Summary
Este estudo demonstra a utilidade e a facilidade de medição de extensão quantitativa da membrana celular e sua correlação com capacidade adesiva de células. Como um exemplo representativo, mostramos aqui essa proteína relacionada ao Dickkopf 3 (DKK3) promove aumento lobopodia formação e aderência de célula em carcinoma adrenocortical em vitrode células.
Abstract
Repertório de extensão da membrana celular modula vários comportamentos malignos das células cancerosas, incluindo seus potenciais de adesivo e migratórias. A capacidade de precisão de classificar e quantificar as extensões de célula e medir o efeito sobre a capacidade adesiva da célula é fundamental para determinar como célula-sinalização de eventos impacto câncer célula comportamento e agressividade. Aqui, descrevemos em vitro concepção e utilização de um celular extensão quantificação método em conjunto com um ensaio de capacidade de aderência em um modelo estabelecido em vitro para carcinoma adrenocortical (ACC). Especificamente, nós testamos os efeitos da DKK3, um supressor de tumor putativo e um fator de pró-diferenciação, sobre o fenótipo de extensão de membrana da linha celular ACC, SW-13. Propomos estes ensaios para fornecer relativamente simples, confiável e facilmente interpretável métricas para as medidas estas características sob diferentes condições experimentais.
Introduction
Dysregulated WNT sinalização desempenha um papel crítico na malignidades adrenocortical1. Os métodos utilizados neste estudo investigam se silenciar de DKK3, um regulador negativo de sinalização WNT, representa um evento de quê no córtex adrenal e promove a formação de tumor no contexto de alterações de repertório de célula-extensão. DKK3 é um 38 kDa secretado glicoproteína com um peptídeo sinal do N-terminal e estudos anteriores demonstraram que sua expressão forçada resultou na detenção do ciclo celular, inibiu o comportamento agressivo do maligno e invertida epitelial-mesenquimal transição2.
O comportamento maligno do carcinoma adrenocortical (ACC) e outros tipos de câncer é, em parte, influenciada pela capacidade de células tumorais para fazer a interface com as superfícies circundantes, incluindo a matriz extracelular, que por sua vez facilita a invasão de células do tumor e migração de3. O papel das extensões específicas de membrana celular na progressão do câncer é cada vez mais sendo demonstrado em diversos contextos, principalmente através da formação de filopodia. Por exemplo, foi encontrado para induzir a formação de filopodia e promover de invasão de células de tumor4superexpressão dos canais de cálcio tipo L. Da mesma forma, Fascin, um ligação proteína minimamente o actínio expressa em tecido normal, é também Blumental em células cancerosas em associação com filopodia formação5. Lobopodia formação permite que não-malignas fibroblastos efetivamente migrar através da matriz extra-celular, no entanto, tem sido demonstrado que células de Fibrossarcoma dependem de metaloproteinase atividade substituem lobopodia para facilitar a migração celular e invasão de6. Mostramos esse tumor supressores, incluindo Ras Associação domínio família 1 isoform um (RASSF1A) e DKK3, pode funcionar para alterar elementos do citoesqueleto e promover a formação de lamellipodia e obste Propriedades invasivas7,8.
Como tal, é fundamental para caracterizar os efeitos de genes envolvidos na carcinogênese e sua relação com alterações de extensão da membrana celular, avaliando especificamente a formação filopodia, lobopodia e lamellipodia sob condições de teste. Atual estado da arte técnicas incluem o uso de métodos cada vez mais sofisticados de microscopia, etiquetando fluorescente e/ou algoritmos de computador complexo para aquisição de dados e interpretação. Enquanto esses métodos fornecem novas e poderosas ferramentas analíticas, sua complexidade limita sua utilização generalizada e adaptabilidade em experimentos de biologia celular. Além disso, a quantificação precisa e observação de alterações na morfologia de extensão de célula não é normalmente medido9,10. Em contrapartida, apresentamos aqui uma técnica que quantifica com precisão alterações de extensão de célula usando técnicas padrão microscópicas e facilmente adaptável em vitro métodos. Esses métodos também quantificar cada tipo de extensão de células simultaneamente para cada célula analisado e determinar mudanças gerais no repertório de extensão da membrana celular. Também mostramos como essas alterações podem se relacionar Propriedades de adesão celular.
