Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لوصف تقنية تضخيم بريون بسيطة وسريعة وفعالة، طريقة التحويل في الوقت الحقيقي التي يسببها مهتز (RT-كويك).
Abstract
أسلوب RT كويك حساسة في المختبر بريون الخلية الحرة تضخيم مقايسة تستند أساسا إلى المصنف ميسفولدينج وتجميع المؤتلف بريون البروتين (PrP) الركيزة باستخدام بذور بريون كقالب للتحويل. RT كويك هو أسلوب رواية الفائق الذي يماثل في الوقت الحقيقي البلمرة المتسلسل (PCR). ويستند الكشف عن نمو فيبريل اميلويد صبغ ثيوفلافين T، الذي فلوريسسيس عند محددة من التفاعل مع البروتينات الغنية ᵦ--ورقة. وهكذا، يمكن الكشف عن تشكيل اميلويد في الوقت الحقيقي. لقد حاولنا في تطوير اختبار فرز غير الغازية يمكن الاعتماد عليها لاكتشاف البريونات (CWD) مرض الهزال المزمن في استخراج البراز. هنا، نحن تكيفت على وجه التحديد تقنية RT كويك تكشف PrPSc البذر النشاط في براز CWD المصابة سيرفيدس. في البداية، كان نشاط بذر مقتطفات البراز ونحن على استعداد منخفضة نسبيا في الرايت-كويك، ربما بسبب مثبطات الإنزيم المحتملة في المواد البرازية. لتحسين النشاط بذر مقتطفات البراز وإزالة مثبطات الإنزيم المحتملة، ونحن تجانس عينات البراز في المخزن مؤقت الذي يحتوي على المنظفات ومثبطات البروتياز. كما قدمنا العينات لمنهجيات مختلفة تركز PrPاتفاقية استكهولم على أساس ترسيب البروتين باستخدام حمض فوسفوتونجستيك الصوديوم، وقوة الطرد المركزي. أخيرا، تم اختبار مقتطفات البراز بالامثل RT-كويك التي شملت استبدال الركيزة في البروتوكول تحسين حساسية الكشف. وهكذا أنشأنا بروتوكولا للكشف عن حساسية بريون CWD البذر النشاط في براز سيرفيدس ما قبل السريرية والسريرية التي RT-كويك، التي يمكن أن تكون أداة عملية لتشخيص CWD غير الغازية.
Introduction
أمراض بريون أو الاعتلال الاسفنجي (تسي) اضطرابات الأعصاب بما في ذلك كروتزفيلد-جاكوب (جاكوب) في البشر، والتهاب الدماغ الاسفنجي البقري (مرض جنون البقر) في الماشية، الرعاش في الأغنام والماعز، والهزال المزمن المرض (CWD) في سيرفيدس 1،2. الاسفنجي تتميز بالمظهر الاسفنجي مميزة وفقدان الخلايا العصبية في الدماغ. طبقاً لفرضية "البروتين فقط"، البريونات هي تتألف أساسا من الحزب الثوريSc ('المحكمة العليا' الرعاش) 3، isoform تجمعات من البروتين ترميز المضيف بريون الخلوية، الحزب الثوريج. PrPSc ناتجة عن تحويل PrPج إلى المطابقة التخصيب في5، 4،ᵦ-أوراق6 التي يمكن أن تعمل كبذرة لربط وتحويل الجزيئات PrPج الأخرى. جزيئات PrPاتفاقية استكهولم الذي تم إنشاؤه حديثا أدرجت في 7،بوليمر تنامي8 الذي اخترق ليغومرات الأصغر، أسفرت عن أكبر عدد من الأنوية المعدية. PrPاتفاقية استكهولم هو عرضه للتجميع ومقاومة جزئيا إلى 9،البروتياز10.
CWD يؤثر الأيائل البرية والمستزرعة (سيرفوس canadensis)، والوعول (هيميونوس أودوكويليوس)، والأبيض – الذيل الغزلان (يوم الذكرى العالمي؛ فيرجينيانوس أودوكويليوس)، موس (السيس السيس)، والرنة (رانجيفير تاراندوس تاراندوس) 11،،من1213. ويعتبر هذا المرض بريون المعدي أكثر مع انتقال أفقي يفضلها سيرفيد التفاعلات والثبات البيئي للعدوى 14،15. خلافا لسائر الأمراض بريون حوصر فيها تراكم PrPاتفاقية استكهولم والعدوى إلى المخ، في CWD هذه توجد أيضا في الأنسجة المحيطية وسوائل الجسم مثل اللعاب والبول والبراز 16،17، 18.
إيمونوهيستوتشيميستري يعتبر معيار الذهب لتشخيص CWD الكشف عن توزيع PrPاتفاقية استكهولم والإسفنجي آفات 19،20. أليسا وفي حالات نادرة، كما تستخدم لطخة غربية لتشخيص CWD. وهكذا، تشخيص المرض بريون الحالي يعتمد أساسا على اكتشاف البريونات في الأنسجة بعد الوفاة. يتوفر التشخيص الوفاة ل CWD بأخذ اللوزتين أو خزعات يمنى الشرج الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالغشاء المخاطي (رامالت)؛ ومع ذلك، هذا الإجراء الغازية ويتطلب القبض على الحيوانات. وهكذا، سيكون استخدام العينات الوصول إليها بسهولة، مثل البول والبراز، طريقة عملية لكشف بريون CWD. بيد تلك الفضلات هاربور المنخفضة نسبيا لتركيزات البريونات الكشف عن الحد الأدنى لطرق التشخيص الحالية. ونتيجة لذلك، هناك حاجة إلى أداة تشخيصية أكثر حساسية وعالية إنتاجية. في المختبر نظم التحويل، مثل البروتين misfolding التضخيم دوري الاعتداء (بمكا) 21، اميلويد بذر المقايسة، والتحويل في الوقت الحقيقي التي يسببها مهتز (RT-كويك) مقايسة 22،23، 24 أدوات قوية جداً استغلال قدرة ذاتية نشر PrPاتفاقية استكهولم على تقليد في المختبر بريون عملية التحويل وتضخيم وبالتالي وجود كميات دقيقة من الحزب الثوري الشعبياتفاقية استكهولم إلى مستويات لا يمكن اكتشافها 25 ،26. ومع ذلك، يأخذ الأسلوب RT كويك، استفادة حقيقة أن المنتج تحويل أثري في هيكل الثانوية β-ورقة تحديداً ربط ثيوفلافين تي (ال تي). ولذلك، ينمو PrP المؤتلف (ربرب) عند تحويل المصنف إلى ييفات اميلويد الذي ربط ال تي، وهكذا يمكن الكشف عن في الوقت الحقيقي عن طريق قياس الأسفار من ال تي معبراً عنها بوحدات fluorescence النسبي (رفو) مع مرور الوقت. مجرد رصد، يمكن استخدامها في رفو لتقييم أنشطة بذر النسبي، والمعايير الكمية مثل مرحلة انتقالية. يمثل مرحلة انتقالية الوقت (ح) المطلوب للوصول إلى العتبة، خلال الذي ربرب التحويل في المرحلة المبكرة من رد فعل أقل من الحد الكشف من الأسفار ال تي. عند نهاية المرحلة الفاصلة الواضحة، الملازمة لتشكيل نواة اميلويد كافية (نويات/استطالة)، الأسفار ال تي يتجاوز مستوى الحد الأدنى ويصبح إيجابيا. نمو اميلويد ويمكن الكشف عن ييفات في الوقت الحقيقي، و الحزب الثوري الأولىاتفاقية استكهولم أو بذر النشاط الواردة في العينة يتم تضخيمه بتجزئة الذي يولد المزيد من البذور. هذه البذور يدفع بدوره إلى مرحلة أسي سريع لنمو الألياف اميلويد.
