Summary
여기, 우리는 간단, 신속 하 고 효율적인 프리온 증폭 기술, 실시간 떨게 유발 변환 (RT-QuIC) 메서드를 설명 하는 프로토콜을 제시.
Abstract
RT QuIC 기술은 민감한 생체 외에서 셀 무료 프리온 증폭 분석 결과 기반으로 주로 시드 misfolding 및 변환에 대 한 템플릿으로 프리온 씨앗을 사용 하 여 재조합 프리온 단백질 (PrP) 기판의 집계입니다. RT QuIC는 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)는 소설 높은 처리 기술입니다. 녹말 체 fibril 성장의 감지 염료 ᵦ 시트 풍부한 단백질의 특정 상호 작용에 따라 fluoresces Thioflavin T를 기반으로 합니다. 따라서, 녹말 체 형성을 실시간으로 검색할 수 있습니다. 우리는 지저분한 추출 만성 낭비 질병 (CWD) prions를 검출 하기 위하여 신뢰할 수 있는 비-침략 적 선별 검사를 개발 하려고 결정 했습니다. 여기, 우리가 구체적으로 PrPSc 시드 CWD의 배설물에는 활동 감염 cervids 공개 RT QuIC 기술을 적응 시켰다. 처음에, 우리가 준비 배설물 추출의 시드 활동 상대적으로 낮은 RT QuIC 배설물 소재에 잠재적인 분석 결과 억제제 때문에 가능 하 게 했다. 대변 추출의 시드 활동 향상과 잠재력 분석 결과 억제제를 제거, 우리는 세제와 프로 테아 제 억제제를 포함 하는 버퍼에 배설물 샘플 무 균. 우리는 또한 PrP 단백질 강 수 나트륨 phosphotungstic 산, 및 원심력을 사용 하 여 기준Sc 집중 다른 방법론에 샘플을 제출. 마지막으로, 배설물 추출 최적화 된 RT-QuIC 탐지의 감도 향상 시키기 위해 프로토콜에 기판 교체를 포함 하 여 테스트 되었습니다. 따라서, 우리는 시드 여 RT-QuIC, 비-침략 적 CWD 진단에 대 한 실용적인 도구가 될 수 있는 전 임상 및 임상 cervids의 배설물에서 활동 하는 CWD 프리온의 민감한 감지에 대 한 프로토콜을 설립.
Introduction
프리온 질병 또는 전송 가능 해 encephalopathies (TSE) 인간, 소 면 뇌 질환 (BSE) 가축, 양, 염소, 그리고 만성 낭비 scrapie에에서 크로이츠펠트-야콥 병 (CJD)를 포함 한 신경 퇴행 성 장애는 질병 (CWD) cervids 1,2. TSEs 독특한 면 모양 및 두뇌에서 뉴런의 손실에 의해 특징. "단백질만" 가설에 따르면 prions PrPSc ('Sc' scrapie에 대 한) 3, 호스트 인코딩 세포 프리온 단백질, PrPC의 misfolded isoform의 주로 구성 됩니다. PrPSc 구조 바인딩할 다른 PrPC 분자를 변환 하는 씨앗 역할을 할 수 있는 ᵦ 시트 4,,56 농축에 PrPC 의 변환에서 유래한 다. 새로 생성 된 PrPSc 분자는 성장 폴리머 7,8 작은 올리고, 전염 성 핵의 더 높은 숫자의 결과로 침입에 통합 됩니다. PrPSc 집계 하는 경향이 고은 부분적으로 프로 테아 제 9,10.
CWD 야생과 농장 엘크 (Cervus 카 나 덴 시스), 사슴 (Odocoileus hemionus), 흰 꼬리 사슴 (WTD; 영향을 Odocoileus virginianus), 사슴 (Alces alces), 그리고 순 록 (Rangifer tarandus tarandus) 11,,1213. Cervid 상호 작용 및 infectivity 14,15의 환경 지 속성에 의해 선호 하는 수평 전송 가장 전염 성 프리온 질병을 여겨진다. PrPSc 축적과 infectivity 뇌에 수감 된다 다른 프리온 질병과는 달리 CWD에 이들은 또한 발견 된다 주변 조직과 체액에서 예 타 액, 소변, 대변 16,17, 18.
