Summary
Cette étude démontre l’utilité et la facilité de la mesure d’extension quantitative de membrane cellulaire et sa corrélation avec la capacité adhésive des cellules. Comme un exemple représentatif, nous montrons ici que Dickkopf-protéine 3 (DKK3) favorise la formation de lobopodia accrue et l’adhérence cellulaire dans le corticosurrénalome cellules in vitro.
Abstract
Répertoire d’extension de la membrane de la cellule module divers comportements malignes des cellules cancéreuses, y compris leurs potentiels d’adhésif et migrateurs. La capacité avec précision, classer et quantifier des extensions de la cellule et mesurer l’effet sur la capacité adhésive de la cellule est jugés essentielle pour déterminer comment signalisation cellulaire événements incidence du cancer cell comportement et agressivité. Nous décrivons ici la in vitro la conception et l’utilisation d’une cellule extension quantification méthode conjointement avec un test de capacité d’adhérence un modèle établi in vitro de corticosurrénalome (ACC). Plus précisément, nous testons les effets de DKK3, un suppresseur de tumeur présumée et un facteur de différenciation favorable, sur le phénotype d’extension de membrane d’une lignée cellulaire ACC, SW-13. Nous proposons ces dosages à fournir relativement simple, fiable et facilement interprétable métriques à mesure ces caractéristiques dans des conditions expérimentales différentes.
Introduction
Dysregulated WNT signaling joue un rôle essentiel dans la corticosurrénale malignités1. Les méthodes utilisées dans cette étude étudient si silencieux de DKK3, un régulateur négatif de signalisation WNT, représente un événement de dédifférenciation dans le cortex surrénal et favorise la formation de tumeurs dans le contexte des changements de répertoire de cellule-extension. DKK3 est un 38 kDa sécrétée glycoprotéine avec un peptide signal de N-terminal et études antérieures ont démontré que son expression forcée a abouti à l’arrêt du cycle cellulaire, inhibe le comportement agressif de malin et inversé épithéliale-mésenchymateuse transition2.
Le comportement malin de corticosurrénalome (ACC) et d’autres cancers est, en partie influencé par la capacité des cellules tumorales pour s’interfacer avec les surfaces environnantes, y compris la matrice extracellulaire, ce qui facilite à son tour l’invasion des cellules tumorales et 3de migration. Le rôle de membrane de cellules spécifiques figurant dans la progression du cancer est plus en plus démontré dans des contextes variés, principalement par le biais de la formation des filopodes. Par exemple, la surexpression des canaux calciques de type L s’est avérée d’induire la formation de filopodes et promouvoir la tumeur cellulaire invasion4. De même, Fascin, une protéine de liaison au minimum l’actine exprimée dans les tissus normaux, est également surexprimée dans les cellules cancéreuses en liaison avec les filopodes formation5. Lobopodia formation permet des fibroblastes non malignes migrer efficacement par le biais de la matrice extracellulaire, cependant, il a été démontré que les cellules de Fibrosarcome s’appuient sur métalloprotéinase activité remplace lobopodia pour faciliter la migration cellulaire et invasion,6. Nous avons montré que la tumeur suppresseurs, y compris les Ras association domaine familial 1 isoforme un (RASSF1A) et DKK3, peut fonctionner pour modifier les éléments du cytosquelette et favorisent la formation de lamellipodia et bloquer des propriétés invasives7,8.
Par conséquent, il est essentiel pour caractériser les effets des gènes impliqués dans la carcinogenèse et leur relation avec les altérations d’extension de membrane cellulaire, évaluant spécifiquement formation filopodes, lobopodia et lamellipodia dans des conditions de test. Les techniques actuelles de state-of-the art comprennent l’utilisation de méthodes de microscopie de plus en plus sophistiqués, le marquage fluorescent ou algorithmes informatiques complexes pour l’acquisition de données et l’interprétation. Bien que ces méthodes offrent de nouveaux et puissants outils d’analyse, leur complexité limite leur utilisation généralisée et l’adaptabilité dans des expériences de biologie cellulaire. En outre, la quantification précise et l’observation des changements dans la morphologie cellulaire extension n’est pas généralement mesurées9,10. En revanche, nous présentons ici une technique qui quantifie précisément les altérations d’extension de cellules à l’aide de techniques microscopiques standard et méthodes facilement adaptable en vitro . Ces méthodes également quantifier chaque type d’extension cellule simultanément pour chaque cellule analysée et déterminent les changements globaux dans le répertoire d’extension de membrane cellulaire. Nous montrons aussi comment ces changements peuvent se rapporter à des propriétés d’adhérence cellulaire.
