Summary
La piel humana actúa como primera línea de defensa contra el medio ambiente externo. Presentamos un método para aislar queratinocitos humano primario de piel adulto. Estos queratinocitos aislados son útiles en numerosas configuraciones experimentales y son un modelo muy adecuado para el estudio de mecanismos moleculares en biología cutánea en vitro.
Abstract
La función principal de los queratinocitos es proporcionar la integridad estructural de la epidermis, manteniendo una barrera mecánica al mundo exterior. Además, queratinocitos juegan un papel esencial en la iniciación, mantenimiento y regulación de la respuesta inmune epidérmica por ser parte del sistema inmune innato responde a los estímulos antigénicos de una manera rápida y no específica. Aquí, describimos un protocolo para el aislamiento de keratinocytes humanos primarios de la piel adulta y demostrar que estas células responden a la diferenciación terminal inducida por calcio, medida por un aumento de expresión de la diferenciación marcador involucrin. Además, mostramos que los queratinocitos aislados responden a la activación de vías de señalización intracelular inducida por IL-1β como es medido por la activación de la vía de p38 MAPK. Tomados en conjunto, se describe un método para el aislamiento y cultivo de keratinocytes humanos primarios de la piel adulta. Porque los queratinocitos son el tipo celular predominante en la epidermis, este método es útil para el estudio de mecanismos moleculares en biología cutánea in vitro.
Introduction
La piel es el órgano más grande del cuerpo humano y sirve como una barrera protectora contra el medio ambiente externo. La piel se compone de dos capas principales: la dermis y la epidermis, donde la epidermis constituye la capa más externa de la piel. El tipo de célula más abundante en la epidermis es keratinocytes que comprende más del 95% de la masa1,de célula2. Los queratinocitos se mantienen en distintas etapas de diferenciación de la epidermis y se organizan en estratos basals, espinosas, granuloso y cornified que corresponden a etapas específicas de diferenciación3. La función principal de los queratinocitos es proporcionar la integridad estructural de la epidermis, produciendo una barrera intacta al mundo exterior.
Los queratinocitos también representan la primera línea de defensa contra patógenos en la piel y por lo tanto juegan un papel importante en la respuesta inmune innata4,5. Exposición de los queratinocitos a los estímulos externos conduce a la activación de vías de señalización intracelular y posteriormente, producción de un número de varios mediadores inflamatorios como citoquinas, quimiocinas y péptidos antimicrobianos. Estas proteínas derivados de queratinocitos participan en la respuesta inflamatoria por reclutar y activar las células inmunes tales como células dendríticas, neutrófilos y específicos6,de las células de T7. Así, porque los queratinocitos desempeñan un papel crucial en numerosos procesos biológicos, el fundamento de la técnica presentada aquí fue generar un modelo en vitro para estudiar la biología de la piel. Cultivos de queratinocitos primarios obtenidos de prepucio neonatal se utilizan a menudo para estudiar la piel biología8,9. Sin embargo, con la técnica descrita aquí, queratinocitos de ambos sexos se obtienen dando por resultado una mayor diversidad biológica de las células.
Aquí, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento y la generación de keratinocytes humanos primarios de piel de adultos, incluyendo el mantenimiento y la congelación de los queratinocitos. El objetivo general de este método es generar keratinocytes humanos primarios que pueden utilizarse como modelo para estudiar biología cutánea in vitro.
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Protocol
La recogida de muestras de piel de voluntarios sanos adultos sometidos a cirugía plástica requiere la aprobación del Comité de ética en las instituciones de acogida. Este protocolo fue aprobado por la Regional ética Comité de región Midtjylland, Dinamarca (M-20110027). El método aquí descrito se deriva de estudios similares por Maciaq et al. 10 y11del Liu y Karasek.
1. aislamiento de queratinocitos de la piel humana
- Empezar haciendo las siguientes soluciones: solución de 50 mL de 0.25% tripsina y 0.1% glucosa en DPBS. Mix y el filtro de esterilización (0,2 μm) la solución. Preparar 10 mL de RPMI 1640 + 2% solución FBS, 50 mL de medio sin suero DPBS y queratinocitos (KSFM). Añadir suplementos KSFM y 250 μl de gentamicina a 500 mL de KSFM. Caliente previamente la solución a 37 ° C antes de usar.