لأن هذا التحليل قادرة على كشف منخفضة 1 fg PrPاتفاقية استكهولم 24، حساسية عالية يؤهل هذا الأسلوب لتحقيق الوفاة أنتي أو التشخيص غير الغازية عن طريق الكشف عناتفاقية استكهولم من الحزب الثوري الشعبي في مختلف الأنسجة الطرفية، والإفرازات أو غيرها أنواع العينة إيواء مستويات منخفضة من العدوى. RT كويك يوفر بالتأكيد مزايا أكثر من غيرها فحوصات لإمكانية تكرار نتائج والتطبيق العملي، والسرعة (أقل من 50 ح) وتكاليف منخفضة مقارنة بالمقايسة. وهو يتجنب التعقيدات التقنية مثل سونيكيشن المستخدمة في بمكا؛ أيضا، فإنه يتم في ميكروسكوبية مختومة الشريط الذي يقلل من خطر تلوث الهباء الجوي لكل بئر. ويمكن تنسيق متعدد جيدا تحليل عينات تصل إلى 96 في نفس التجربة. لمواجهة هذه المشكلة المتكررة من إيجابيات كاذبة والتحويل التلقائي من ربرب في فحوصات التحويل في المختبر تنفيذ عتبة (الوقف) في الرايت كويك مفيد جداً. في الواقع، استناداً إلى نتائج المراقبة السلبية (رفو متوسط العينات السلبية + 5 SD 27)، أساس هو إعداد من الذي يمكن أن يتم التمييز بين نماذج إيجابية وسلبية. وهكذا يمكن أن تساعد استخدام replicates أربعة لكل عينة لتحديد عينة إيجابية عند 50 في المائة على الأقل من replicates إظهار إشارة إيجابية، أي عبور وقف إنتاج المواد الانشطارية 28. ليس مطلوباً التماثل بين البذور والركيزة في الرايت-كويك، كما مثلاً في دراسة سابقة، ربرب الهامستر تم العثور على أن تكون أكثر حساسية ركيزة الركيزة مثلى في البشر PrPجنون بالمقارنة مع المصنف والمصنف الرعاش الأغنام ردود فعل 29. ربرب تشيميريك الهامستر-الأغنام كما اقترح أن تكون ركيزة أكثر مناسبة من ربرب البشرية لاكتشاف البريونات جاكوب المتغير البشري 30. وهكذا، استخدام ركائز ربرب من مختلف الأنواع شائعة جداً في هذا التحليل. هذا التحليل قد طبقت بنجاح على عدة أمراض بريون، مثل متفرقة جاكوب 31،،من3233، الجنرالأمراض بريون آتيك 34ومرض جنون البقر 35،،من3637والرعاش 23،36و CWD 38،39،،من4041، 42. الدراسات باستخدام معالجة النخاعي وكل الدم واللعاب والبول كما البذور في الرايت كويك كانت كلها ناجحة للكشف عن الحزب الثوريSc 38،39،،من4041، 42-لتعزيز قدرة الكشف في عينات مثل بلازما الدم التي قد تحتوي على مثبطات لتشكيل اميلويد، Orrú وآخرون. ووضعت استراتيجية لإزالة الموانع المحتملة لتشكيل اميلويد بتمشيط PrPSc إيمونوبريسيبيتيشن (IP) الخطوة و RT-قويك (2011)، والمسمى '' زيادة قويك '' المقايسة (إكويك). وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت خطوة استبدال الركيزة بعد ~ 24 ساعة وقت رد الفعل من أجل تحسين الحساسية. وفي نهاية المطاف، ك ag من الحزب الثوري الشعبياتفاقية استكهولم منخفضة 1 كان يمكن كشفها بواسطة إكويك 30.
من أجل تنقية مقتطفات البراز وإزالة مثبطات الإنزيم الممكنة في البراز، كانت تجانس عينات البراز التي جمعت في المراحل السريرية والسريرية من الأيائل على العدوى عن طريق الفم التجريبية في مخزن يحتوي على المنظفات ومثبطات البروتياز. كذلك قدمت مقتطفات البراز إلى منهجيات مختلفة تركيز PrPاتفاقية استكهولم في العينات التي تستخدم ترسيب البروتين عن طريق الصوديوم فوسفوتونجستيك هطول الأمطار الحمضية (ناتا). الأسلوب هطول الأمطار ناتا، وصف لأول مرة من صفر et al. 43، يستخدم لتركيز PrPاتفاقية استكهولم في عينات الاختبار. الحضانة ناتا مع نتائج العينة في هطول الأمطار التفضيلية PrPSc بدلاً من الحزب الثوريج. ومع ذلك، الآلية الجزيئية لا تزال غير واضحة. وساعدت هذه الخطوة أيضا احتواء ومنع التحويل التلقائي من ربرب، الذي لوحظ في بعض الحالات. أخيرا، تم اختبار مقتطفات البراز بالامثل RT-كويك استخدام الماوس ربرب (aa 23-231) كركيزة، بما في ذلك استبدال الركيزة في البروتوكول تحسين حساسية الكشف.
وتبين النتائج هنا أن هذه الطريقة تحسن يمكن الكشف عن تركيزات منخفضة جداً من البريونات CWD، ويزيد من حساسية الكشف والتحديد في عينات البراز مقارنة ببروتوكول دون استبدال هطول الأمطار والركيزة نابتا. يحتمل أن هذا الأسلوب يمكن تطبيقه على الأنسجة وسوائل الجسم الأخرى، ويمكن أن تكون ذات فائدة كبيرة لمراقبة CWD في سيرفيدس البرية والاسيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-RT كويك "مواد البراز باستخدام"
هوموجيناتي- استخراج إعداد البراز سيرفيد
- جعل البراز بإضافة 1 غرام مواد البرازية 10 مل براز استخراج المخزن المؤقت (فوسفات الصوديوم 20 مم، الرقم الهيدروجيني 7.1، 130 ملم كلوريد الصوديوم، 0.05% 20 توين، 1 مم بمسف والعاشر 1 إكمال مثبطات البروتياز، يدتا مجاناً) لإعطاء تركيز نهائي 10% (w/v). يمكن إعداده قبل الاستخدام المخزن المؤقت التجانس وتخزينها في-20 درجة مئوية.