Immunohistochemistry는 PrPSc 분포 및 발생 병 변 19,20감지 하 CWD 진단에 대 한 황금 표준으로 간주 됩니다. ELISA 더 드문 경우에, 서쪽 오 점 CWD 진단을 위해 사용 됩니다. 따라서, 현재 프리온 질병 진단 주로 기반으로 사후 조직에 prions를 감지 합니다. 편도 또는 recto 항문 점 막 관련 림프 조직 (RAMALT) 생 검; 여 CWD에 대 한 축전 진단이 이다 그러나,이 절차는 침략 하며 동물의 캡처. 따라서, 소변, 대변, 등 쉽게 접근할 수 있는 견본의 사용 CWD 프리온 검출을 위한 실용적인 방법 것입니다. 그러나, 그 배설물 하버는 상대적으로 현재 진단 방법의 검출 한계 아래 prions의 농도가 낮은. 따라서, 더 과민 하 고 높은 처리량 진단 도구는 필요 합니다. 생체 외에서 변환 시스템, 순환 증폭 misfolding 단백질 분석 결과 (PMCA) 21, 아 밀 로이드 시드 분석 결과, 그리고 실시간 떨게 유발 변환 (RT-QuIC) 분석 결과 22,23, 24 는 매우 강력한 도구를 프리온 변환 프로세스 생체 외에서 모방을 PrPSc 의 자체 전파 기능을 악용 하 고 그로 인하여 감지 레벨 25에 PrPSc 의 총계의 존재를 증폭 ,26. 그러나 RT QuIC 방법, 활용 사실 β 시트 보조 구조에서 농축 변환 제품 특히 thioflavin T (Th-T)를 바인딩할 수 있습니다. 따라서, 시드 변환 시 재조합 형 PrP (rPrP)는 Th-T를 바인딩할 및 따라서 Th-T 시간이 지남에 상대적 형광 단위 (RFU)로 표현의 형광을 측정 하 여 실시간으로 검출 될 수 있는 녹말 체 소에 자 랍니다. 모니터링, 일단 상대 시드 활동, 그리고 지연 위상 등 양적 매개 변수를 평가 하는 RFU는 사용할 수 있습니다. 래그 단계는 rPrP 동안 반응의 초기 단계에서 변환 Th-T 형광의 탐지 한계 아래는 임계값에 도달 하는 데 필요한 시간을 (h)를 나타냅니다. 충분 한 녹말 체 핵 (nucleation/신장)의 형성을 수 반하는 명백한 지연 위상의 끝에는 Th-T 형광 임계값 수준을 초과 긍정적인 됩니다 때 발생 합니다. 소는 실시간으로 초기 PrPSc 또는 샘플에 포함 된 시드 활동에서 검출 될 수 있다 아 밀 로이드의 성장은 더 많은 씨를 생성 하는 시장 세분화에 의해 증폭 된다. 이 씨는 차례 차례로 녹말 체 섬유 성장의 급속 한 지 수 단계를 유도.
이 분석 결과 1 최저 감지할 수 있기 때문에 PrP사우스 캐롤라이나 24의 fg, 높은 감도 자격이 기술을 다양 한 주변 조직, 배설물 등에서 PrPSc 를 감지 하 여 안 테 부검 또는 비-침략 적 진단을 달성 하 표본 infectivity의 저급을 은닉의 종류입니다. RT QuIC 확실히 이점을 제공 한다 다른 분석 실험의 재현성, 실용성, 신속성 (50 시간 미만) 및 생물 검정에 비해 낮은 비용에 대 한. 그것은 쥡니다 PMCA;에 사용 등 기술적인 복잡성 방지 또한, 그것은 각의 어로 졸 오염 위험을 최소화 하는 테이프 봉인 microplate에 수행 됩니다. 다 잘 형식 같은 실험에서 최대 96 샘플의 분석을 수 있습니다. 잘못 된 반응의 재발 문제 및 생체 외에서 변환 분석에서 rPrP의 자발적인 변환에 대응 하기 위해 임계값 (컷오프)에서 RT-QuIC의 구현을 매우 유용 합니다. 실제로, 부정적인 컨트롤 (평균 RFU의 부정적인 샘플 + 5 SD 27)의 결과에 따라, 초기 계획 설정 됩니다는 긍정적이 고 부정적인 샘플 사이 차별을 할 수 있습니다. 각 샘플에 대 한 4 개의 복제를 사용 하 여 수 있습니다 따라서는 복제의 50% 이상에서 긍정적인 신호를 표시 하는 때 긍정적으로 샘플을 정의 하는 데 도움이 됩니다, 즉, 교차 하는 절단 28. 예: 이전 연구에서 햄스터 rPrP는 발견으로 인간의 PrPvCJD 에 동종 기판에 비해 더 민감한 기판 하 시드 및 양 scrapie 시드 반응 씨와 기판 사이의 homology RT QuIC에서 필요 하지 않습니다. 29. 햄스터 양 공상 rPrP 또한 인간의 변종 CJD prions 30감지 하 인간 rPrP 보다 더 적합된 기판 수를 제안 했다. 따라서, 다른 종에서 rPrP 기판의 사용이 분석이 결과에서 아주 일반적 이다. 이 분석 결과 산발적 CJD 31,,3233, 겐 등 여러 프리온 질환에 성공적으로 적용 되었습니다.etic 프리온 질병 34, 광우병 35,,3637, scrapie 23,36및 CWD 38,,3940,41, 42. RT QuIC 씨앗 PrPSc 38,,3940,41, 감지 하 모두 성공 했다 연구를 사용 하 여 중추 신 경계, 전체 혈액, 타 액, 소변 처리 42. 녹말 체 형성 억제제를 포함 될 수 있습니다 혈액 플라스마 등 샘플의 탐지 능력을 육성 하기 위해 Orrú 외. (2011) PrPSc immunoprecipitation (IP) 단계 및 RT-QuIC 빗질 하 여 녹말 체 형성의 잠재적인 억제제를 제거 하는 전략을 개발, "향상 된 QuIC" 분석 결과 (eQuIC) 라는. 또한, 기판 교체 단계 반응 시간 ~ 24 시간 후 감도 개량 하기 위하여 고용 되었다. 궁극적으로,로 1 PrPSc 의 ag eQuIC 30에 의해 감지 되었다.