À titre d’exemple expérimental, nous utiliserons une lignée de cellules préalablement créé de SW-13, désigné SW-DDK3, qui a été solidement transfectées avec des vecteurs de plasmide pCMV6-entrée/DKK3 et constitutivement risque DKK3, un facteur de différenciation dans la glande surrénale. Les cellules non transfectées de SW-13 et SW-13 cellules stablement transfectées avec un vecteur vide (entrée pCMV6), désigné SW-Neo, servira de contrôles expérimentaux.
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Protocol
1. caractéristiques de l’Extension des cellules
- Maintenir SW-13, SW-Neo et SW-DKK3 des cellules dans un incubateur humidifié standard à 37,0 ° C et 5 % de CO2 dans un milieu d’Eagle modifié de Dulbecco additionné de sérum de veau fœtal 10 % et de 10 000 U/mL de pénicilline et de streptomycine (désignée comme « moyenne de croissance »).
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et plaque 5 000 cellules / puits pour SW-13, SW-Neo et SW-DKK3 lignes en plaques 6 puits distinctes et se développent pendant la nuit dans le milieu sur couvre-objet en verre stérile.
- Après la croissance durant la nuit, pour chaque puits, aspirer le milieu de croissance, laver les cellules avec 1 mL de chaude solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et puis fixer les cellules avec 1 mL de 3,7 % de formaldéhyde pendant 10 min.
- Aspirer les cellules formaldéhyde et tache dans chaque puits avec 1 mL de violet de gentiane 0.05 % pour 30 min. excès de lavage colorant loin à l’aide de trois lavages de 1 mL d’eau désionisée.
Remarque : Selon le niveau d’absorption du colorant, plusieurs lavages supplémentaires peuvent être nécessaire pour enlever le fond de coloration pour promouvoir la visualisation de la cellule.- À l’aide de pinces à pointe fine, récupérer des lamelles couvre-objet et placez-les face vers le bas sur une lame de verre étiquetées avec une goutte de réactif montage clair.
- Sous un microscope optique, choisir au hasard 20 vues des cellules ne se chevauchent de chaque lamelle couvre-objet pour le dosage d’extension cellulaire.
- Prendre photomicrographies grossissement 400 x de chaque champ de vision. Directement de compter le nombre de chaque type d’extension pour chacune des 20 cellules représentatives.
Remarque : à ce titre, 20 cellules isolées doivent être examinées pour chaque condition testée garantir des résultats fiables. Filopodes ont été définis par les extensions de cellulaires avec une base de 5 microns ou moins et d’un seul sommet. Lobopodia ont été définis par les extensions de cellulaires avec une base de 5 à 20 microns de longueur contenant des extensions avec apex multiples. Lamellipodia ont été définis par les extensions de cellule qui sont supérieures à 20 microns de longueur, avec ou sans apex. Selon le type de cellules testées, les tailles de prolongements cellulaires peuvent différer et nécessitent raffinement d’identifier les paramètres.
- Prendre photomicrographies grossissement 400 x de chaque champ de vision. Directement de compter le nombre de chaque type d’extension pour chacune des 20 cellules représentatives.
- Déterminer le nombre moyen de chaque extension de cellules dans chaque type de cellule (c.-à-d., SW-13, Neo-SW, SW-DDK) à travers les 6 puits examinés.
- À l’aide d’un test statistique de l’analyse de variance (ANOVA), comparer les différences dans le pourcentage moyen des extensions de la membrane cellulaire entre les types de cellules différents test.
2. adhésion Assay
- Maintenir SW-13, SW-Neo et SW-DKK3 des cellules dans un incubateur humidifié standard à 37,0 ° C et 5 % de CO2 dans le milieu.
- Utilisant un hémocytomètre, compter et plaque 100 000 cellules de SW-13, SW-Neo et SW-DKK3 / puits dans les plaques 6 puits distinctes et se développer pendant la nuit dans le milieu.
- Plaques 6 puits semences pour chaque type de cellule testé, à l’aide d’une plaque pour chacun des 6 points désignés de temps testés ci-dessous.
Remarque : Les points dans le temps peuvent varier pour différents types de cellules.
