Summary
인간의 피부는 외부 환경에 대 한 방어의 첫 번째 줄 역할을 합니다. 우리는 성인 피부에서 기본 인간의 keratinocytes를 격리 하기 위한 방법을 제시. 이러한 격리 keratinocytes 수많은 실험 설정에 유용 하 고 공부 하는 분자 메커니즘 피부 생물학에 생체 외에서. 에 대 한 매우 적합 한 모델
Abstract
Keratinocytes의 주요 기능 표 피, 유지 하 고 외부 세계에 기계적인 방 벽의 구조적 무결성을 제공 하는 것입니다. 또한, keratinocytes 빠른, 일반적인 방식으로 항 원 자극에 응답 하는 타고 난 면역 체계의 부분이 되 고에 의해 개시, 유지 보수, 그리고 피 면역 반응의 규칙에서 필수적인 역할을 재생 합니다. 우리가 성인 피부에서 기본 인간 keratinocytes의 격리에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기,이 셀 칼슘 유도 터미널 차별화, 차별화 마커 involucrin의 증가 식에 의해 측정에 응답 입증 하 고. 또한, 우리는 고립 된 keratinocytes p38 MAPK 통로의 활성화에 의해 측정 된 세포내 신호 통로의 활성화 IL 1β 유도 반응 하 보여줍니다. 함께 찍은, 고립과 성인 피부에서 기본 인간 keratinocytes의 경작 하는 방법을 설명 합니다. Keratinocytes는 표 피에 우위 한 세포 종류 이기 때문에,이 방법은 피부 생물학 생체 외에서 분자 메커니즘 연구 유용 합니다.
Introduction
피부는 인체의 가장 큰 장기 이며 외부 환경에 대 한 보호벽 역할. 피부는 두 가지 주요 레이어 구성: 진 피와 표 피, 표 피는 피부의 가장 바깥쪽 레이어를 구성 하는 곳. 표 피에서 가장 풍부한 셀 타입 keratinocytes 셀 대량1,2의 95% 이상으로 구성 된입니다. Keratinocytes는 표 피에 차별화의 다양 한 단계에서 유지 하 고 차별화3의 특정 단계에 해당 하는 기초, spinous, 세분화, 및 cornified 계층으로 구성 됩니다. Keratinocytes의 기본 기능은 외부 세계에 그대로 배리어를 생산 함으로써 표 피의 구조적 무결성을 제공 하는 것입니다.
Keratinocytes는 또한 피부에 병원 체에 대 한 방어의 첫 번째 줄을 대표 하 고 따라서 타고 난 면역 반응4,5에서 중요 한 역할. 외부 자극에는 keratinocytes의 노출 및 연속적으로, 세포내 신호 통로의 활성화 다양 한 cytokines, 발산, 및 항균 성 펩 티 드를 포함 하 여 다양 한 선 동적인 중개자의 생산 리드. 이러한 keratinocyte 파생 단백질 보충 하 고 활성화 하는 수지상 세포, 호 중구, 특정 T 세포6,7등 면역 세포 염증 반응에 참가. 따라서, keratinocytes 수많은 생물학 과정에 중요 한 역할을 하 고, 때문에 피부 생물학 공부를 생체 외에서 모델을 생성 하 뒤 여기에 제시 된 기술에 근거가 했다. 신생아 포 피에서 얻은 기본 keratinocyte 문화 자주 피부 생물학8,9공부 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 여기에 설명 된 기술을 두 남녀에서 keratinocytes 셀의 높은 생물 다양성의 결과로 얻어진 다.
여기, 선물이 분리와 성인 피부에서 기본 인간 keratinocytes의 세대에 대 한 자세한 프로토콜 유지 보수를 포함 하 고는 keratinocytes의 동결. 이 방법의 전반적인 목표 생성 기본 인간의 keratinocytes 피부 생물학 생체 외연구 모델로 사용 될 수 있는 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
건강 한 성인 지원자 성형 수술에서 피부 샘플 컬렉션 호스트 기관에서 윤리 위원회 로부터 승인을 받아야 합니다. 이 프로토콜은 지역 윤리 위원회의 지역 Midtjylland, 덴마크 (M-20110027)에 의해 승인 되었다. 여기에 설명 된 메서드는 Maciaq 그 외 여러분 에 의해 비슷한 연구에서 파생 된 10 그리고 Liu와 Karasek11.