배설물 추출 정화 하 고 배설물에 가능한 분석 결과 억제제를 제거, 실험 구강 감염 시 엘크에서 전 임상 및 임상 단계에서 수집 된 배설물 샘플 세제와 프로 테아 제 억제제를 포함 하는 버퍼에서 무 균 했다. 대변 추출 추가 나트륨 phosphotungstic 산 (NaPTA) 강 수를 통해 단백질 강 수를 활용 하는 샘플에 PrPSc 를 집중 하는 다른 방법론에 제출 했다. NaPTA 강 수 방법, Safar 외. 에 의해 처음으로 설명 43, 테스트 샘플에 PrPSc 를 집중 하는 데 사용 됩니다. 샘플 NaPTA의 인큐베이션 PrPC보다는 PrPSc 의 우선 강 수 발생합니다. 그러나, 분자 메커니즘이 아직 명확 하지 않습니다. 이 단계는 또한 포함 하 고 어떤 경우에 관찰 되는 rPrP의 자발적인 변환 방지 도움. 마지막으로, 배설물 추출 최적화 된 RT-QuIC 프로토콜에 기판 교체를 포함 하 여 기판으로 마우스 rPrP (aa 23-231)를 사용 하 여 탐지의 감도 향상 하 여 테스트 되었습니다.
여기 결과이 개선된 방법 CWD prions의 매우 낮은 농도 검출할 수 있다 검출 및 배설물 샘플 NaPTA 강 수와 기판 교체 없이 프로토콜에 비해 특이성의 감도 증가 보여줍니다. 이 메서드는 잠재적으로 다른 조직 및 체액에 적용할 수 있다 하며 CWD 감시 야생과 포로 cervids에 대 한 훌륭한 사용 될 수 있습니다.
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Protocol
1. RT QuIC 사용 하 여 배설물 소재
배설물의 10 mL를 분 변 물질의 1 g를 추가 하 여- 확인 cervid 배설물의 준비 추출
- 지저분한 homogenate 추출 버퍼 (20 m m 인산 나트륨, pH 7.1, 130 m m NaCl, 0.05% 트윈 20, 1 밀리미터 PMSF 및 1 x 완료 protease 억제제, EDTA 무료) 10% (w/v)의 최종 농도 주고. 균질 버퍼의 이용 전에 준비 하 고-20에 저장 수 있다 ° c.
- Homogenize 찌 끼 펠 릿 (1 g) 그리고 실내 온도에서 1 분에 대 한 단백질에 대 한 제조 업체에서 미리 설정된 프로그램으로는 dissociator를 사용 하 여 (예를 들어, gentleMACS M 튜브) 튜브에 버퍼 (10 mL). 2 ~ 3 배 배설물 샘플은 버퍼에 완전히 무 균 때까지이 단계를 반복.
- Parafilm 튜브를 밀봉 하 고 상 온에서 1 h 보육에 대 한 플랫폼 또는 로타리 락 통에 넣어.
- 실 온에서 5 분에 대 한 18000 x g에서 튜브 원심.
- 수집 supernatants 단백질을 포함 하는 추출 하 고 aliquot 그들로 1.5 mL 튜브. Aliquots는 추가 응용 프로그램-80 ° C에 저장 될 수 있다.
- 배설물에 농도의 PrP Sc 추출
참고: CWD prions 배설물 추출 샘플, RT QuIC 의해 검출 감도 향상에 집중 하기 위하여 단백질 강 수 단계 추가 하는 프로토콜.- NaPTA 강 수 방법
- 추가 250 µ L 지저분한 단백질의 1 ml N 라우릴 sarcosinate (sarkosyl)의 10% (w/v)의 2% (v/v)의 sarkosyl의 최종 농도 주고 추출.
- Parafilm으로 샘플을 포함 하 고 상수는 thermomixer 1400 rpm에 떨고 아래 30 분 동안 37 ° C에서 품 어 튜브 인감.
- 나트륨 phosphotungstic 산 및 염화 마그네슘, pH 7.4 샘플에서 0.3% (w/v) 나트륨 phosphotungstic 산의 최종 농도를 170 mM의 10% (w/v)를 포함 하는 재고 솔루션 지저분한 단백질 추출 및 sarkosyl의 혼합 조정.
- 400 rpm에서 일정 한 동요와 2 h 37 ° C에서 샘플을 품 어.
- 15,800 x g. 30 분 제거는 supernatants 신중 하 게 대 한 샘플 14 ° C에서 원심.
- 워시 버퍼에 그들을 resuspending 하 여 펠 릿을 세척 (10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% 트리톤 X 100, 10 mM EDTA, 0.5% 나트륨 deoxycholate (w/v), 그리고 0.1 %sarkosyl (w/v)).
- 15,800 x g.에서 15 분 제거는 supernatants 신중 하 게 대 한 샘플 14 ° C에서 원심.
- 100 µ L에서 알 약 resuspend (1/10의 원래 양의 배설물 단백질 추출) RT QuIC 희석 버퍼의.
참고: RT QuIC 희석 버퍼 (20 m m 인산 나트륨, pH 6.9, 130 mM NaCl, 0.1 %SDS (w/v) 및 1 X N2 보충) 이용 전에 준비 된다. 10 ml 전체 볼륨 0.2 µ m acrodisc 주사기는 주사기를 사용 하 여 필터를 통해 필터링 및 사용까지-20 ° C에 저장. - RT QuIC 분석 결과에서 활용까지-20 ° C에서 취급 하는 NaPTA 샘플 저장.
- RT QuIC 분석 결과
- 신선한 10mm Th-T 재고 솔루션 두 배 증류수 H 2 O 10 mL에 Th-T (0.032 g)를 준비.
- 더블 재고 솔루션 H 2 O Th-T 1 m m의 최종 농도 0.2 µ m acrodisc 주사기를 통해 주사기를 사용 하 여 필터링 하는 필터를 만들기 위해 소 주 Th-T의 1:10 희석 확인.