- Recoger la piel de voluntarios sanos adultos sometidos a cirugía plástica. Las muestras de piel utilizadas son aproximadamente 10 cm x 15 cm, pero pueden variar de tamaño. Enfriar la piel bajo transporte de transporte de las muestras de piel en una caja de espuma de poliestireno que contienen un elemento de enfriamiento. Si es necesario, la muestra de piel puede almacenarse a 4 ° C durante la noche.
- Quitar la grasa de debajo de la sección de la piel con pinzas, bisturís y tijeras esterilizadas.
- La hebilla de la sección de la piel (aproximadamente 10 cm x 15 cm) en una cubierta estéril sobre una placa con agujas. Primero, limpie la piel con una gasa esterilizada seca. Después, limpie la piel con una gasa esterilizada con etanol al 70%.
- Usando un cepillo de pies, corte de la capa superior (epidermis) de la sección de la piel y ponerla en un plato de Petri de 9 cm. Entonces, inmediatamente agregar 25 mL de la solución de tripsina/DPBS/glucosa (preparada en el paso 1.1) a la caja Petri. Incubar durante 30 min a 37 ° C.
- Usando una pipeta retirar la solución de tripsina/glucosa/DPBS de la caja Petri y añadir 10 mL de RPMI 1640 + 2% FBS para inactivar la tripsina.
- Utilizando dos pinzas, ahora liberan las células epidérmicas en el medio suavemente raspando y agitar el epidérmico y el compartimiento cutáneo de las secciones de la piel.
- Filtrar la suspensión de células epidérmicas a través de un filtro de metal (tamaño de orificio de 1 mm) y recoger en un tubo de 50 mL. Añadir las secciones restantes de la piel a un tubo de 50 mL que contiene 10 mL de RPMI-1640 sin FBS y vortex para filtro de 10 s. la suspensión a través del metal del filtro en un tubo de 50 mL que contiene la suspensión de células epidérmicas. Añadir DPBS hasta un volumen total de 50 mL.
- Centrifugue la suspensión celular por 10 min a 450 x g a temperatura ambiente.
- Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células epidérmicas en aproximadamente 10 mL de 37 ° C KSFM dependiendo del tamaño de la pelotilla de la célula. Contar las células con el azul de tripano tinción bajo microscopio. El número de células obtenidas de una sección de piel de 10 cm x 15 cm es aproximadamente 50-100 x 106 células. A cada frasco de cultivo de 75 cm2 , 8 x 106 células junto con 12 mL de 37 ° C KSFM de transferencia. Sacuda suavemente los frascos de cultivo para asegurar una distribución uniforme de las células.
- Incubar los queratinocitos en una incubadora de 37 ° C con 100% humedad y 5% CO2. Cambiar el medio después de 2 días y tres veces semanalmente. Células de paso cuando la cultura es 70-80% confluente, que tarda aproximadamente 2 semanas dependiendo de la tasa de proliferación de los queratinocitos.
2. pases de queratinocitos
- Calentar la cantidad apropiada de solución de tripsina-EDTA 0,05% a 37 ° C en una incubadora. 4,5 mL de solución al 0.05% tripsina-EDTA se utiliza para un frasco de cultivo de 75 cm2 .
- Retire el medio de las células y añadir frasco de 4,5 mL/75 cm2 cultura previamente calentado 0.05% solución de tripsina-EDTA a las células. Coloque el frasco de cultivo en la incubadora (37 ° C) y después de aproximadamente 5 minutos, comprobar al microscopio si las células han comenzado a aflojar.
- Cuando aproximadamente el 50% de las células se hayan aflojado, golpear suavemente el frasco de cultura contra la mano para aflojar las células restantes. Luego, para inactivar la tripsina, añadir 6 mL de RPMI 1640 + 2% FBS (37 ° C) al matraz de cultivo 75 cm2 y transferir la suspensión a tubos de 50 mL.
- Enjuague los frascos de cultivo con 3 mL de RPMI 1640 + 2% FBS y añadir a los tubos de 50 mL. Centrifugar las células durante 10 min a 450 x g a temperatura ambiente.