- هوموجينيزي البراز الكريات (ز 1) والمخزن المؤقت (10 مل) في أنابيب (مثلاً، جينتليماكس م أنابيب) باستخدام ديسوسياتور مع برنامج محدد سلفا من الشركة المصنعة للبروتينات لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة مرتين أو ثلاث مرات حتى يتم تجانس عينات البراز تماما في المخزن المؤقت-
- ختم الأنابيب مع بارافيلم ووضعها على هزاز شاكر منصة أو ذات أجنحة دوارة لتفريخ ح 1 في درجة حرارة الغرفة-
- الطرد المركزي هذه الأنابيب في 18,000 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة-
- جمع مقتطفات سوبيرناتانتس التي تحتوي على البروتين والكوة إلى 1.5 مل أنابيب. يمكن تخزين مختبرين في-80 درجة مئوية لزيادة التطبيقات.
- مقتطفات تركيز PrP اتفاقية استكهولم في البراز
ملاحظة: أجل تركيز البريونات CWD في عينات استخراج البراز، مما يؤدي إلى تحسين حساسية الكشف بواسطة RT-كويك، تتم إضافة خطوة ترسيب بروتين لهذا البروتوكول.- ناتا هطول الأمطار الأسلوب
- ميليلتر 250 إضافة 10% (w/v) من دوديسيل ن ساركوسيناتي (ساركوسيل) إلى 1 مل بروتين البراز استخراج لإعطاء تركيز نهائي ساركوسيل 2% (v/v)-
- ختم الأنابيب التي تحتوي على النماذج مع بارافيلم واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تحت الهز المستمر في دورة في الدقيقة 1,400 في ثيرموميكسير.
- ضبط المزيج من استخراج البروتين البراز وساركوسيل مع حل أسهم التي تتضمن 10% (w/v) من الصوديوم وحمض فوسفوتونجستيك و 170 ملم من كلوريد المغنيسيوم ودرجة الحموضة 7.4 للحصول على تركيز 0.3% (w/v) حمض فوسفوتونجستيك الصوديوم في العينات نهائي.
- احتضان العينات في 37 درجة مئوية ح 2 مع الهز المستمر في 400 لفة في الدقيقة-
- الطرد المركزي العينات من 14 درجة مئوية لإزالة 30 دقيقة في غ. س 15,800 سوبيرناتانتس بعناية-
- تغسل الكريات التي ريسوسبيندينج عليها في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (10 ملم تريس-Cl، درجة الحموضة 7.5، 100 ملم كلوريد الصوديوم، 0.5% تريتون العاشر 100، يدتا 10 ملم، 0.5% صوديوم ديوكسيتشولاتي (w/v)، و 0.1% ساركوسيل (w/v))-
- الطرد المركزي العينات من 14 درجة مئوية لإزالة 15 دقيقة في غ. س 15,800 سوبيرناتانتس بعناية-
- ريسوسبيند الكريات في 100 ميليلتر (1/10 الحجم الأصلي للبروتين البراز استخراج) RT كويك تمييع العازلة.
ملاحظة: أعد RT كويك تمييع العازلة (pH 6.9، 130 ملم كلوريد الصوديوم وفوسفات الصوديوم 20 مم والملحق X N2 1، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% (w/v)) قبل الاستخدام. إجمالي حجم 10 مل يتم تصفيتها من خلال عامل تصفية حقنه أكروديسك 0.2 ميكرون باستخدام المحاقن وثم تخزينها في-20 درجة مئوية حتى استخدام. - تخزين العينات ناتا تعامل في-20 درجة مئوية حتى الاستفادة منها في التحليل RT كويك-
- المقايسة RT كويك
- تعد حلاً أسهم ال تي طازجة 10 ملم (0.032 ز لل تي في 10 مل من مزدوجة المقطر ح 2 س)-
- بذل إضعاف 01:10 من ال-T حل الأسهم في مزدوجة المقطر ح 2 س لجعل تركيز نهائي لل تي 1 مم عامل التصفية من خلال حقنه أكروديسك 0.2 ميكرون التصفية باستخدام المحاقن.
- ذوبان الجليد الماوس المؤتلف الحزب الثوري (ربرب، aa 23-231) الركيزة (10 ميكروغرام/مل في رد فعل RT كويك) المخزنة في-80 درجة مئوية في مدت
- تحميل 500 ميليلتر من الركازة ربرب في وقت واحد إلى 100 كاتشين حجم الاستبعاد تصفية microtubes وأجهزة الطرد المركزي في 14,000 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (أنبوب/عامل تصفية واحد يمكن استخدامها تصل إلى مرتين).
- نقل الركازة التيد في أنبوب معقم 1.5 مل وإبقائه في 4 درجات مئوية حتى استخدام.
- "ذوبان الجليد" RT-كويك تمييع العازلة المخزنة في-20 درجة مئوية. المخزن المؤقت لتمييع
- تخفيف تجعل من البذور (استخراج البروتين البراز) في الرايت كويك:
نموذج غير مخفف: استخدام استخراج البروتين البراز مخفف
المخفف 2 x 10 -1
المخفف 2 x 10 -2
المخفف 2 x 10 -3 - إعداد حلول الأسهم RT كويك رد فعل المخلوط:
مخزنة الفوسفات (المالحة برنامج تلفزيوني): 5 س
كلوريد الصوديوم: 2 م الأسهم الحل من كلوريد الصوديوم أعد مزدوجة المقطر ح 2 أولمبيك
يدتا: 100 مم حل الأسهم يدتا أعد مزدوجة المقطر ح 2 أولمبيك - قبل الاستخدام لجميع الحلول (الخطوة 1.3.8)، تصفية كل حل على حدة من خلال عامل تصفية حقنه أكروديسك 0.2 ميكرون باستخدام المحاقن والاحتفاظ بها وعقيمة في درجة حرارة الغرفة- إعداد
- حجم الكلي للمخلوط رد فعل RT كويك وفقا لعدد العينات (98 حجم ميليلتر من رد فعل كل عينة وأربعة يتطابق كل عينة) لاستخدامها بالإضافة إلى 10% من وحدة التخزين هذه للتأكد من أن يكون الخليط يكفي لجميع ردود الفعل.
- استخدام أنبوب 15 مل تحضير الخليط رد فعل RT كويك (فوسفات الصوديوم 20 مم، 300 مم كلوريد الصوديوم، 1 مم يدتا، 10 ميكرون من pH 6.9، ال تي، 10 ميكروغرام/مل ربرب الركازة، والماء المقطر مزدوجة لضبط تركيز ربرب النهائية في رد فعل) استخدام سول الأسهم أوتيونس. مزيج
- كافة الحلول جيدا من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً استخدام ماصة مع الفلتر. تجنب قدر الإمكان استخدام دوامة.
- صب المخلوط في خزان بيبيتينج المتاح 50 مل.