- 마우스 재조합 형 PrP (rPrP, aa 23-231) 기판 (RT QuIC 반응 당 10 µ g/mL) 얼음에-80 ° C에 저장을 해 동
- 100 kDa 크기 제외 필터 microtubes로 한 번에 rPrP 기판 및 실 온 (1 관/필터 사용할 수 있습니다 최대 두 번까지)에서 5 분 14000 x g에서 원심 분리기의 부하 500 µ L.
- 살 균 1.5 mL 튜브에 eluted 기판 전송 및 사용까지 4 ° C에서 그것을 유지.
- 녹여 RT-QuIC 희석 버퍼 저장-20 ° c.
- RT QuIC에 씨앗 (지저분한 단백질 추출 물)의 게 희석 희석 버퍼:
Undiluted 샘플: undiluted 지저분한 단백질 추출 사용
2 x 10 -1 희석
2 x 10 -2를 희석
2 x 10 -3 희석 - RT QuIC 반응 혼합물에 대 한 재고 솔루션을 준비:
염 (인산 염 버퍼 PBS): 5 X
NaCl: 2 M NaCl 더블 증류수 H 2 o. 준비의 솔루션 재고
EDTA: 100 mM EDTA 더블에서의 재고 솔루션 증류수 H 2 o. - 모든 솔루션 (단계 1.3.8)의 활용, 사전 0.2 µ m acrodisc 주사기는 주사기를 사용 하 여 필터를 통해 각 솔루션을 별도로 필터링 하 고 실내 온도에서 살 균 유지.
- 가이 볼륨의 10% 플러스 모든 반응에 대 한 충분 한 혼합물을가지고 있는지 확인 하는 데 사용 될 샘플 (샘플 당 98 µ L 샘플 당 반응의 볼륨과 4 복제)의 수에 따라 실시간 QuIC 반응 혼합물의 총 볼륨을 준비 합니다.
RT QuIC 반응 혼합물을 준비 하
- 사용 15 mL 튜브 (20 m m 인산 나트륨, pH 6.9, 300 m m NaCl, 1 mM EDTA, 10 µ M Th-T, 10 µ g/mL rPrP 기판, 및 두 배 증류수는 반응에서 rPrP 최종 농도 조정 하) 주식 솔을 사용 하 여 utions.
- 필터 팁 한 피 펫을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 잘 모든 솔루션을 혼합. 소용돌이의 사용을 가능한 한 많이 피해.
- 50 mL 일회용 pipetting 저수지에 혼합물을 부 어.
- 96 잘 광학 바닥판의 각 음에 RT QuIC 반응 혼합물의 98 µ L를 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여.
- 각 undiluted의 RT QuIC 반응 2 µ L 또는 10 직렬 희석된 지저분한 단백질 추출에 추가. 4 복제에서 각 샘플 테스트.
참고: 각 실험에서 CWD 부정 및 검증된 CWD 양성 동물 배설물 샘플 (타지에서 2 x 10 -3에 배열 되는)의 직렬 희석 사용 됩니다 부정과 긍정적인 컨트롤로 각각. - 반복 사이클 1 분 더블 궤도 동요 (700 rpm)와 부 화에 걸쳐 휴식 1 분 25 h 42 ° C에서 플레이트 리더에서 잠복기 전에 씰링 테이프와 함께 접시를 봉인.
- 정의 형광 측정 설정:
여기: 450 nm
방출: 480 nm
하단, 섬광의 수: 20
수동 이득: 1000 (기계에 따라 달라 집니다)
통합 시간: 20 µs - 25 헤의 끝에 플레이트 리더에서 플레이트를 제거
- 우물 사이 잠재적인 오염을 방지 3 분 3000 x g에서 접시 아래로 회전.
- 접시에서 봉인 제거.
- 신선한 기판 및 신선한 형광을 포함 하는 RT QuIC 반응 혼합물의 90 µ L 염색 Th-T 1.3.1 1.3.6 섹션에 설명 된 대로 추가 하 여 새로운 96 잘 접시 준비.
- 새로 준비 96 첫 번째 접시의 각 우물에서 전송 10 µ L 잘 접시.
- 새 접시를 봉인 하 고 추가 50 h 단계 1.3.13에서에서 설명 하는 단계에 대 한 실시간 QuIC 분석 결과 계속 합니다. 50 h의 추가이 단계 75 헤의 총 반응 시간을 만들 것입니다
참고: RT QuIC 분석 결과의 모든 절차에 biosafety 캐비닛 아래 행해진다. - 데이터를 수집합니다.
- 읽기 및 문서 각 음 마다 15 분의 Th-T 형광 신호
- 총 사이클 quadruplicate 반응의 평균 데이터 분석 소프트웨어와 스프레드시트에 전송 사용 하 여 데이터를 수집.
- 플롯 데이터의 평균. RT-QuIC (h)의 반응 시간에 해당 하는 x 축 고 y 상대 형광 단위 (RFU)에 해당 합니다. 알려진된 샘플의 희석에 해당 하는 각 곡선.
- 각 실험에 부정적인 컨트롤의 가장 높은 평균 값을 계산 하 여 임계값을 구분 플러스 5 표준 편차 전류에 설명 된 대로 출판 문학 41.
참고: 모든 복제는 정의 된 임계값을 넘어 긍정으로 간주 됩니다. 임계값을 교차 하는 4 개의 복제에서 적어도 두 샘플 다음 간주 됩니다 긍정적인.