- Resuspender las células concentradas en 10 mL de KSFM (37 ° C). Contar las células y la transferencia de 3 x 106 células a un matraz de cultivo de 150 cm2 con 20 mL de KSFM (37 ° C). Agite suavemente el frasco de cultivo para asegurar una distribución uniforme de las células. Congelar las células cuando la cultura es 80-90% confluente, que toma aproximadamente 4 a 6 días dependiendo de la tasa de proliferación de los queratinocitos (ver sección 3, a continuación del Protocolo de congelación). Ampliar los queratinocitos para generar adecuadas acciones congeladas.
3. congelación de los queratinocitos
- Calentar la cantidad apropiada de solución de tripsina-EDTA 0,05% a 37 ° C en una incubadora. 9 mL de solución al 0.05% tripsina-EDTA se utiliza para un frasco de cultivo de 150 cm2 .
- Retire el medio de las células y añadir frasco de 9 mL/150 cm2 cultura previamente calentado 0.05% solución de tripsina-EDTA a las células. Coloque el frasco de cultivo en la incubadora (37 ° C) y después de aproximadamente 5 minutos, comprobar al microscopio si las células han comenzado a aflojar.
- Cuando aproximadamente el 50% de las células se hayan aflojado, golpear suavemente el frasco de cultura contra la mano para aflojar las células restantes. Entonces, para inactivar la tripsina, añadir 12 mL de RPMI 1640 + 2% FBS (37 ° C) en el matraz de 150 cm2 cultura y aspirar la suspensión celular en tubos de 50 mL.
- Enjuague los frascos de cultivo con 6 mL de RPMI 1640 + 2% FBS y añadir a los tubos de 50 mL. Centrifugar los tubos durante 10 min a 450 x g a 4 ° C. Preparan celda helada congelación medio (KSFM + 10% DMSO).
- Resuspender el precipitado de células en KSFM + 10% DMSO, contar las células y congelar las células a una densidad de 6 x 106 células/mL con estándar de métodos de criopreservación congelación lenta12.
- Almacenar los keratinocytes en nitrógeno líquido (fase vapor) hasta que esté listo para usar.
4. descongelación y cultivo de queratinocitos congelados
- Rápidamente descongelar los viales congelados apropiados en un baño de agua de 37 ° C. Utilizar el etanol del 70% para limpiar el exterior de la cryovial. Transferir el número apropiado de células (aproximadamente 15.000 células/cm2) a un matraz de cultivo y añadir medio precalentado (KSFM) al matraz de cultivo.
Cualquier tamaño de frascos de cultivo se puede utilizar dependiendo de la configuración del experimento. - Utilizar medio de cultivo 5 mL para un frasco de cultivo de 25 cm2 .
Nota: Los datos han demostrado que en promedio el 95% de las células aisladas por el protocolo descrito aquí son positivo para el marcador del keratinocyte citoqueratina 1413.
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Representative Results
Diferenciación Terminal inducida por calcio
Keratinocytes humanos experimentan diferenciación terminal sobre el tratamiento con calcio14,15,16. Queratinocitos humanos primarios fueron aisladas y cultivadas como se describe en el protocolo anterior. Cuando aproximadamente 50-60% de confluencia, las células fueron estimuladas con calcio (1,2 mM) o vehículo y fotografías de las células fueron tomadas en el día 0, 1 y 2. La figura 1 muestra los cambios morfológicos de los queratinocitos observados sobre el estímulo del calcio.
La expresión de Involucrin es aumentado a estimulación de calcio
Keratinocytes humanos cultivados fueron cultivados hasta aproximadamente 50-60% confluente después de que las células fueron estimuladas con calcio (1,2 mM) o un vehículo para 24 y 48 h. Hemos demostrado que en paralelo con la creciente diferenciación de las células como por los cambios morfológicos de los queratinocitos, la expresión de mRNA del involucrin marcador de diferenciación se incrementaron sobre el estímulo del calcio. Después de 24 y 48 h de la estimulación, la expresión de mRNA de involucrin fue aumentada aproximadamente 5.5-fold y 3.5-fold, respectivamente, en comparación con el vehículo (figura 2).
