Summary
Den mänskliga huden fungerar som en första försvarslinje mot den yttre miljön. Vi presenterar en metod för att isolera primära mänskliga keratinocyter från vuxen hud. Dessa isolerade keratinocyter är användbar i många experimentella uppställningar, och är en mycket lämplig modell för att studera molekylära mekanismer vid kutan biologi in vitro-.
Abstract
Den huvudsakliga funktionen av keratinocyter är att ge den strukturella integriteten av epidermis, därigenom bibehålla en mekanisk barriär mot omvärlden. Dessutom spelar keratinocyter en viktig roll i den inledande, underhåll och reglering av epidermal immunsvaret genom att vara en del av det medfödda immunsystemet svarar på antigena stimuli i en snabb, ospecifik sätt. Här beskriver vi ett protokoll för isolering av primära mänskliga keratinocyter från vuxen hud, och visa att dessa celler svarar på kalcium-inducerad terminal differentiering, mätt med ett ökat uttryck av den differentiering markör involucrin. Vi visar dessutom att de isolerade keratinocyterna är lyhörda för IL-1β-inducerad aktivering av intracellulära signalvägar mätt med aktivering av den p38 MAPK-signalvägen. Sammantaget beskriver vi en metod för isolering och odling av primära mänskliga keratinocyter från vuxen hud. Eftersom keratinocyterna är den dominerande Celltypen i epidermis, är denna metod användbar för att studera molekylära mekanismer vid kutan biologi in vitro.
Introduction
Huden är det största orgeln i människokroppen och fungerar som en skyddande barriär mot den yttre miljön. Huden består av två huvudsakliga lager: dermis och epidermis, där överhuden utgör det yttersta lagret av huden. Den vanligast förekommande Celltypen i epidermis är den keratinocyter som omfattar mer än 95% av cell mass1,2. Keratinocyterna upprätthålls i olika skeden av differentiering i överhuden och är organiserade i basal, ryggkotornas, granulat och cornified lager som motsvarar specifika stadier av differentiering3. Keratinocyter primära funktion är att ge den strukturella integriteten av epidermis, vilket framkallar en intakt barriär till omvärlden.
Keratinocyterna också utgör den första försvarslinjen mot patogener i huden, och därför spela en viktig roll i det medfödda immunförsvar4,5. Exponering av keratinocyter för yttre stimuli leder till aktivering av intracellulära signalvägar och därefter, produktion av ett antal olika inflammatoriska mediatorer inklusive cytokiner, chemokiner och antimikrobiella peptider. Dessa keratinocyter framställda proteiner deltar i den inflammatoriska reaktionen genom att rekrytera och aktivera immunceller som dendritiska celler, neutrofiler och specifika T celler6,7. Således, eftersom keratinocyter spelar en avgörande roll i många biologiska processer, logiken bakom den teknik som presenteras här var att generera ett in vitro- modell för att studera hudbiologi. Primära keratinocyter kulturer erhållits från neonatal förhud används ofta för att studera hud biologi8,9. Dock med den teknik som beskrivs här, erhålls keratinocyter från båda könen vilket resulterar i en högre biologisk mångfald av cellerna.
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för isolering och generering av primära mänskliga keratinocyter från vuxen hud, inklusive underhåll och frysning av keratinocyter. Det övergripande målet med denna metod är att generera primära mänskliga keratinocyter som kan användas som en modell för att studera kutan biologi in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Provtagning för hud från friska vuxna frivilliga genomgå plastikkirurgi kräver godkännande från etiska kommittén i värdinstitutionerna. Detta protokoll godkändes av de regionala etiska kommittén i Region Midtjylland, Danmark (M-20110027). Den metod som beskrivs här härstammar från liknande studier av Maciaq et al. 10 och Liu och Karasek11.
1. isolering av keratinocyter från mänsklig hud
- Börja genom att göra följande lösningar: 50 mL lösning 0,25% trypsin och 0,1% glukos i DPBS. Blanda och filtrera sterilisera (0,2 µm) lösningen. Förbereda 10 mL RPMI-1640 + 2% FBS lösning, 50 mL DPBS och keratinocyter serumfritt medium (KSFM). Tillsätt KSFM kosttillskott och 250 µL av gentamycin till 500 mL KSFM. Pre varma lösningar till 37 ° C före användning.