Como um exemplo experimental, vamos usar uma linha de celular criado anteriormente de SW-13, designado SW-DDK3, que tem sido estàvel transfected com vetores de plasmídeo pCMV6-entrada/DKK3 e constitutivamente overexpresses DKK3, um factor diferenciador na glândula adrenal. Non-transfectadas SW-13 células e células SW-13 estàvel transfectadas com vetor vazio (pCMV6-entrada), designado SW-Neo, servirá como controles experimentais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. célula características de extensão
- Manter SW-13, SW-Neo e SW-DKK3 células em uma padrão incubadora umidificada 37,0 ° c e 5% de CO2 em meio de águia de Dulbecco modificado suplementado com 10% de soro fetal bovino e 10.000 de U/mL penicilina e estreptomicina (designado como 'meio de crescimento').
- Contar as células usando um hemocytometer e placa de 5.000 células por poço para SW-13, SW-Neo e SW-DKK3 linhas em chapas separadas 6-poços e cresce durante a noite no meio de crescimento as lamelas de vidro estéril.
- Depois de crescimento durante a noite, para cada poço, Aspire o meio de crescimento, lavar as células com 1 mL de quente fosfato salino (PBS) e em seguida fixar as células com 1 mL de formaldeído de 3,7% por 10 min.
- Aspirado de formaldeído e mancha de células em cada poço com 1 mL de violeta de cristal de 0.05% por 30 min. excesso de lavagem tingem usando três lavagens de 1 mL de água desionizada.
Nota: Dependendo do nível de absorção de corante, várias lavagens adicionais podem ser necessários para remover a coloração para promover a visualização de célula de plano de fundo.- Usando a pinça com ponta fina, recuperar as lamelas e colocá-los face para baixo sobre uma lâmina de vidro rotulado com uma gota de reagente de montagem clara.
- Sob um microscópio de luz, escolha aleatoriamente 20 visualizações de células não-sobreposição de cada lamela para o ensaio de extensão de célula.
- Leve fotomicrografias ampliação de 400 x de cada campo de visão. Conte diretamente o número de cada tipo de extensão para cada uma das 20 células representativas.
Nota: como tal, 20 células isoladas devem ser examinadas para cada condição testada garantir resultados confiáveis. Filopodia foram definidos por extensões celulares com uma base de 5 mícrons ou menos e um único vértice. Lobopodia foram definidos por extensões celulares com uma base de 5 a 20 microns de contendo extensões de comprimento com vários ápices. Lamellipodia foram definidos por extensões de célula que são superiores a 20 mícrons de comprimento e com ou sem ápices. Dependendo do tipo de célula testado, os tamanhos das extensões de célula podem ser diferentes e podem exigir o refinamento de identificar parâmetros.
- Leve fotomicrografias ampliação de 400 x de cada campo de visão. Conte diretamente o número de cada tipo de extensão para cada uma das 20 células representativas.
- Determine o número médio de cada extensão de célula em cada tipo de célula (i.e., SW-13, Neo-SW, SW-DDK) através dos 6 poços examinados.
- Usando um teste estatístico unidirecional análise de variância (ANOVA), compare as diferenças no percentual médio de extensões da membrana celular entre os teste diferentes tipos de células.
2. adesão ensaio
- Manter SW-13, SW-Neo e SW-DKK3 células numa incubadora umidificado padrão no 37,0 ° C e 5% CO2 em meio de crescimento.
- Usando um hemocytometer, contar e placa 100.000 células de SW-13 e Neo-SW SW-DKK3 por bem em chapas separadas 6-poços e crescer durante a noite, no meio de crescimento.
- Placas de 6 boas sementes para cada tipo de célula testaram, usando uma placa para cada um dos 6 pontos designados tempo testados abaixo.
Nota: Os pontos de tempo podem variar para diferentes tipos de células.
- Após a incubação durante a noite, lavar as células com PBS quente uma vez, em seguida, adicionar 0,5 mL de solução de dissociação de célula não-enzimática de 1x a cada poço.