2. 재조합 프리온 단백질 (rPrP)의 정화
- 세균성 주식 및 rPrP의 식의 성장
참고: 대장균 (대장균) 변형 벡터 애완 동물-24 인코딩으로 변환 되는 로제타 (DE3)는 마우스 PrP (잔류물 23-231)는 rPrP 준비 하 사용 되었다. - 글리세롤 재고 로제타 (DE3)의 얼음에 애완 동물-24 mPrP(23-231)로 변형 해 동
- 행진 파운드 (Luria Bertani) 최종 대 50 µ g/mL의 농도로 접시 하 고 37 ° C 배양 기에서 밤새 품 어. 번호판을 박테리아를 포함 하는 고체 미디어에 습도 응축을 피하기 위해 거꾸로 다는 것을 확인 하십시오. 두 접시 두 접시 중 하나 이상에 있는 성장 되도록 준비.
- 준비 L 1 파운드 및 오토 클레이 브 살 균 수 있도록 그것.
- 1 mL 대 (50 mg/mL)와 페니 (34 mg/mL)의 1 mL와 멸 균 파운드 미디어의 보충 1 L.
- 대 및 페니 파운드 매체의 3 mL를 접종 하는 일회용 접종 루프를 사용 하 여 각 판의 한 식민지를 선택.
- 장소 5-6 헤 대 한 225 rpm에서 일정 한 동요와 37 ° C에서 인큐베이터에서 미니 문화
- 단백질 식의 유도 위한 Autoinduction 시스템 1 익스프레스 함께 파운드 미디어의 원래 1 l의 나머지 부분을 추가 하는 미니-문화.
- 장소 2 L 플라스 크, 또는 20-24 h. 위해 200 rpm에서 지속적인 동요를 37 ° C에서 인큐베이터에 더 큰 문화
- 1 L 문화 4 x 250 mL 원심 분리기 튜브로 분할.
- 3750 x g 실 온에서 20 분에 문화를 포함 하는 튜브 아래로 회전.
- 삭제는 상쾌한 50 mL 원심 분리기 튜브에 세균성 펠 릿 수집 그리고 추가 처리까지-80 ° C에서 그들을 멈추게. 결과 펠 릿 좋은 단백질 생산량에 대 한 3 ~ 4 g 무게 있다.
- 포함 신체의 준비
- 몇 분 동안 37 ° C에서 냉동된 펠 릿 (3 ~ 4 g)를 녹여.
- 동결 펠 릿-80 ° C에서 10 분 동안 한 번 더 하 고 다시 해 동. 중지 및 재개 두 번 더의이 단계를 반복 합니다.
- 1 X 세균 펠 릿 resuspend 세포 시 약 (예: BugBuster 마스터 믹스) 철저 하 게 pipetting으로. 시 약의 5 mL를 사용 하 여 세균성 펠 릿의 1 g에 대 한. 완전히 혼합 균질 것을 확인 하십시오.
- 품 어 실 온에서 20 분 동안 로커에 homogenate.
- 실 온에서 20 분 16000 x g에서 homogenate 원심.
- 신중 하 게 따르고 그것을 끊 여 supernatants 삭제
- 균질 세포 시 약 이전 단계에서 사용 되는 X 1의 같은 볼륨에 있는 펠 릿.
- 품 어 실 온에서 로커에 15 분 동안 homogenate.
- 1시 10분의 충분 한 볼륨을 추가 (0.1 x) 세포 시 약 40 mL의 총 homogenate 볼륨을. 믹스 전도 의해 균질 잘 있는지 확인.
- 7,900 x g 15 분에 homogenate 4 원심 ° c.
- 신중 하 게 그것을 붓는 하 여 상쾌한 삭제
- 세포 시 약 x 0.1의 40 mL에 펠 릿 resuspend.
- 4에서 16000 x g 15 분에 homogenate 원심 ° c.
- 신중 하 게 그것을 붓는 여는 상쾌한을 삭제 하 고 추가 처리까지 포함 하는-20 ° C에서 포함 시체 펠 릿 저장.
- 단백질 정화
- 포함 시체 실 온에서 해 동.
- 8 M guanidine-HCl의 14 mL에 해 동된 포함 시체를 분해 (38 g Guanidine 염 산 0.1 M NaPO 4 pH 8.0 및 채우기 H 2 O 50 mL; 정지 최종 솔루션에 pH를 조정 하지 않습니다) 단백질을 solubilize 하.
- 잘 아래로 pipetting으로 균질에 있는지 확인 하십시오.
- 50 분에 대 한 실 온에서 로커에 lysate 품
- Ni NTA 수 지의 준비 18 g (18 g 3 ~ 4 g 세균 펠 릿에 대 한) 비즈; 물 진공 및 100 mL 0.22 μ m 병 최고의 필터를 사용 하 여 100 mL로 씻.
- 50 mL 튜브에 Ni NTA 수 지 구슬의 18 g를 배치 하 고 버퍼 (100 m m 인산 나트륨, 10 mM Tris, pH 8.0, 6 M guanidine 염 산 염, pH 8) 최종 볼륨을 변성 시키기에 충분 한 양의 추가 최대 50 mL.
- 실 온에서 로커에 50 분 변성 버퍼에 구슬 equilibrate.
- 포함 바디 lysate 불용 성 파편을 제거 하 5 분 16000 x g에서 원심.
- Equilibrated 구슬에는 상쾌한을 추가 하 고 알 약 삭제.
- Ni NTA 수 지를 단백질 바인딩 수 있도록 실 온에서 40 분 동안 로커 믹스 입었다.
참고: 니켈 킬레이트 구슬 PrP를 정화 하는 니켈 선호도 사용 됩니다. PrP의 히스티딘 풍부한 N 맨끝 영역 렌더링 단백질 어떤 그의 태그 없이 이온 니켈에 바인딩할 수 있는 nickel(II) 선호도. - 두 선 (A 및 B) 깨끗 하 게 물으로 씻어 FPLC.