- Samla in huden från friska vuxna frivilliga genomgå plastikkirurgi. De hud prover som används är ca 10 cm x 15 cm, men kan variera i storlek. Hålla huden sval under transport genom att transportera hud proverna i en frigolitlåda som innehåller ett kylelement. Vid behov kan huden provet lagras vid 4 ° C över natten.
- Ta bort fett från under huden avsnittet använda steriliserade sax, skalpell och pincett.
- Spänne ut avsnittet hud (cirka 10 x 15 cm) på en steril locket ovanpå en tallrik med nålar. Först ren huden med en torr steriliserad kompress. Sedan ren huden med en steriliserad kompress med 70% etanol.
- Använder en fot hyvel, skär av den övre hudlagret (epidermis) avsnittet hud och lägga den i en 9 cm petriskål. Sedan omedelbart lägger du till 25 mL av den DPBS/trypsin/glukoslösning (bereddes i steg 1.1) petriskål. Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C.
- Med pipett bort DPBS/trypsin/glukoslösning från petriskål och tillsätt 10 mL av RPMI-1640 + 2% FBS att inaktivera trypsin.
- Använder två pincett, nu släpp de epidermala cellerna till mediet genom att försiktigt skrapa och agitera både den epidermala och dermal facket av avsnitten hud.
- Filtrera den epidermala cellsuspensionen genom ett metall filter (1 mm hål storlek), och samla i en 50 mL tub. Lägga till de återstående hud-avsnitten i en 50 mL tub innehållande 10 mL RPMI-1640 utan FBS och vortex för 10 s. Filter suspensionen genom metallen filtrera till en 50 mL tub med epidermal cellsuspension. Lägga till DPBS till en total volym om 50 mL.
- Centrifugera cellsuspensionen i 10 min på 450 x g vid rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten epidermal i ca 10 mL av 37 ° C KSFM beroende på cellpelleten storlek. Räkna cellerna med hjälp av den Trypan blå färgning metod under mikroskop. Antalet celler som erhållits från ett 10 x 15 cm hud avsnitt är cirka 50-100 x 106 celler. Till varje 75 cm2 kultur kolv, överföra 8 x 106 celler tillsammans med 12 mL 37 ° C KSFM. Skaka försiktigt kultur kolvar för att säkerställa jämn fördelning av cellerna.
- Inkubera i keratinocyter i en 37 ° C inkubator med 100% luftfuktighet och 5% CO2. Ändra mediet efter 2 dagar och tre gånger i veckan. Passagen celler när kulturen är 70-80% konfluenta, vilket tar ungefär 2 veckor beroende på spridning av keratinocyter.
2. passaging av keratinocyter
- Värm lämplig mängd 0,05% Trypsin-EDTA-lösning till 37 ° C i en inkubator. Använda 4,5 mL 0,05% Trypsin-EDTA-lösning för en 75 cm2 kultur kolv.
- Ta bort mediet från cellerna, och lägga till 4,5 mL/75 cm2 kultur kolven värmas före 0,05% Trypsin-EDTA-lösning till cellerna. Placera kolven kultur i inkubatorn (37 ° C) och efter ca 5 min, kolla under mikroskopet om cellerna har börjat lossa.
- När cirka 50% av cellerna har lossat, försiktigt slå kultur kolven mot handen för att lossa de resterande cellerna. Om du vill inaktivera trypsin, Lägg sedan 6 mL RPMI-1640 + 2% FBS (37 ° C) till 75 cm2 kultur kolven och överföra cellsuspensionen till 50 mL rör.
- Skölj de kultur kolvarna med 3 mL RPMI 1640 + 2% FBS och lägga till de 50 mL rör. Centrifugera celler i 10 min på 450 x g vid rumstemperatur.
- Resuspendera pelleterat cellerna i 10 mL av KSFM (37 ° C). Räkna cellerna och överföra 3 x 106 celler till en 150 cm2 kultur kolv tillsammans med 20 mL av KSFM (37 ° C). Skaka försiktigt kultur kolven för att säkerställa jämn fördelning av cellerna. Frysa cellerna när kulturen är 80-90% konfluenta, vilket tar cirka 4-6 dagar beroende på spridning av den keratinocyter (se avsnitt 3, frysning protokoll nedan). Expandera den keratinocyter för att generera lämpliga fryst lager.