- Agite a placa para espalhar a solução de dissociação de célula. Aspirar a placa designada em pontos de tempo definido (isto é, 1, 2, 3, 5, 10 e 15 min) e em seguida lavar com 1 mL de solução de PBS quente três vezes.
- Entre lavagens, bata levemente as placas para desanexar células frouxamente anexadas.
- Aspire qualquer restantes PBS e fixar as células restantes anexadas à placa com 1 mL de formaldeído de 3,7% por 10 min.
- Mancha de células com 1 mL de violeta de cristal de 0.05% por 30 min, em seguida, lave o corante em excesso com 1 mL de água desionizada. Titula-se lavagem para promover a visualização da célula.
Nota: Dependendo do nível de absorção de corante, várias lavagens adicionais podem ser necessários para promover a visualização da célula. - Usando um microscópio de luz, ampliação de 100 x, conte as células restantes anexadas em cada poço para cada placa.
Nota: Uso de réguas transparentes ou marcar guias caneta fina no lado inferior da placa irá ajudar a evitar a repetida contagem das mesmas células. - Determine o número médio de células anexados por bem para cada placa.
- Compare a taxa de desprendimento de célula entre 13-SW, SW-Neo e SW-DDK3 células durante o período de tempo determinado usando um teste estatístico de ANOVA nos dois sentidos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Os efeitos da superexpressão de DKK3 na célula extensão morfologia e propriedades de aderência de célula usando os ensaios acima, foram testados na linha celular estabelecida ACC SW-13, em vitro. Células superexpressão DKK3 foram geradas por estàvel transfecting SW-13 células com Myc-DDK etiquetado plasmídeo pCMV6-entrada/DKK3 vectores e designado como SW-DKK3. Da mesma forma, células estàvel transfectadas com vetor vazio pCMV6-entrada foram criadas como um controle do transfection e passagem e definidas como SW-Neo. SW-13 células foram usadas como um controle adicional-célula-mãe. Superexpressão de DKK3 em SW-DKK3 foi confirmada por PCR quantitativo em tempo real e Western blot técnicas8.
Brevemente, células testadas 13-SW, SW-Neo e SW-DKK3 cresceram durante a noite em 6 pratos bem em lamínulas. As células foram então fixo com formaldeído e coradas com violeta cristal. Características de extensão de célula então foram quantificadas sob microscopia pelos parâmetros descritos acima. Na análise, SW-DKK3 células exibido um fenótipo mais diferenciado, anotado por aumento lobopodia e polaridade celular multidirecional (p = 0,01, One-Way ANOVA, Figura 1 e Figura 2), sugestivo de uma falta de motilidade direcional. Em contraste, células SW-13 e SW-Neo parentais mantida polaridade e exibido maior filopodia disposto em uma orientação planar (p = 0,01, One-Way ANOVA, Figura 1 e Figura 2)8.
Para determinar se aumento lobopodia formação alterado Propriedades de fixação da célula, foi realizado um ensaio de aderência de célula. Resumidamente, as células foram cultivadas durante a noite e desprendimento de células foi realizado com solução de dissociação de célula não enzimáticos em tempo progressivo de intervalos de até 15 min. de células foram então fixo com formaldeído, manchado com violeta de cristal e contados usando uma luz microscópio. SW-DKK3 células mostraram uma afinidade de ligação significativamente maior em comparação com células SW-13 e SW-Neo (p < 0,01, 2-way ANOVA, Figura 3). Estes resultados indicam que DKK3 promove a formação de lobopodios, que por sua vez promove a célula anexo8.