- استخدام ماصة متعددة القنوات لتحميل ميليلتر 98 RT كويك رد فعل خليط في كل بئر من لوحة أسفل الضوئية 96-جيدا-
- إضافة إلى كل RT كويك الرد 2 ميليلتر من غير مخفف أو استخراج الوقت البروتين البراز متسلسل المخفف. اختبار كل عينة في أربعة replicates.
ملاحظة: في كل تجربة، وتخفيف المسلسل من عينات البراز (تتراوح بين غير مخفف 2 × 10 -3) من سالب CWD والتحقق من إيجابية CWD الحيوانات المستخدمة كعناصر سلبية وإيجابية، على التوالي. - ختم اللوحة مع شريط ختم قبل تفرخ في قارئ لوحة في 42 درجة مئوية ح 25 مع دورات متكررة 1 دقيقة مزدوجة المداري الهز (700 لفة في الدقيقة) و 1 دقيقة بالراحة في جميع أنحاء الاحتضان.
- تحديد الأسفار إعدادات القياس:
الإثارة: 450 نانومتر
الانبعاثات: 480 نانومتر
أسفل قراءة، عدد ومضات: 20
كسب يدوي: 1000 (يعتمد على الجهاز)
الوقت التكامل: المايكروثانيه 20 - إزالة اللوحة من قارئ لوحة في نهاية 25 h.
- تدور أسفل اللوحة في 3,000 س ز لمدة 3 دقيقة لتفادي التلوث المحتملة بين الآبار.
- إزالة الختم من اللوحة.
- إعداد لوحة 96-بئر جديدة بإضافة ميليلتر 90 RT كويك رد فعل مزيج يحتوي على الركازة الطازجة والأسفار الطازجة صبغ ال تي كما هو موضح في المقطع 1.3.1 إلى 1.3.6-
- لوحة نقل 10 ميليلتر من كل بئر من اللوحة الأولى إلى 96 أعدت حديثا حسنا.
- ختم لوحة جديدة ومواصلة التحليل RT كويك لإضافية ح 50 اتباع الخطوات الموضحة في الخطوة 1.3.13. هذه الخطوة الإضافية من ح 50 سيجعل إجمالي الوقت رد فعل من حاء 75
ملاحظة: تتم جميع إجراءات الفحص RT كويك إطار السلامة الأحيائية مجلس الوزراء- - جمع البيانات.
- القراءة والوثيقة إشارة الأسفار ال تي لكل بئر كل 15 دقيقة
- جمع البيانات من مجموع الدورات باستخدام برمجيات "تحليل البيانات" ونقلها إلى جدول بيانات مع متوسط ردود الفعل كوادروبليكاتي.
- مؤامرة المتوسطات للبيانات. يتوافق مع المحور س إلى وقت رد الفعل RT-كويك (ح) والمحور الصادي يتوافق مع وحدات fluorescence النسبي (رفو). يتوافق مع كل منحنى إلى إضعاف عينة معروفة.
- في كل تجربة، وترسيم عتبة بحساب قيم عنصر التحكم السلبي يعني أعلى بالإضافة إلى الانحرافات المعيارية 5 كما هو موضح في الحالي نشر الأدب 41-
ملاحظة: جميع replicates التي عبرت عتبة محددة تعتبر إيجابية. إذا كان يقل عن اثنين من أصل أربعة replicates عبور العتبة، ثم يعتبر إيجابية العينة.
2. تنقية المؤتلف بريون البروتين (ربرب)
- نمو المخزون البكتيرية والتعبير عن ربرب
ملاحظة: الإشريكيّة القولونية (كولاي) سلالة رشيد (DE3) تحول مع ترميز ناقل الحيوانات الأليفة-24 تم استخدام الماوس الحزب الثوري (مخلفات 23-231) لإعداد في ربرب.- ذوبان الجليد رصيد والغليسيرول رشيد (DE3) تحول مع الحيوانات الأليفة-24 mPrP(23-231) على مدت
- "الانتصارات رطل" (لوريا بيرتاني) لوحات بتركيز نهائي من كاناميسين 50 ميكروغرام/مل واحتضان بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية. تأكد من أن اللوحات رأسا على عقب لتجنب رطوبة التكثيف في وسائط الإعلام الصلبة المحتوية على البكتيريا. إعداد لوحات اثنين للتأكد من أن يكون النمو في واحد على الأقل من لوحات اثنين.
- إعداد 1 لتر من رطل والاوتوكلاف لجعله عقيما.
- الملحق 1 لتر وسائط رطل العقيمة مع 1 مل من كاناميسين (50 ملغم/مل) و 1 مل من الكلورامفينيكول (34 ملغ/مل).
- بيك مستعمرة واحدة لكل لوح باستخدام حلقة تطعيم المتاح لتطعيم 3 مل من رطل المتوسطة التي تحتوي على كاناميسين والكلورامفينيكول.
- مكان ميني-ثقافات في حاضنة في 37 درجة مئوية مع الرج المستمر 225 لفة في الدقيقة حاء – 5-6
- إضافة ميني-الثقافات بقية الأصلي ل 1 رطل وسائل الإعلام إلى جانب التعبير عن 1 نظام أوتويندوكشن لتحريض التعبير البروتين.
- مكانة الثقافة في دورق 2 لتر، أو أكبر، في حاضنة في 37 درجة مئوية مع الهز المستمر في 200 لفة في الدقيقة حاء 20-24
- تقسيم ثقافة 1 لتر إلى أنابيب الطرد المركزي 4 × 250 مل.
- تدور إلى أسفل الأنابيب التي تحتوي على الثقافة في 3,750 س ز لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
- تجاهل المادة طافية وجمع الكريات البكتيري في أنابيب الطرد المركزي 50 مل، ثم تجميدها في-80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة. الكريات الناتجة يكون وزنه 3 إلى 4 ز لعائد بروتين جيدة.
- إعداد الهيئة إدراج
- ذوبان الجليد بيليه المجمدة (3 إلى 4 ز) عند 37 درجة مئوية لبضع دقائق.
- تجميد بيليه مرة أخرى لمدة 10 دقائق في-80 درجة مئوية وذوبان الجليد مرة أخرى. كرر هذه الخطوة للتجميد والذوبان أكثر مرتين.
- ريسوسبيند بيليه البكتيرية في 1 X الكاشف تحلل (مثلاً ميكس ماستر بوجبوستير) بدقة بيبيتينج. استخدم 5 مل الكاشف ز 1 بيليه البكتيرية. تأكد من مجانسة المزيج تماما.
- احتضان هوموجيناتي على الروك لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
- الطرد المركزي في هوموجيناتي في 16,000 س ز لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
- تجاهل سوبيرناتانتس بصب بعناية من الجميع
- مجانسة الكريات في نفس الحجم من 1 × الكاشف تحلل كما هو مستخدم في الخطوة السابقة.
- احتضان هوموجيناتي لمدة 15 دقيقة على الروك في درجة حرارة الغرفة-
- إضافة كمية كافية من 01:10 (0.1 x) تحلل كاشف للحصول على وحدة تخزين هوموجيناتي إجمالي 40 مل. مزيج من انعكاس للتأكد من تجانسه تماما.