Fosforilación de p38 MAPK inducida por IL-1β
Para determinar si los queratinocitos humanos aislados fueron sensibles a la activación del cytokine-inducida de vías de señalización intracelular, keratinocytes cultivados fueron estimulados con IL-1β (10 ng/mL) para diferentes puntos del tiempo. Dentro de 5 min, estimulación de la IL-1β condujo a una rápida activación/fosforilación de p38 MAPK, como determinó por borrar occidental. Después de 1 h, fosforilación de MAPK p38 inducida por IL-1β volvió a nivel basal (figura 3). Solamente la forma fosforilada de p38 MAPK se incrementó, como estímulo de IL-1β no tuvo efecto sobre el nivel de proteína total de p38 MAPK (figura 3).
Figura 1 : Imágenes representativas de la diferenciación de queratinocitos inducida por calcio. Keratinocytes humanos primarios cultivados fueron estimulados con vehículo (dH2O) o calcio (1,2 mM) para los puntos de tiempo indicado. (A - E) Imágenes de contraste de fase de los queratinocitos en el día 0 (A), día 1 (B y C) y 2 (D y E) después del estímulo del calcio. Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Mayor expresión del ARNm de involucrin sobre el estímulo del calcio. Calcio (1,2 mM) o vehículo (dH2O) fue añadido al cultivos keratinocytes humanos primarios para los puntos de tiempo indicado (n = 3). RNA fue aislado y analizado la expresión de la diferenciación marcador involucrin por qPCR. RPLP0 expresión del mRNA (Ribosomal proteína grande P0) fue utilizada para la normalización. Resultados representan la media ± D.E. de tres experimentos diferentes. p < 0.05 en comparación con el vehículo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : La fosforilación de p38 MAPK inducida por IL-1β. Keratinocytes humanos primarios cultivados fueron estimulados con vehículo (PBS + 0.15% BSA) o IL-1β (10 ng/mL) para los puntos de tiempo indicado. Extractos proteicos fueron aislado y Western Blot análisis utilizado para medir el nivel fosforilado de p38 MAPK y p38 MAPK. Igual carga se verificó por la incubación con un anticuerpo anti-β-actina. Se muestran los datos de un experimento representativo de tres. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, describimos cómo fácilmente aislar queratinocitos humano primario de piel adulto y su cultivo en vitro. Este modelo puede tener un amplio uso para la investigación de Biología de la célula epidérmica y puede ser útil para los investigadores interesados en el estudio de enfermedades cutáneas.
Algunas de las ventajas del protocolo descrito aquí es que en contraste con queratinocitos de prepucio neonatal de los varones recién nacidos sometidos a la circuncisión, keratinocytes humanos primarios de pacientes adultos aislados de hombres y mujeres y puede incluir cualquier edad ≥18 años. Así, la diversidad biológica es mucho mayor en estas células en comparación con queratinocitos de prepucio neonatal. Además, pueden obtenerse piezas relativamente grandes de muestras de piel de pacientes sometidos a cirugía plástica, mamoplastia de reducción o cirugía para pérdida de peso.
Como se mencionó anteriormente la epidermis está organizada en diferentes capas correspondientes a la etapa específica de la diferenciación de los queratinocitos. Para estudiar la biología de la piel, el modelo descrito aquí es limitado por la falta de un microambiente tridimensional. Las diferentes capas de la epidermis, así como los diferentes tipos de células presentes en la piel no son mímico en este modelo. Para superar esto, pueden utilizarse modelos equivalentes de piel humana, que consisten en un epitelio de varias capas donde distinguir keratinocytes sobre la exposición a la interfase aire-líquido y por lo tanto, más mímico de cerca la epidermis nativo17, 18,19. Otro modelo que puede obtenerse con el fin de estudiar la biología de la piel es el ex vivo piel, en la que las biopsias de la piel se mantienen en culturas en una interfase aire-líquido como se describió anteriormente20.
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Disclosures
. El autor no tiene conflicto de interés.
Acknowledgments
El autor desea agradecer a Annette Blak Rasmussen y Kristine Moeller por su soporte técnico
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | - |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | - |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | - | - | Forceps from any company can be used |
| Scissors | - | - | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | - | - | - |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | - | - | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | - |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | - |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
References
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