3. frysning av keratinocyter
- Värm lämplig mängd 0,05% Trypsin-EDTA-lösning till 37 ° C i en inkubator. Använd 9 mL 0,05% Trypsin-EDTA-lösning för en 150 cm2 kultur kolv.
- Ta bort mediet från cellerna, och lägga till 9 mL/150 cm2 kultur kolven värmas före 0,05% Trypsin-EDTA-lösning till cellerna. Placera kolven kultur i inkubatorn (37 ° C) och efter ca 5 min, kolla under mikroskopet om cellerna har börjat lossa.
- När cirka 50% av cellerna har lossat, försiktigt slå kultur kolven mot handen för att lossa de resterande cellerna. Om du vill inaktivera trypsin, Lägg sedan 12 mL RPMI-1640 + 2% FBS (37 ° C) till 150 cm2 kultur kolven och aspirera cellsuspensionen till 50 mL rör.
- Skölj de kultur kolvarna med 6 mL RPMI 1640 + 2% FBS och lägga till de 50 mL rör. Centrifugera rören i 10 min på 450 x g vid 4 ° C. Förbereda iskall cell frysning medium (KSFM + 10% DMSO).
- Återsuspendera cellpelleten i KSFM + 10% DMSO, räkna cellerna och frysa celler med en täthet på 6 x 106 celler/mL med hjälp av standard långsam frysning frysförvaring metoder12.
- Lagra keratinocyter i flytande kväve (gasfasen) förrän du är klar att använda.
4. upptining och odlingsskålar frysta keratinocyter
- Snabbt Tina de lämpliga frysta injektionsflaskorna i 37 ° C vattenbad. Använd 70% etanol för att rengöra utsidan av cryovial. Överföra lämpligt antal celler (cirka 15 000 celler/cm2) till en kultur-kolv och tillsätt omedelbart före värmde odlingsmedium (KSFM) till kultur kolven.
Alla storlekar av kultur kolvar kan användas beroende på inställningen av experimentet. - Använd 5 mL odlingsmedium för en 25 cm2 kultur kolv.
Obs: Våra data har visat att i genomsnitt 95% av de celler som isolerats genom det protokoll som beskrivs här är positivt för keratinocyter-markör cytokeratine-1413.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kalcium-inducerad Terminal differentiering
Mänskliga keratinocyter genomgår terminal differentiering vid behandling med kalcium14,15,16. Primära mänskliga keratinocyter var isolerade och odlade som beskrivs i ovanstående protokoll. När cirka 50-60% konfluenta, cellerna stimuleras med kalcium (1,2 mM) eller fordon och bilder av celler togs på dag 0, 1 och 2. Figur 1 visar de morfologiska förändringarna av den keratinocyter som observerats vid kalcium stimulering.
Uttryck av Involucrin är ökat vid kalcium stimulering
Odlade mänskliga keratinocyter odlades fram till cirka 50-60% konfluenta varefter cellerna stimuleras med kalcium (1,2 mM) eller ett fordon för 24 och 48 timmar. Vi visat att parallellt med ökad differentiering av celler som observerades av de morfologiska förändringarna av keratinocyter, mRNA uttryck för den differentiering markör involucrin ökade betydligt vid kalcium stimulering. Efter 24 och 48 h av stimulering, involucrin mRNA uttrycket ökades ungefärligt 5.5-fold och 3.5-fold, respektive, jämfört med fordon (figur 2).
IL-1β-inducerad fosforylering av p38 MAPK
Att avgöra om de isolerade mänskliga keratinocyterna var lyhörda för cytokin-inducerad aktivering av intracellulära signalvägar, odlade keratinocyter stimuleras med IL-1β (10 ng/mL) för olika tidpunkter. Inom 5 min, IL-1β stimulering ledde till en snabb aktivering/fosforylering av p38 MAPK, som bestäms av Western blotting. Efter 1 h, hade IL-1β-inducerad p38 MAPK fosforylering återvänt till basal nivå (figur 3). Bara den fosforylerade formen av p38 MAPK ökades, som IL-1β stimulering hade ingen effekt på den totala protein nivån av p38 MAPK (figur 3).