- الطرد المركزي في هوموجيناتي في 7,900 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 ° C.
- تجاهل المادة طافية بعناية صب عليه.
- ريسوسبيند بيليه في 40 مل 0.1 × الكاشف تحلل.
- الطرد المركزي في هوموجيناتي في 16,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 ° C.
- تجاهل المادة طافية بعناية بصب عليه وتخزين بيليه التي تحتوي على جثث إدراجها في-20 درجة مئوية إلى مزيد من المعالجة.
- تنقية البروتين
- ذوبان الجليد الهيئات إدراج عند درجة حرارة الغرفة.
- حل الهيئات إدراج المذابة في 14 مل من م 8 جوانيداين-HCl (هيدروكلوريد غوانيدين ز 38 م 0.1 نابو 4 pH 8.0 والتعبئة بتعليق مع ح 2 س إلى 50 مل؛ لن يتم ضبط الأس الهيدروجيني في الحل النهائي) جعل البروتينات.
- التأكد من تجانسه جيدا من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
- إينكوباتي على الروك في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 50
- ز 18 تحضير راتنج ني-جاتا الخرز (18 جرام لبيليه البكتيرية ز 3 إلى 4)؛ وشطف لهم مع 100 مل مياه باستخدام الفراغ وتصفية أعلى زجاجة 100 مل 0.22 ميكرومتر.
- 18 جرام حبات راتنج ني-الإدارة الوطنية للسياحة في أنبوب 50 مل وإضافة حجم كاف من يشوه المخزن المؤقت (100 ملم فوسفات الصوديوم، 10 مم تريس، pH 8.0، هيدروكلوريد غوانيدين م 6، درجة الحموضة 8) جعل وحدة التخزين النهائي يصل إلى 50 مل.
- حجته الخرز في المخزن المؤقت الذي يشوه لمدة 50 دقيقة على الروك في درجة حرارة الغرفة-
- الطرد المركزي الهيئة إدراج في 16,000 س ز لمدة 5 دقائق لإزالة الحطام غير قابلة للذوبان.
- إضافة المادة طافية على الخرز متوازن وتجاهل الكريات.
- وضع المزيج على الروك لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للبروتين ملزمة على راتنج ني-جاتا.
ملاحظة: تستخدم الخرز كلات النيكل تنقية الحزب الثوري تقارب النيكل. يجعل هذه المنطقة الغنية بالحامض الأميني الطرفي ن للحزب الثوري التقارب لنيكل ثنائي، مما يسمح البروتين لربط النيكل أيونات دون أي صاحب العلامة. - "فبلك أغسل" بالماء لتنظيف خطوط على حد سواء (A و B)-
- تشغيل المخزن المؤقت يشوه (100 ملم فوسفات الصوديوم، 10 مم تريس، pH 8.0، هيدروكلوريد غوانيدين م 6، درجة الحموضة 8) من خلال خطوط على حد سواء (A و B) رئيس الوزراء في النظام (لم يتم إرفاق العمود.)
- تحميل الراتنج على العمود. تأكد من أن تقليل فقاعات الهواء- إرفاق العمود إلى فبلك
- وتشغيل تدرج خطي من 100% يشوه المخزن المؤقت A و 0% من ريفولدينج المخزن المؤقت ب (فوسفات الصوديوم 100 مم، 10 مم تريس، pH 8.0) في البداية إلى 0% يشوه المخزن المؤقت و 100% ريفولدينج المخزن المؤقت قبل النهاية. هذا التحول التدريجي هو تشغيل بمعدل 0.75 مل/دقيقة لمدة 240 دقيقة تدفق ومطلوب للطي السليم من الحزب الثوري الشعبي-
ملاحظة: أثناء عملية تنقية الكروماتوغرافي، PrP التشويه والتحريف هو أولاً ببطء ريفولديد على الراتنج بتطبيق تدرج خطي من المخزن المؤقت ريفولدينج ليحل محل يشوه المخزن المؤقت. هذه الخطوة أيضا إلى إزالة تشاوتروبيك جوانيداين-HCl. - تأكد من المخزن المؤقت ريفولدينج 100% ما زالت تتدفق من خلال العمود الذي يحتوي 30 دقيقة إضافية في 0.75 مل/دقيقة
- شطف خط أ مع المياه تليها شطف المخزن المؤقت (فوسفات الصوديوم 100 مم، 10 مم تريس، ايميدازول 500 ملم، pH 5.8) تجاوز العمود. هذا سيتم تنظيف المخزن المؤقت الذي يشوه التي استبدلت الآن شطف المخزن المؤقت في النظام إكتا.
- البروتين الوت في 2 مل/دقيقة عن طريق تشغيل تدرج خطي لمدة 40 دقيقة من 100% ريفولدينج 0% شطف المخزن المؤقت A في البداية إلى 0% ريفولدينج 100% شطف المخزن المؤقت للمخزن المؤقت للمخزن المؤقت ب.
ملاحظة: سوف تتنافس تركيزات عالية من ايميدازول في المخزن المؤقت شطف PrP ' s ملزمة لنيكل ثنائي. وينبغي أن تبدأ ذروة البروتين الرئيسي الوت حوالي 1/3 الطريق من خلال التدرج.- مشاهدة تشروماتوجرام عن OD 280 شمال البحر الأبيض المتوسط على زيادة-
- جمع الأنابيب التي تحتوي على البروتين في مركز الذروة الكبيرة فقط.
ملاحظة: يتم جمع كسور التيد 2 مل في أنابيب 15 مل. - تمييع البروتين الوارد في الأنابيب فورا مع حوالي 1/3 حجم (1 مل) من المخزن المؤقت للغسيل الكلوي (فوسفات الصوديوم 10 ملم، ودرجة الحموضة 5.8).
- فورا بوضع الأنابيب في مدت
- تجمع البروتين الوتيد الواردة في الأنابيب-
- الفقيرة البروتين في "أشرطة الكاسيت الغسيل الكلوي" (الوزن الجزيئي وقف إنتاج 10 كاتشين).
- وضع الأشرطة في الغسيل الكلوي مبردة قبل المخزن المؤقت (3.6 L) لح 2 في 4 درجات مئوية، ثم نقل الأشرطة في المخزن مؤقت الديال طازجة (3.6 L) ليلة وضحاها. جعل تأكد من أن المخزن المؤقت الغسيل الكلوي تحت التحريض المستمر-
- تصفية البروتين بعد الغسيل الكلوي من خلال عامل تصفية حقنه أكروديسك 0.2 ميكرون باستخدام المحاقن.
- قياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة أدوات مقايسة بروتين اتفاق التعاون الأساسي.
- التركيز أو تمييع إذا لزم الأمر لضبط تركيز البروتين إلى 0.3 مغ/مل.