- Après une nuit d’incubation, laver les cellules avec du PBS chaud une fois puis ajouter 0,5 mL de solution de dissociation cellulaire non-enzymatique 1 x dans chaque puits.
- Agiter la plaque pour diffuser la solution de dissociation cellulaire. Aspirer la plaque désignée à des moments définis (c.-à-d., 1, 2, 3, 5, 10 et 15 min) et laver ensuite avec 1 mL de solution PBS chaud trois fois.
- Entre les lavages, secouer doucement les plaques pour détacher les cellules faiblement attachées.
- Aspirer les éventuels PBS et fixer les cellules restant fixés à la plaque avec 1 mL de 3,7 % de formaldéhyde pendant 10 min.
- Colorer les cellules avec 1 mL de violet de gentiane 0.05 % pendant 30 min puis lavez colorant excédentaire avec 1 mL d’eau désionisée. Titrer lavage pour promouvoir la visualisation de la cellule.
Remarque : Selon le niveau d’absorption du colorant, plusieurs lavages supplémentaires peuvent être nécessaire pour promouvoir la visualisation de la cellule. - À l’aide d’un microscope optique avec grossissement de 100 x, compter les cellules jointes restantes dans chaque puits pour chaque plaque.
Remarque : Utilisation de règles transparentes ou guides de plume fine sur le côté inférieur de la plaque de marquage permettra pour éviter les comptages répétés des cellules mêmes. - Déterminer le nombre moyen de cellules attachées par puits pour chaque plaque.
- Comparer le taux de détachement cellulaire entre SW-13, SW-Neo et SW-DDK3 cellules au cours de la période définie à l’aide d’un test bilatéral de statistique ANOVA.
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Representative Results
En utilisant les tests ci-dessus, les effets de la surexpression de la DKK3 sur la morphologie cellulaire extension et propriétés d’adhérence cellulaire ont été testés dans la lignée du CAC établie SW-13, in vitro. Les cellules surexprimant DKK3 ont été générés par stablement transfectants SW-13 cellules avec Myc-DDK étiqueté pCMV6-entrée/DKK3 plasmide vecteur et désigné comme SW-DKK3. De même, cellules stablement transfectées avec le vecteur vide pCMV6-entrée ont été créés comme un contrôle de transfection et passage et définis comme SW-Neo. SW-13 cellules ont été utilisées comme un contrôle parent-cellule supplémentaire. La surexpression de la DKK3 dans SW-DKK3 a été confirmée par PCR en temps réel quantitative et Western blot techniques8.
Brièvement, les cellules testées SW-13, SW-Neo et SW-DKK3 ont été cultivées pendant la nuit dans 6 assiettes bien sur lamelles. Cellules ont été ensuite fixés avec le formaldéhyde et colorées par le violet de gentiane. Cellule extension caractéristiques ont été quantifiés puis en microscopie par les paramètres décrits ci-dessus. Analyse, SW-DKK3 cellules affichent un phénotype plus différencié noté par lobopodia accrue et la polarité cellulaire multidirectionnel (p = 0,01, aller simple ANOVA, Figure 1 et Figure 2), évoque un manque de motilité directionnelle. En revanche, des cellules parentales SW-13 et SW-Neo maintenu polarité et affiche des filopodes plus disposés dans une orientation planaire (p = 0,01, aller simple ANOVA, Figure 1 et Figure 2)8.
Pour déterminer si une formation accrue lobopodia modification propriétés de fixation cellule, nous avons effectué un test d’adhérence cellulaire. En bref, les cellules ont été cultivées pendant la nuit et détachement cellulaire a été réalisée avec la solution de dissociation cellulaire non enzymatique au temps progressifs intervalles jusqu'à 15 min. cellules étaient alors fixé avec du formaldéhyde, colorées par le violet de gentiane et compté en utilisant une lumière microscope. SW-DKK3 cellules montrent une affinité de fixation significativement plus élevée par rapport aux cellules SW-13 et SW-Neo (p < 0,01, 2-way ANOVA, Figure 3). Ces résultats indiquent que les DKK3 favorise la formation de lobopodia, qui à son tour favorise la cellule annexe8.