- 두 줄 (A 및 B) (열 아직 첨부 되어있습니다.) 시스템을 통해 변성 버퍼 (100 m m 인산 나트륨, 10 mM Tris, pH 8.0, 6 M guanidine 염 산 염, pH 8) 실행
- 열에 수 지를 로드합니다. 공기 거품을 최소화 하기 위해 있는지 확인 하십시오.
- 는 FPLC를 열을 연결 하 고 버퍼를 변성 시키기 0% 및 100%까지 버퍼 refolding 버퍼 A 변성 시키기 100%와 0 %refolding 버퍼 B의 (인산 나트륨 100 mM, 10 mM Tris, pH 8.0) 처음에에서 선형 그라디언트를 실행 합니다. 이 점차적인 변화 240 분 0.75 mL/min의 유량에서 실행 하 고 PrP의 적절 한 접는 필요.
참고: 크로마 정화 과정에서 변성된 PrP는 먼저 천천히 refolded 수 지에 변성 버퍼 교체 refolding 버퍼의 선형 그라디언트를 적용 하 여. 이 단계는 또한 chaotropic guanidine-HCl을 제거 합니다. - 100 %refolding 버퍼에서 0.75 mL/분 추가 30 분에 대 한 열을 통과 하 고 있는지 확인
- 린스 차입 버퍼 (100 m m 인산 나트륨, 10 mM Tris, 이미 500 m m, pH 5.8) 뒤 물으로 A 라인 열 무시. 이 변성 버퍼는 지금에 의해 대체 되었습니다 차입 버퍼 AKTA 시스템에서 밖으로 청소 합니다.
- Refolding 버퍼 B와 0% 차입 버퍼 A 버퍼와 100% 차입 버퍼 refolding 0%로 처음에는 100%에서 40 분에 대 한 선형 그라디언트를 실행 하 여 2 mL/min에서 단백질을 Elute.
참고: 차입 버퍼에 이미의 높은 농도 PrP를 경쟁할 것 이다 '는 nickel(II)에 s 바인딩. 기본 단백질 피크 elute 그라데이션을 통해 방법의 대략 1/3을 시작 한다.- OD 280 nm 증가 대 한 크로마 시계.
- 큰 피크의 중심에서 단백질을 포함 하는 튜브만 수집.
참고: 각 2 mL의 eluted 분수 15 mL 튜브에 수집 됩니다. - 투 버퍼 (인산 나트륨 10 m m, pH 5.8)의 약 1/3 볼륨 (1 mL)으로 즉시 튜브에 포함 된 단백질을 희석.
- 얼음에 튜브를 즉시 배치
- Eluted 단백질 튜브에 포함 된 수영장.
- 가난한 투 카세트 (분자량 컷오프 10 kDa)에 단백질.
- 다음 미리 차게 투 버퍼 (3.6 L) 4 ° C에서 2 h에에서 카세트를 넣어 하룻밤을 위해 신선한 투 석 버퍼 (3.6 L)에 카세트를 전송. 확인 투 석 버퍼는 지속적인 동요에서.
- 0.2 µ m acrodisc 주사기는 주사기를 사용 하 여 필터를 통해 단백질을 투 석 후 필터.
- BCA 단백질 분석 실험 키트를 사용 하 여 단백질 농도 측정.
- 집중 0.3 mg/ml 단백질 농도 조정 하는 데 필요한 경우 희석 또는.
참고: SDS 페이지와 Coomassie 파란 얼룩이 순도 확인. - 단백질의 1 mL aliquots microcentrifuge 튜브 하 고 RT QuIC 프로토콜에 설명 된 대로 즉시 추가 사용까지-80 ° C에 저장.
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Representative Results
CWD 지저분한 추출 물 10% (w/v)에서 RT-QuIC 반응, 씨앗 수 있었다 아직 검출의 감도 낮은 27. RT QuIC 반응에 수 반하는 사용에 마우스 rPrP 기판의 높은 배경 형광을 피하기 위해 중요 한 단계는 지저분한 균질에 대 한 특정 버퍼를 사용 하는 보다 더 구체적인 수 사슴 rPrP 결과 27. NaPTA 강 수의 추가 반응 (그림 2)의 시드 활동의 확대를 억제 하지 않고 rPrP RT QuIC (그림 1)에서 자발적인 변환 감소. 더 나은 증폭 NaPTA 치료 시 관찰 되었다, CWD 긍정적인 배설물 샘플의 결과 형광 신호 (그림 1) 여전히 낮은 있었다. 또한, 일부 샘플의 프리온 증폭 낮은 형광 수준에서 일정 고원 도달. 이 rPrP의 저하/변성 또는 rPrP 풀 30소비 떨어져 통로의 형성 될 수 있는 반응의 채도 나타냅니다. 더 prions의 증폭을 개선 하 고 탐지의 감도 향상, 기판 교체 단계 프로토콜에 통합 되었다. RT QuIC 프로토콜 (그림 2) 기판 교체의 도입 증가 감도 (77%; 14 중 18 샘플 RT QuIC 긍정 했다)와 감지 (참조의 특이성 (100%, RT QuIC 돌린된 긍정에 부정적인 컨트롤의 없음) 표 1에서 청 외. 27). 마지막으로, 이러한 모든 단계 (그림 3) RT QuIC CWD prions, infectivity의 저급을 포함 하는 견본을 사용 하 여 검색에 대 한 안정적이 고 중요 한 프로토콜의 최적화를 주도.