ملاحظة: التأكد من النقاء من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة وأخذ الأزرق تلطيخ. - جعل مختبرين 1 مل من البروتين في أنابيب ميكروسينتريفوجي وتخزين فورا في-80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى كما هو موضح في البروتوكول RT كويك-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مقتطفات البراز CWD أعدت في 10% (w/v) تمكنوا من البذور RT كويك رد فعل، ومع ذلك كان الحساسية للكشف عن انخفاض 27. استخدام المخزن مؤقت محدد لتجانس البراز كان خطوة حاسمة لتفادي الأسفار خلفية عالية في ردود RT كويك الملازمة للاستخدام الماوس ربرب الركازة بدلاً من ربرب الغزلان التي يسمح لها بالحصول على أدق النتائج 27. إضافة لهطول الأمطار ناتا انخفاض التحويل التلقائي من ربرب في الرايت-كويك (الشكل 1) دون تثبيط تضخيم النشاط البذر لردود فعل (الشكل 2). على الرغم من التضخيم أفضل لوحظ عند معاملة ناتا، كانت إشارات fluorescence الناتجة من عينات البراز CWD الإيجابية لا تزال منخفضة (الشكل 1). وباﻹضافة إلى ذلك، بلغ التضخيم بريون بعض العينات هضبة مستمر في مستويات منخفضة الأسفار. وهذا يشير إلى التشبع من ردود الفعل، التي يمكن أن تكون بسبب التدهور/تمسخ ربرب أو تشكيل المجاميع قبالة الطريق التي تستهلك تجمع ربرب 30. لزيادة تحسين التضخيم البريونات وتعزيز حساسية الكشف، أدمج خطوة استبدال الركيزة في البروتوكول. الأخذ باستبدال الركيزة إلى البروتوكول RT كويك (الشكل 2) زاد من الحساسية (77%؛ عينات 14 من أصل 18 في الرايت كويك كانت إيجابية) وخصوصية (100%؛ أي من عناصر التحكم السلبي في الإيجابية تحولت RT كويك) للكشف عن (انظر الجدول 1 من تشنغ et al. 27). وأخيراً، كل هذه الخطوات (الشكل 3) أدت إلى الاستفادة المثلى من بروتوكول موثوقة وحساسة للكشف عن RT كويك البريونات CWD، استخدام العينات تحتوي على مستويات منخفضة من العدوى.
استبدال الركازة قدم بعد ح 25 الأولى من رد فعل RT كويك، بتجديد رد فعل صبغ مخزن يحتوي على الركازة الطازجة والأسفار الطازجة Th-ت. عن طريق إدخال خطوة استبدال الركيزة في البروتوكول، تم تمديد وقت رد الفعل RT كويك من ح 50 إلى 75 ح. كما هو مبين في الشكل 2 مع إدراج استبدال الركازة، لوحظ تحسن كبير من التضخيم بريون.
رقم 1: انخفاض التحويل العفوي للماوس ربرب الركيزة في الرايت كويك المصنف مع المنقي CWD سالب البراز هوموجيناتي. وقد تجانس هوموجيناتيس البراز من غير المصابين الأيل (C181-006) أو الوعول في المخزن المؤقت لاستخراج البراز للحصول على تركيز نهائي 10% (w/v). لتنقية، معالجة هذه هوموجيناتيس البراز ومركزة 10-مرات بترسيب نابتا. أونبوريفيد البراز هوموجيناتيس ()، أشكال تنقية ناتا ومركزة (ب) المخفف كما هو مبين استخدمت للبذور كوادروبليكاتي ردود فعل RT كويك مع الماوس ربرب كركيزة. إظهار ياكسيس وحدات الأسفار ال تي النسبي، x-axes تصور وقت رد الفعل. وشهدت عينات البراز تنقية ناتا (ب) تخفيض التحويلات التلقائية. البيانات المستخدمة من تشنغ et al. 27- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. تحسين الكشف في CWD البريونات في البراز باستخدام استبدال الركازة. هوموجيناتيس البراز من الأيائل الفردية (C051-05، C052-05) شفويا المصابين البريونات CWD تم تنقيته وتتركز بترسيب ناتا. كانت تضعف ناتا تعامل العينات بين 2 x 10-1 إلى 2 × 10-3 تستخدم للبذور من ردود الفعل RT كويك كوادروبليكاتي مع الماوس ربرب الركازة. تم إجراء المقايسة RT كويك دون استبدال الركازة () في فترة منتظمة من ح 50 أو مع إدراج استبدال الركيزة لفترة حضانة طويلة من ح 75 (ب). لهذا الأخير، بدأ استبدال الركيزة بعد ح 25 الأولى من رد فعل RT كويك. تسعين في المئة حجم رد فعل إزالتها والاستعاضة عنه بخليط رد فعل RT كويك الطازجة التي تحتوي على الركازة ربرب وال-ت. عن طريق إدخال خطوة استبدال الركيزة في البروتوكول، تم تمديد وقت رد الفعل RT كويك من ح 50 إلى 75 h. البيانات المستخدمة من تشنغ et al. 27- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: مخطط تدفق تصف PrPSc استخراج البراز من المصابين CWD سيرفيدس وبذر النشاط وبريون التضخيم باستخدام الرايت كويك الاعتداء. عينات البراز من الحيوانات المصابة CWD يتم تجانس في المخزن مؤقت استخراج البراز، المقدمة إلى الأسلوب هطول الأمطار نابتا واختبارها من قبل مقايسة RT كويك. وأجرى هذا الأخير بإدخال خطوة استبدال الركيزة. إدراج خطوات استبدال نابتا والركيزة أسفر عن انخفاض التحويل العفوي وتحسن قوي في بذر النشاط وبريون التضخيم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RT كويك كان يعمل على اكتشاف البريونات CWD في البول والبراز مقتطفات من الأبيض – الذيل الغزلان والوعول شفويا المصابة 38سابقا. النظام هو مبين في هذه المخطوطة أسلوب تكييف للمقايسة RT كويك. وأدرجت خطوات إضافية في مقايسة RT كويك "الكلاسيكية" لتحسين الكشف والحساسية للمقايسة البريونات CWD في المواد البرازية للحيوانات المصابة.
انخفاض حساسية الكشف في البراز مقتطفات أدت بنا إلى تحسين البروتوكول RT كويك. تحقيقا لكشف الحساسة في المختبر البريونات في البراز، أضيفت خطوات حاسمة لإعداد نموذج بغية إزالة المكونات التي تتداخل مع بريون التحويل و/أو نشر وتعزيز حساسية الكشف. تتضمن استبدال الركيزة في البروتوكول RT كويك والمعاملة ناتا/ساركوسيل أمر حاسم للكشف عن النشاط البذر في إلك CWD المصابة قبل الإكلينيكية والاكلينيكية، وتعزيز حدود الكشف عن تحويل بريون في مقتطفات البراز .