Figure 1 : expression forcée de DKK3 modifie les extensions de la membrane cellulaire. SW-13 (A)et SW-DKK3 SW-Neo (B) (C) cellules étaient cultivées sur des lamelles de verre, fixés avec du formaldéhyde, colorées par le violet de gentiane et imagés. Photomicrographies sont prises à l’aide d’un microscope optique grossissement x 400. SW-13 et SW-Neo cellules constituées principalement des filopodes (flèches rouges) et des extensions de cellules lamellipodia (arc bleu). En revanche, les cellules de SW-DKK3 forment plus lobopodia (petit arc de cercle vert), avec absence quasi totale de lamellipodia et très peu filopodes. Tandis que les cellules (B) SW-13 (A) et SW-Neo semblent être polarisées (flèches orange) avec filopodes à la fine pointe et lamellipodia à l’orée de calorifugeage, SW-DKK3 cellules (C) a montré les lobopodia multidirectionnel uniformément répartie. Des expériences ont été effectuées en double. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : DKK3 favorise la formation de lobopodia. La représentation relative des filopodes, lobopodia et lamellipodia par cellule pour chaque type de cellule ont été calculés par tabulating extensions de cellule sur les cellules individuelles. Cellules en vingt photomicrographies du champ microscopique au hasard prise de vues (grossissement de x 400) de SW-13, SW-Neo et SW-DKK ont été utilisées pour la quantification. Barres d’erreur indiquent écart-type et (*) indique p < 0,01 à l’aide d’une ANOVA à ce qui représente une augmentation significative du nombre de lobopodia dans les cellules de SW-DKK. Un total de 20 cellules ont été examinés pour chaque type de cellule testés et expériences ont été effectuées en double. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : DKK favorise l’adhésion cellulaire. Cent mille SW-13, SW-Neo et SW-DKK3 cellules / puits de plaques 6 puits ont été autorisés à se développer pendant la nuit et ont été traités pendant le détachement aux moments désignés (axe x). Les cellules restant attaché étaient fixes, colorées et comptés et les pourcentages de cellules restant annexé sont tracé (axe y). Barres d’erreur indiquent écart-type et (*) indique p < 0,01 et (*) indique p < 0,001 à l’aide d’une ANOVA 2 voies, ce qui représente une augmentation significative de SW-DKK cellule force d’attachement. Chaque expérience a commencé avec 100 000 cellules et expériences ont été effectuées en double. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous décrivons ici une méthode quantitative in vitro afin de caractériser les extensions de la cellule avec facilité, quelques pièges et reproductibilité fiable qui peut être appliquée pour différentes conditions de test. En outre, essais d’adhésion et/ou la motilité simples, quantifiables peuvent être effectuées simultanément pour mettre en corrélation pouvant avoir une importance fonctionnelle des altérations observées dans les extensions de la membrane cellulaire.
Cependant, ces méthodes peuvent présenter certaines limites potentielles. Tout d’abord, les critères spécifiés ici d’identifier les différents types d’extensions de cellules sont basés sur la morphologie des cellules corticosurrénale SW-13 et donc probablement besoin de raffinement dans la classification des paramètres lorsqu’il est appliqué à d’autres types de cellules et/ou les conditions expérimentales. En outre, dans les expériences de temps prolongées, les influences possibles des altérations extension membrane cellulaire sur le cycle cellulaire et l’apoptose besoin à prendre en considération.
En second lieu, le protocole peut dépendre de potentiels appelant individualisé par l’examinateur, ce qui pourrait limiter la reproductibilité de l’essai en raison de la variation inter observateur. Le nombre élevé de cellules qui sont examinés pour chaque groupe de tests susceptible surmonte la partie de cette partialité ; plus précisément, lorsque 20 cellules sont examinées pour chaque dosage. Inclusion de plusieurs personnes pour effectuer l’extension de l’appel d’une manière aveugle est suggérée pour atténuer le biais potentiel d’appel subjectif.
Enfin, il faut quand associant des changements dans le commutateur de classe extension cellulaires avec des altérations dans les propriétés de fixation, où une version simplifiée des propriétés d’adhérence pourrait être le résultat de changée préférence pour substrat de pièce jointe plutôt que l’altération affinité pour le substrat testé. Commutateur de classe extension cellulaires de couplage avec la migration ou l’invasion dans le contexte des divers constituants de la matrice extra cellulaire pourrait préciser les propriétés d’adhérence observées.
En conclusion, le protocole décrit ici fournit une méthode simple et fiable pour mesurer l’importance fonctionnelle de la membrane cellulaire extension interrupteur dans diverses conditions de test.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
La Fondation de Grant Ohse financé ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
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