기판 교체 후 RT QuIC 반응의 첫 번째 25 h 소개 되었다, 보충 반응에 의해 버퍼 신선한 기판 및 신선한 형광 염색 Th. 프로토콜에 기판 교체 단계를 도입 하 여 RT QuIC 반응 시간 75 h 50 h에서 연장 했다. 그림 2 에서처럼 기판 교체의 설립과 함께, 프리온 증폭의 상당한 개선을 관찰 했다.
그림 1: RT QuIC에 마우스 rPrP 기판의 감소 자발적인 변환 순화 CWD 음수가 지저분한 homogenate와 시드. 감염 되지 않은 엘크 (C181-006) 또는 사슴의 배설물 homogenates 10% (w/v)의 최종 농도를 대변 추출 버퍼에서 무 균 했다. 정화에 대 한 이러한 배설물 homogenates 처리 하 고 10 배 NaPTA 강 수에 의해 집중 했다. unpurified 지저분한 homogenates (한), NaPTA 정화와 집중 형태 (b) 표시 된 희석 기판으로 마우스 rPrP와 quadruplicate RT QuIC 반응의 초기값으로 사용 되었다. y 축의 표시 상대 Th-T 형광 단위는 x-axes 반응 시간을 묘사. 자발적인 변환의 감소 NaPTA 정화 배설물 샘플 (b)에서 보였다. 쳉 외 에서 사용 되는 데이터 27. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. CWD prions 기판 교체를 사용 하 여 배설물에 향상 된 탐지 합니다. CWD prions 구두 감염 (C051-05, C052-05) 개별 엘크의 지저분한 homogenates 및 NaPTA 강 수에 의해 집중 순화 했다. NaPTA 처리 샘플 2 x 10-1 2 x 10-3 씨 quadruplicate RT QuIC 반응 마우스 rPrP 기판으로 사용 사이 희석 했다. RT QuIC 분석 결과 50 h 또는 75 h (b)의 확장된 잠복기에 대 한 기판 교체의 일정 기간에 기판 교체 (는) 없이 수행 되었다. 후자의 경우, 기판 교체 RT QuIC 반응의 첫 번째 25 h 후 도입 되었다. 반응 볼륨의 90% 제거 되 고 rPrP 기판 및 Th. 갓된 RT QuIC 반응 혼합물으로 대체 프로토콜에 기판 교체 단계를 도입 하 여 실시간 QuIC 반응 시간 75 헤 쳉 외 에서 사용 되는 데이터를 50 시간에서 확장 되었다 27. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 흐름도 CWD 감염 cervids에서 PrPSc 지저분한 추출 기술 및 활동과 프리온 증폭 QuIC RT를 사용 하 여 시드 시험. CWD에 감염 된 동물에서 분 변 샘플 지저분한 추출 버퍼에 무 균, NaPTA 강 수 방법에 있으며 실시간 QuIC 분석 결과 의해 테스트. 후자는 기판 교체 단계를 도입 하 여 수행 되었다. NaPTA 및 기판 교체 단계의 자발적인 변환 및 강한 개선 활동 및 프리온 증폭 시드의 감소 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
RT QuIC 이전 고용 되었다 소변 및 배설물 추출 물 구두로 감염 된 흰 꼬리 사슴, 뮬 사슴 38의 CWD prions를 검출 하기 위하여. 이 원고에 표시 된 시스템 RT QuIC 분석 결과의 적응된 방법입니다. 추가 단계는 검색 및 CWD prions 감염된 동물의 분 변 물질에 대 한 분석 결과의 감도 향상 시키기 위해 "클래식" RT QuIC 분석 결과에 통합 했다.
배설물 추출 물에서 낮은 감도 RT QuIC 프로토콜의 개선에 우리를 이끌었다. 배설물에 prions의 민감한 생체 외에서 탐지를 위해 중요 한 단계는 프리온 변환 및 전파 방해와 탐지의 감도 향상 구성 요소를 제거 하려면 샘플 준비에 대 한 추가 되었습니다. 전 임상 및 임상 CWD 감염 된 엘크, 시드 활동을 감지 하 고 배설물 추출 물에서 프리온 변환의 검출 한계 향상 중요 했다 RT QuIC 및 NaPTA/sarkosyl 치료의 프로토콜에 기판 교체를 통합 .
NaPTA 강 수 일반적으로 sarkosyl 추출 분리 하 고 PrPSc 감지 수준으로 집중을 동반 하는 일반적인 기술입니다. NaPTA이 선호 sarkosyl은 셀 시스템 44에서 낮은 농도에서 프리온 변환을 촉진 하기 위하여 알려진 세제 PrPC 43 이상 PrPSc 를 침전 시키기 위하여 알려져 있다. 이 정렬, NaPTA 및 sarkosyl의 조합을 사용 하 여 생성할 수 있습니다 원 집계에 생체 외에서 의 높은 수익률 45,,4647전에 같이. 이 방법론 이전 RT QuIC 분석 결과 순화 된 타 액 39 와 전체 혈액 40같은 표본에서 주변 CWD prions를 성공적으로 감지 하에 통합 되었습니다. 우리의 연구는 배설물 샘플 준비의 프로토콜에서 NaPTA/sarkosyl 정화를 통합 하면 RT QuIC 여 CWD 프리온 감지 하는 최초의 증거를 제공 한다. 또한,이 방법론 우리 CWD 음수가 RT QuIC 분석 결과에서 배설물 homogenates에 rPrP 기판의 자발적인 변환 줄일 수 있었다.