ناتا هطول الأمطار تقنية شائعة مصحوبة عادة باستخراج ساركوسيل لعزل وتركيز PrPاتفاقية استكهولم إلى مستوى لا يمكن اكتشافها. من المعروف أن يفضل أن يعجل PrPاتفاقية استكهولم على الحزب الثوريج 43 حين ساركوسيل مطهر معروف لتسهيل التحويل بريون تركيزات منخفضة في نظام حر خلية 44ناتا. في التوافق مع هذا، باستخدام مزيج من ناتا وساركوسيل قد تولد عائد أعلى من المجاميع فيبريلار في المختبر كما هو موضح قبل 45،،من4647. وقد أدرجت هذه المنهجية سابقا في RT كويك الفحص للكشف عن الأجهزة الطرفية CWD البريونات بنجاح في عينة مثل اللعاب المنقي 39 والدم كله 40. ويوفر دراستنا أول دليل على أن تتضمن تنقية ناتا/ساركوسيل في البروتوكول من إعداد عينات البراز تمكن CWD بريون الكشف بواسطة RT كويك. وعلاوة على ذلك، مع هذه المنهجية كنا قادرين على الحد من التحويل التلقائي من الركازة ربرب في CWD سالب homogenates البراز في مقايسة RT كويك.
واقترح إليه ممكنة لشرح تأثير الركازة استبدال 30. في الجولات الأولى من رد فعل (قبل إضافة الركازة الطازجة)، يتم إضافة سوى كمية صغيرة من البذور إلى ردود فعل RT كويك. بينما هو إدماج جزء فقط من ربرب في ردود فعل المبذورة، بقية الركازة يمكن استخدامها أما بالتفاعل مع الجدران من رد فعل لوحة الآبار بشكل غير اميلويد المجاميع، أو تغيير بشكل أقل عرضه لتحويلها بواسطة انظر منتجات الدائرة RT كويك بدلاً من بذور الأصلي. نتيجة لذلك معدل إدماج ربرب للبذور بطيئة، وتشكيل فيبريل لا يمكن كشفها في مرحلة انتقالية. كما يتم أخيرا ممدود المنتجات RT كويك المبذورة نمت في المرحلة الفاصلة للوصول إلى مرحلة "الجمعية سريعة"، يمكن البريونات إضافة مجاميع أصغر تضخيم سريعاً بتجزئة من خلال المصافحة أو الأفقي. في هذه المرحلة، هو إدماج الركيزة جديدة إضافة إلى رد الفعل بسهولة في منتجات المصنف بدلاً من تشكيل المجاميع غير محدد. إدراج خطوة استبدال الركيزة في لدينا بروتوكول تم تعديل أن زيادة الحساسية؛ كان مفيداً للكشف عن بذور بريون في عينات مع كمية منخفضة جداً من الحزب الثوري الشعبياتفاقية استكهولم من الحيوانات قبل الإكلينيكية و/أو التي تحتوي على المركبات المثبطة.
استخدام مقايسة RT كويك بدلاً من بمكا، وهي الأولى في المختبر البروتين misfolding المقايسة التضخيم وصف 21، مزايا عديدة. في بمكا المحتضنة الأنابيب وسونيكاتيد في حمام مائي الواردة ضمن سونيكاتور؛ أنابيب المتمركزة في محيط سونيكاتور إظهار أقل فعالية من التضخيم مقارنة بالأنابيب المتمركزة في المركز 48. مهتز نظام كويك RT يبدو أن يكون أسهل في التحكم. استخدام تنسيق جيد 96 ميزة حقيقية من الرايت-كويك، بيد ميغابايت-بمكا وضعتها موجو et al. 49 , 50، أظهرت فوائد مماثلة ولكن لا يزال يستخدم أقل في بمكا.
كالركيزة، الرايت كويك يستخدم ربرب المؤتلف للتحويل؛ وفي المقابل، يستخدم بمكا في معظم الحالات هوموجيناتي الدماغ العادي. وبالإضافة إلى ذلك، في RT كويك مطلوب لا تسلسل التماثل بين البذور والركيزة 51–53.
من الضروري وجود العوامل المساعدة للنسخ المتماثل بريون في بمكا والناتج المعدية. في مقايسة RT كويك، الحزب الثوري تضخيم غير المعدية. في المختبر فحوصات التضخيم حدوث ردود فعل إيجابية زائفة على الأرجح بسبب التحويل التلقائي للحزب الثوريج مشكلة متكررة. لذلك، صممت للمقايسة والشروط المستخدمة في هذه الدراسة للتقليل من حدوث هذه الاضطرابات إلى أقصى حد ممكن الفرق بين المبذورة ربرب-التحويل والتحويل التلقائي.
وفي الختام، نابتا/ساركوسيل العلاج يتيح إزالة مثبطات الإنزيم في البراز ويقلل التحويل التلقائي. من المثير للاهتمام، المعاملة لا تعوق النشاط بذر من بريسيبيتاتيدبرباتفاقية استكهولم. وبالإضافة إلى ذلك، إلى حد كبير تحسنت حساسية الكشف عن عند استبدال الركيزة واعتمد في الوقت ذاته.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن ممتنون للدكتور بايرون كاوغيي (مختبرات الجبال الصخرية المعاهد الوطنية للصحة) لتوفير التدريب وبلازميد التعبير البكتيرية PrP سيرفيد. ويدعم البرنامج "كرسي أبحاث كندا" SG. نحن نعترف بتمويل هذه البحوث إلى سان جرمان من كندا، ألبرتا بريون أبحاث معهد الجينوم والبرتا الزراعة والغابات من خلال الجينوم ألبرتا، وجامعة كالغاري دعما لهذا العمل. نعترف بمنحه بحثية من مؤسسة "البحوث الحيوانية" غن مارغريت.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Acrodisc seringe filters | PALL | 4652 | |
| amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit | Millipore | UCF901024 | |
| BD 10 ml seringe | VWR | CA75846-842 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Corning bottle-top vacuum filters | Sigma-Aldrich | 431118 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| gentleMACS M Tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | ThermoFisher Scientific | 12780029 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| N2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 15502048 | |
| N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma-Aldrich | ML9150 | |
| Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K | PALL | OD100C34 | |
| Nunc sealing tapes | ThermoFisher Scientific | 232702 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-000 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Calbiochem | 7910-OP | |
| sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) | Sigma-Aldrich | 496626 | |
| Thioflavin T | Sigma-Aldrich | T3516 | |
| Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Triton-100 | Calbiochem | 9410-OP | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial buffers and solutions | |||
| BugBuster Master Mix | Nogagen | 71456-4 | |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 1018401 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) | Life Technoligies | P5493 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977015 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standards and commercial kits | |||
| Express Autoinduction System 1 | Novagen | 71300-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment setup | |||
| AKTA protein purification systems FPLC | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Beckman Avanti J-25 Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Beckman rotor JA-25.50 | Beckman Coulter | ||
| Beckman rotor JA-10 | Beckman Coulter | ||
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sofware | |||
| MARS Data Analysis | BMG Labtech | ||
| GraphPad Prism6 | GraphPad software |
References
- Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion diseases. PLoS Pathog. 2 (3), (2006).
- Wadsworth, J. D., Collinge, J. Update on human prion disease. Biochim Biophys Acta. 1772 (6), 598-609 (2007).
- Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Groveman, B. R., et al. Parallel in-register intermolecular beta-sheet architectures for prion-seeded prion protein (PrP) amyloids. J Biol Chem. 289 (35), 24129-24142 (2014).
- Vazquez-Fernandez, E., et al. The Structural Architecture of an Infectious Mammalian Prion Using Electron Cryomicroscopy. PLoS Pathog. 12 (9), e1005835 (2016).
- Wille, H., et al. Structural studies of the scrapie prion protein by electron crystallography. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3563-3568 (2002).
- Caughey, B. Prion protein conversions: insight into mechanisms, TSE transmission barriers and strains. Br Med Bull. 66, 109-120 (2003).
- Soto, C., Estrada, L., Castilla, J. Amyloids, prions and the inherent infectious nature of misfolded protein aggregates. Trends Biochem Sci. 31 (3), 150-155 (2006).
- Prusiner, S. B. Prions. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13363-13383 (1998).
- McKinley, M. P., Bolton, D. C., Prusiner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
- Benestad, S. L., Mitchell, G., Simmons, M., Ytrehus, B., Vikoren, T. First case of chronic wasting disease in Europe in a Norwegian free-ranging reindeer. Vet Res. 47 (1), 88 (2016).
- Williams, E. S., Young, S. Chronic wasting disease of captive mule deer: a spongiform encephalopathy. J Wildl Dis. 16 (1), 89-98 (1980).
- Gilch, S., et al. Chronic wasting disease. Top Curr Chem. 305, 51-77 (2011).
- Johnson, C. J., Pedersen, J. A., Chappell, R. J., McKenzie, D., Aiken, J. M. Oral transmissibility of prion disease is enhanced by binding to soil particles. PLoS Pathog. 3 (7), e93 (2007).
- Pritzkow, S., et al. Grass plants bind, retain, uptake, and transport infectious prions. Cell Rep. 11 (8), 1168-1175 (2015).
- Mathiason, C. K., et al. Infectious prions in the saliva and blood of deer with chronic wasting disease. Science. 314 (5796), 133-136 (2006).
- Tamguney, G., et al. Asymptomatic deer excrete infectious prions in faeces. Nature. 461 (7263), 529-532 (2009).
- Haley, N. J., Seelig, D. M., Zabel, M. D., Telling, G. C., Hoover, E. A. Detection of CWD prions in urine and saliva of deer by transgenic mouse bioassay. PLoS One. 4 (3), e4848 (2009).
- Spraker, T. R., et al. Validation of monoclonal antibody F99/97.6.1 for immunohistochemical staining of brain and tonsil in mule deer (Odocoileus hemionus) with chronic wasting disease. J Vet Diagn Invest. 14 (1), 3-7 (2002).
- Spraker, T., et al. Comparison of histological lesions and immunohistochemical staining of proteinase-resistant prion protein in a naturally occurring spongiform encephalopathy of free-ranging mule deer (Odocoileus hemionus) with those of chronic wasting disease of captive mule deer. Vet Pathol. 39 (1), 110-119 (2002).
- Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411 (6839), 810-813 (2001).
- Atarashi, R., et al. Simplified ultrasensitive prion detection by recombinant PrP conversion with shaking. Nature Methods. 5 (3), 211-212 (2008).
- Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
- Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
- Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2), 175-178 (2011).
- Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
- Cheng, Y. C., et al. Early and Non-Invasive Detection of Chronic Wasting Disease Prions in Elk Feces by Real-Time Quaking Induced Conversion. PLoS One. 11 (11), e0166187 (2016).
- Cramm, M., et al. Stability and Reproducibility Underscore Utility of RT-QuIC for Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob Disease. Mol Neurobiol. 53 (3), 1896-1904 (2016).
- Orrú, C., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
- Orrú, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).
- Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2175-2178), (2011).
- Orrú, C. D., et al. A test for Creutzfeldt-Jakob disease using nasal brushings. N Engl J Med. 371 (19), 519-529 (2014).
- Orrú, C. D., et al. Rapid and sensitive RT-QuIC detection of human Creutzfeldt-Jakob disease using cerebrospinal fluid. MBio. 6 (1), (2015).
- Sano, K., et al. Early detection of abnormal prion protein in genetic human prion diseases now possible using real-time QUIC assay. PLoS One. 8 (1), e54915 (2013).
- Orrú, C., et al. Detection and discrimination of classical and atypical L-type bovine spongiform encephalopathy by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 53 (4), 1115-1120 (2015).
- Orrú, C. D., et al. Bank vole prion protein as an apparently universal substrate for RT-QuIC-based detection and discrimination of prion strains. PLoS Pathog. 11 (6), e1004983 (2015).
- Masujin, K., et al. Detection of Atypical H-Type Bovine Spongiform Encephalopathy and Discrimination of Bovine Prion Strains by Real-Time Quaking-Induced Conversion. J Clin Microbiol. 54 (3), 676-686 (2016).
- John, T. R., Schätzl, H. M., Gilch, S. Early detection of chronic wasting disease prions in urine of pre-symptomatic deer by real-time quaking-induced conversion assay. Prion. 7 (3), 253-258 (2013).
- Henderson, D. M., et al. Rapid antemortem detection of CWD prions in deer saliva. PLoS One. 8 (9), e74377 (2013).
- Elder, A., et al. In vitro detection of prionemia in TSE-infected cervids and hamsters. PLoS OnE. 8 (11), e80203 (2013).
- Haley, N. J., et al. Prion-seeding activity in cerebrospinal fluid of deer with chronic wasting disease. PLoS One. 8 (11), e81488 (2013).
- Haley, N., et al. Detection of chronic wasting disease in the lymph nodes of free-ranging cervids by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 52 (9), 3237-3243 (2014).
- Safar, J., et al. Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat Med. 4 (10), 1157-1165 (1998).
- Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
- Wille, H., et al. Surface charge of polyoxometalates modulates polymerization of the scrapie prion protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3740-3745 (2009).
- Lee, I. S., Long, J. R., Prusiner, S. B., Safar, J. G. Selective Precipitation of Prions by Polyoxometalate Complexes. J Am Chem Soc. 127 (40), 13802-13803 (2005).
- Levine, D. J., et al. Mechanism of scrapie prion precipitation with phosphotungstate anions. ACS Chem Biol. 10 (5), 1269-1277 (2015).
- Gonzalez-Montalban, N., et al. Highly efficient protein misfolding cyclic amplification. PLoS Pathog. 7 (2), e1001277 (2011).
- Moudjou, M., et al. Glycoform-independent prion conversion by highly efficient, cell-based, protein misfolding cyclic amplification. Sci Rep. 6, 29116 (2016).
- Moudjou, M., et al. Highly infectious prions generated by a single round of microplate-based protein misfolding cyclic amplification. MBios. 5 (1), (2013).
- Orru, C. D., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
- McGuire, L. I., et al. Real time quaking-induced conversion analysis of cerebrospinal fluid in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Ann Neurol. 72 (2), 278-285 (2012).
- Orru, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).