1입니다. 인간의 피부에서 Keratinocytes의 격리
- 다음과 같은 솔루션을 제작 하 여 시작: DPBS에 0.25 %trypsin 및 0.1% 포도 당 50ml 솔루션. 믹스와 필터 소독 (0.2 µ m) 솔루션. RPMI-1640 + 2 %FBS 솔루션, DPBS 및 keratinocyte 혈 청 무료 매체 (KSFM)의 50 mL의 10 mL를 준비 합니다. KSFM의 500 ml KSFM 보충 및 gentamycin의 250 µ L를 추가 합니다. 미리 따뜻한 솔루션을 사용 하기 전에 37 ° C.
- 건강 한 성인 지원자 성형 수술에서 피부를 수집 합니다. 피부 샘플 사용 하지만 약 10 cm x 15 cm, 크기에서 다를 수 있습니다. 냉각 요소를 포함 하는 스티로폼 상자에 피부 샘플을 운반 하 여 교통 아래 피부 차가운 유지. 필요한 경우, 피부 샘플 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 하룻밤.
- 소독, scalpels가 위와 집게를 사용 하 여 피부 섹션 아래에서 지방을 제거.
- 바늘을 사용 하 여 접시 위에 무 균 커버에 피부 섹션 (약 10 cm x 15 cm) 버클. 첫째, 건조 멸 균된 거 즈 패드와 함께 피부를 청소. 다음 70% 에탄올으로 소독된 거 즈 패드를 사용 하 여 피부를 청소.
- 발 평면을 사용 하 여, 피부 섹션의 상위 계층 (표 피)의 잘라 고 9 cm 배양 접시에에서 넣어. 다음, 즉시 페 트리 접시 (단계 1.1에서에서 준비) DPBS/트립 신/포도 당 솔루션의 25 mL를 추가 합니다. 37 ° c.에 30 분 동안 품 어
- 피 펫을 사용 하 여 배양 접시에서 DPBS/트립 신/포도 당 솔루션을 제거 하 고 RPMI 1640 + 2 %FBS 트립 신을 비활성화에 10 mL을 추가.
- 두 개의 집게를 사용 하 여, 지금 분리 상피 세포 매체에 부드럽게 된다고 하 고는 표 피와 피부 부분의 피부 구획을 교 반 하십시오.
- 표 피 세포 현 탁 액 (1 m m 구멍 크기), 금속 필터를 통해 필터링을 50 mL 튜브에 수집 합니다. FBS와 소용돌이 없이 RPMI-1640의 10 mL를 포함 하는 포함 하는 표 피 세포 현 탁 액 50 mL 튜브에 금속을 통해 서 스 펜 션 필터의 s. 필터 10 개 50 mL 튜브에 나머지 피부 섹션을 추가 합니다. 50 mL의 총 볼륨 DPBS를 추가 합니다.
- 셀 서 스 펜 션 실내 온도에 450 x g에서 10 분 원심
- 상쾌한을 제거 하 고 37 ° C KSFM 셀 펠 릿의 크기에 따라 약 10 mL에 상피 세포 pellet을 resuspend. Trypan 블루 얼룩 현미경 메서드를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 10 cm x 15 cm 피부 단면도에서 얻은 세포 수는 약 50-100 x 106 세포입니다. 각 75 cm2 문화 플라스 크를 37 ° C KSFM의 12 mL와 8 x 106 셀을 전송 합니다. 부드럽게 셀의 균일 분배를 보장 하기 위해 문화 flasks 흔들.
- Keratinocytes 100% 습도 및 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 품 어. 2 일 후에 세 번 매주 매체를 변경 합니다. 문화는 keratinocytes의 확산 속도 따라 약 2 주 후 70-80% 합칠 때 세포를 통과.
2. 뿌리고 Keratinocytes의
- 인큐베이터에서 37 ° C에 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션의 적절 한 금액을 열. 0.05% 트립 신-EDTA 용액의 4.5 mL를 사용 하 여 75 cm2 문화 플라스 크에 대 한.
- 매체는 셀에서 제거 하 고 4.5 mL/75 cm2 문화 플라스 크는 셀에 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션에 미리 예 열을 추가 합니다. 인큐베이터 (37 ° C)에서 문화 플라스 크를 놓고 셀 불기 시작 하는 경우 약 5 분 후 현미경 검사.