Figura 1: expressão forçada de DKK3 altera as extensões da membrana celular. SW-13 (A), SW-Neo (B)e SW-DKK3 (C) as células foram cultivadas em lamelas de vidro, fixadas com formol, manchadas com violeta de cristal e fotografadas. Fotomicrografias são tiradas usando um microscópio de luz na ampliação de x 400. SW-13 e SW-Neo células formaram principalmente filopodia (setas vermelhas) e extensões de célula de lamellipodia (arco azul). Em contraste, SW-DKK3 células formaram mais lobopodia (pequenos arcos verdes), com a quase ausência de lamellipodia e muito poucos filopodia. Enquanto as SW-13 (A) e SW-Neo (B) as células parecem ser polarizadas (setas laranja) com filopodia na vanguarda e lamellipodia na borda do revestimento, SW-DKK3 células (C) mostrou lobopodia multidirecional uniformemente distribuída. Experimentos foram realizados em duplicado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: DKK3 promove a formação de lobopodios. A representação relativa de filopodia lobopodia e lamellipodia por célula para cada tipo de célula foram calculados por tabulação extensões de célula em células individuais. Células em vinte fotomicrografias de campo microscópico aleatoriamente tomada de vistas (ampliação de 400 x) 13-SW, SW-Neo e SW-DKK foram utilizadas para a quantificação. Barras de erro indicaram o desvio padrão e (*) indica p < 0,01 usando uma ANOVA One-Way que representa um aumento significativo no número de lobopodios nas células SW-DKK. Um total de 20 células foram examinados para cada tipo de célula testado e experimentos foram realizados em duplicado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: DKK promove a adesão celular. Cem mil SW-13, SW-Neo e SW-DKK3 células por poço de placas boas 6 foram autorizadas a crescer durante a noite e foram tratadas por destacamento em pontos de tempo designado (eixo x). As células restantes anexado foram fixadas, manchadas e contadas e as porcentagens de células restantes anexado foram plotado (eixo y). Barras de erro indicam o desvio padrão e (*) indica p < 0,01 e (*) indica p < 0,001 usando uma ANOVA de 2 vias, que representa um aumento significativo no SW-DKK celular força de fixação. Cada experimento começou com 100.000 células e experimentos foram realizados em duplicado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui nós descrevemos um em vitro método quantitativo para caracterizar as extensões de células com facilidade, algumas armadilhas e reprodutibilidade confiável que pode ser aplicada para as várias condições de teste. Além disso, ensaios de aderência e/ou motilidade simples e quantificáveis podem ser executados simultaneamente para correlacionar o potencial significado funcional das alterações observadas nas extensões da membrana celular.
No entanto, estes métodos podem apresentar algumas limitações potenciais. Em primeiro lugar, os critérios especificados aqui para identificar diferentes tipos de extensões de célula baseiam-se na morfologia de célula adrenocortical SW-13 e daí provavelmente precisam de refinamento na classificação dos parâmetros quando aplicado a outros tipos de células e/ou condições experimentais. Além disso, em experiências de tempo-curso estendidas, as potenciais influências de alterações de extensão da membrana celular no ciclo celular e morte celular precisam ser considerados.
Em segundo lugar, o protocolo pode invocar potencial individualizado chamando pelo examinador, que pode limitar a reprodutibilidade do ensaio devido a variação inter observador. O elevado número de células que são examinadas para cada grupo de teste provavelmente supera parte deste viés; especificamente, quando 20 células são examinadas para cada ensaio. Inclusão de vários indivíduos para realizar extensão ligando de forma cega é sugerido para atenuar o potencial viés chamado subjetivo.
Finalmente, deve ter cuidado ao associar alterações nas propriedades de fixação, onde uma versão simplificada das propriedades de adesão pode ser o resultado de mudanças no interruptor de classe de extensão de célula alterada preferência para substrato de fixação em vez a afinidade alterada para o substrato testado. O interruptor de classe de extensão de célula de acoplamento com a migração ou invasão no contexto de vários componentes da matriz extra-celular poderia esclarecer as propriedades observadas de adesão.
Em conclusão, o protocolo descrito aqui fornece um método simples e confiável para medir o significado funcional da membrana celular extensão interruptor sob várias condições de teste.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
A Fundação de Grant Sesma financiado este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
- Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
- Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Jacquemet, G., et al. L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling. Nat Commun. 7, 13297 (2016).
- Machesky, L. M., Li, A. Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis. Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).
- Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells. J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).
- Korah, R., et al. Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma. Molecular cancer. 12, 87 (2013).
- Cheng, J. Y., et al. A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis. BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Cliffe, A., et al. Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration. Nat Commun. 8, 14905 (2017).