잠재적인 메커니즘 기판 교체 30의 효과 설명 하기 위해 제안 되었습니다. (전에 신선한 기판의 추가) 반응의 첫 번째 라운드에서 적은 양의 씨앗 RT QuIC 반응에 추가 됩니다. RPrP의 일부만 시드 반응에 통합 됩니다, 하는 동안 기판의 나머지 중 양식 비-아 밀 로이드 집계에 반응 판 우물의 벽 상호 작용에 의해 사용 될 수 있습니다. 또는 덜 하는 경향이 참조로 변환할 수 있는 형식으로 변경할 수 공격 한 RT QuIC 제품 원래 씨앗 보다는. 결과적으로, 씨앗에 rPrP의 설립 속도가 느린, 그리고 fibril 형성 지연 단계에서 감지 되지 않습니다. 시드 RT QuIC 제품 성장 지연 위상에는 마지막으로 "빠른 어셈블리 단계"에 도달 하 길쭉한, prions의 작은 동요를 통해 세분화 하 여 빠르게 증폭 또는 측면 추가 할 수 있다. 이 단계에서 반응에 추가 하는 신선한 기판 형성 난다 집계 보다는 시드 제품으로 쉽게 통합 됩니다. 우리의 프로토콜에 기판 교체 단계의 설립이 했다 증가 감도; 수정 그것은 PrPSc 전 임상 동물 또는 포함 억제 화합물의 매우 낮은 금액으로 샘플에서 프리온 씨앗을 감지 하는 데 유용 했다.
21을 설명 하는 첫 번째 시험관에 단백질 misfolding 증폭 분석 결과, 몇 가지 장점이 PMCA 보다 RT QuIC 분석 결과 사용 하 여. PMCA 튜브 incubated 있으며 sonicated sonicator; 포함 된 물 욕조에 튜브는 sonicator의 주변에 위치 센터 48에 위치 하는 튜브에 비해 증폭의 적은 효능을 보여줍니다. RT QuIC 시스템 떨게 컨트롤 하기 쉬울 것 같다. 그러나 96 잘 포맷의 사용은 RT-QuIC,, Moudjo 그 외 여러분 에 의해 개발 된 mb PMCA의 진정한 장점은 49 , 50을 비슷한 혜택을 보여주지만 여전히 PMCA에 사용 됩니다.
기판, RT QuIC 사용 재조합 rPrP 변환; 반면, 대부분의 경우에서 PMCA 정상적인 뇌 homogenate를 사용합니다. 또한, RT QuIC 아무 순서 상 동에서는 종자와 기판 51-53사이입니다.
공동 인자의 존재 프리온 복제 PMCA에 필요 하며 결과 제품 전염성이 있다. 그러나,이 RT QuIC의 분석 결과에 증폭된 PrP 전염성이 되지 않습니다. 증폭 분석 실험 체 외에 에서 가장 아마 PrPC 의 자발적인 변환 때문에 거짓 긍정적인 반응의 발생은 반복 문제 이다. 따라서,이 연구에 사용 된 조건과 분석 결과 시드 rPrP 변환 및 자발적인 변환의 차이 최대화 하기 위해 그러한 장애를 최소화 하기 위해 맞게 했다.
끝으로, NaPTA/sarkosyl 치료 배설물에서 분석 결과 억제제의 제거를 가능 하 게 하 고 자발적인 변환을 감소 시킨다. 흥미롭게도, 치료는 precipitatedPrPSc의 시드 작업을 방해 하지 않았다. 또한, 탐지의 감도 기판 교체를 수반으로 채택 될 때 크게 향상 되었다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 제공 하는 교육 및 cervid PrP 세균성 식 플라스 미드 박사 바이런 Caughey (NIH 록 키 마운틴 연구소)에 감사입니다. SG는 캐나다 연구의 자 프로그램에 의해 지원 됩니다. 우리는이 연구에 대 한 자금 게놈 캐나다, 앨버타 프리온 연구소와 앨버타 농업 게놈 알버타, 캘거리 대학이이 작품 지원 통해 임업에서 SG을 인정 합니다. 우리는 동물 연구에 대 한 마가렛 Gunn 재단에서 연구 보조금을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Acrodisc seringe filters | PALL | 4652 | |
| amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit | Millipore | UCF901024 | |
| BD 10 ml seringe | VWR | CA75846-842 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Corning bottle-top vacuum filters | Sigma-Aldrich | 431118 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| gentleMACS M Tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | ThermoFisher Scientific | 12780029 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| N2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 15502048 | |
| N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma-Aldrich | ML9150 | |
| Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K | PALL | OD100C34 | |
| Nunc sealing tapes | ThermoFisher Scientific | 232702 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-000 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Calbiochem | 7910-OP | |
| sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) | Sigma-Aldrich | 496626 | |
| Thioflavin T | Sigma-Aldrich | T3516 | |
| Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Triton-100 | Calbiochem | 9410-OP | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial buffers and solutions | |||
| BugBuster Master Mix | Nogagen | 71456-4 | |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 1018401 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) | Life Technoligies | P5493 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977015 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standards and commercial kits | |||
| Express Autoinduction System 1 | Novagen | 71300-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment setup | |||
| AKTA protein purification systems FPLC | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Beckman Avanti J-25 Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Beckman rotor JA-25.50 | Beckman Coulter | ||
| Beckman rotor JA-10 | Beckman Coulter | ||
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sofware | |||
| MARS Data Analysis | BMG Labtech | ||
| GraphPad Prism6 | GraphPad software |
References
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