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21331 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Iodoacetamide | Bio-Rad | #163-2109 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich | L2020 | Thaw on ice. |
| L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15) | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5) | Leica Biosystems | B-DG-CE | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G6529 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 862010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Streptavidin agarose resin | Thermo Fisher Scientific | #20347 | |
| Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody | Alomone | AQP-004 | |
| Tris base (Trizma base) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
- Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes. J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).
- Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).
- Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase. Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).
- Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).
- Li, Y., Cam, J., Bu, G. Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction. Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).
- Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R. Science. 91 (2358), 243-245 (1940).
- Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates. Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).
- Green, N. M. Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay. Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).
- Korpela, J. Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research. Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J Vis Exp. (69), e4450 (2012).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. (92), e51805 (2014).
- Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes. J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Madrid, R., et al. Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes. EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).
- Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes. PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).