Figur 1 : Representativa bilder av kalcium-inducerad differentiering av keratinocyter. Odlade primära mänskliga keratinocyter stimuleras med fordon (dH2O) eller kalcium (1,2 mM) för de angivna tidpunkterna. (A - E) Fas av keratinocyter på dag 0 (A), dag 1 (B och C) och dag 2 (D och E) bilder på kontrast kalcium stimulation. Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Ökat mRNA-uttryck av involucrin vid kalcium stimulering. Kalcium (1,2 mM) eller fordon (dH2O) lades till odlade primära mänskliga keratinocyter för angivna tidpunkter (n = 3). RNA isolerades och uttrycket av den differentiering markör involucrin analyseras med qPCR. RPLP0 (ribosomala proteinet stor P0) mRNA uttryck användes för normalisering. Medelvärde ± S.D. representerar resultaten från tre olika experiment. p < 0,05 jämfört med fordon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : IL-1β-inducerad fosforylering av p38 MAPK. Odlade primära mänskliga keratinocyter stimuleras med fordon (PBS + 0,15% BSA) eller IL-1β (10 ng/mL) för de angivna tidpunkterna. Protein extrakt var isolerade och Western blotting analys används för att mäta fosforyleras p38 MAPK och totalt p38 MAPK. Lika lastning kontrollerades genom inkubation med en anti-β-aktin antikropp. Data från ett representativt experiment av tre visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi hur du enkelt isolera primära mänskliga keratinocyter från vuxen hud och hur du kultur dem i vitro. Denna modell kan ha en bred tillämpning för utredning av epidermal cellbiologi, och kan vara användbar för forskare som är intresserade av att studera kutan sjukdomar.
Några av fördelarna med av protokollet som beskrivs här är att i motsats till keratinocyter isolerade från neonatal förhud erhållits från nyfödda män som genomgår omskärelse, primära mänskliga keratinocyter från vuxna patienter är isolerade från både män och kvinnor och kan innehålla någon ålder ≥ 18 år. Biologiska mångfald är alltså mycket större i dessa celler jämfört med keratinocyter från neonatal förhud. Dessutom kan relativt stora bitar av huden prover erhållas från patienter som genomgår plastikkirurgi, såsom Bröstförminskning eller viktminskning kirurgi.
Som nämnts ovan är epidermis organiserad i olika lager som motsvarar specifika differentiering scenen av keratinocyter. För att studera hudbiologi, begränsas den modell som beskrivs här av bristen på en tredimensionell mikromiljö. De olika lagren av epidermis samt de olika celltyper som finns i huden är inte härmade i denna modell. För att övervinna detta, mänsklig hud motsvarande modeller kan användas, som består av ett flerskiktat epitel där keratinocyter skilja vid exponering för ett luft-vätska-gränssnitt, och därmed mer noga härma de infödda epidermis17, 18,19. En annan modell som kan erhållas för att studera hudbiologi är ex vivo hud modell, där huden biopsier hålls i kulturer på ett luft-vätska interphase som tidigare beskrivits20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. Författaren har någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Författaren vill tacka Annette Blak Rasmussen och Kristine Moeller för deras tekniska support
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | - |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | - |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | - | - | Forceps from any company can be used |
| Scissors | - | - | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | - | - | - |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | - | - | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | - |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | - |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
References
- Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J.
- Nickoloff, B. J., Turka, L. A.
- Fuchs, E., Raghavan, S.
- Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. The skin immune system Its cellular constituents and their interactions. Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).
- Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G.
- Gilliet, M., Lande, R. Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation. Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).
- Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes. J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).
- Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).
- Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes. Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).
- Liu, S. C., Karasek, M. Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture. J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).
- Otkjaer, K., et al. IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms. J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).
- Watt, F. M. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19 Unit 19.19 (2008).
- Kamsteeg, M., et al. Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent. Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).
- van den Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases. J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).
- Raaby, L., et al. Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment. Exp Dermatol. , (2017).