- 셀의 약 50%는 느슨하게 하면 부드럽게 손 풀고 나머지 셀에 대 한 문화 플라스 크를 했다. 그런 다음 비활성화는 트립 신에 75 cm2 문화 플라스 크를 RPMI 1640 + 2 %FBS (37 ° C)의 6 mL을 추가 하 고 50 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 키를 누릅니다.
- 린스 RPMI 1640 + 2%의 3 mL와 함께 문화 flasks FBS 50 mL 튜브에 추가. 실내 온도에 450 x g에서 10 분에 대 한 셀 원심
- KSFM (37 ° C) 10 mL에 수송과 셀 resuspend 셀을 계산 하 고 KSFM (37 ° C)의 20 mL와 150 cm2 문화 플라스 크에 3 x 106 셀을 전송. 부드럽게 셀의 균일 분배를 보장 하기 위해 문화 플라스 크를 흔들어. 문화는 (냉동 프로토콜 아래 섹션 3 참조) keratinocytes의 확산 속도 따라 약 4-6 일 소요 80-90% 합칠 때 셀을 고정 합니다. 적절 한 냉동된 주식을 생성 하 keratinocytes를 확장 합니다.
3입니다. 동결 Keratinocytes의
- 인큐베이터에서 37 ° C에 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션의 적절 한 금액을 열. 0.05% 트립 신-EDTA 용액의 9 mL를 사용 하 여 150 cm2 문화 플라스 크에 대 한.
- 매체는 셀에서 제거 하 고 9 mL/150 cm2 문화 플라스 크는 셀에 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션에 미리 예 열을 추가 합니다. 인큐베이터 (37 ° C)에서 문화 플라스 크를 놓고 셀 불기 시작 하는 경우 약 5 분 후 현미경 검사.
- 셀의 약 50%는 느슨하게 하면 나머지를 완화 하기 위해 부드럽게 손에 대 한 문화 플라스 크를 했다. 그런 다음 비활성화는 트립 신에 150 cm2 문화 플라스 크를 RPMI 1640 + 2 %FBS (37 ° C)의 12 mL을 추가 하 고 50 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 발음 키를 누릅니다.
- 린스 RPMI 1640 + 2%의 6 mL와 함께 문화 flasks FBS 50 mL 튜브에 추가. 4 ° c.에 450 x g에서 10 분 동안 관을 원심 매체 (KSFM + 10 %DMSO) 얼어 얼음 처럼 차가운 셀을 준비 합니다.
- Resuspend KSFM + 10 %DMSO 셀 펠 릿, 셀, 및 표준 느린 냉동 cryopreservation 방법12를 사용 하 여 6 x 106 셀/mL의 농도에서 세포를 동결.
- 사용할 준비가 될 때까지 액체 질소 (기상) keratinocytes를 저장 합니다.
4. 해빙과 동결된 Keratinocytes 경작
- 빠르게 녹여 37 ° C 물 욕조에 적절 한 냉동된 튜브. 70% 에탄올을 사용 하 여는 cryovial의 외부를 청소. 문화 플라스 크에 세포 (약 15, 000 셀/cm2)의 적절 한 번호를 전송 하 고 즉시 문화 플라스 크를 미리 데워 진된 성장 매체 (KSFM)를 추가 합니다.
문화 플라스 크의 어떤 크기 든 지 실험의 설정에 따라 사용할 수 있습니다. - 5 mL 문화 매체를 사용 하 여 25 cm2 문화 플라스 크에 대 한.
참고: 데이터 평균 여기에 설명 된 프로토콜에 의해 분리 하는 세포의 95%는 keratinocyte 마커 cytokeratine-1413에 대 한 긍정적인 것을 증명 하고있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
칼슘 유도 터미널 차별화
인간의 keratinocytes 칼슘14,,1516치료 시 터미널 차별화를 받 다. 기본 인간 keratinocytes 고립 되었고 위의 프로토콜에 설명 된 대로 양식. 때 약 50-60% 합칠 셀 칼슘 (1.2 m m) 자극 했다 또는 0, 1 및 2 일에 차량 및 셀의 사진을 찍은. 그림 1 에서는 칼슘 자극 시 관찰 keratinocytes의 형태학 변화.
Involucrin의 식이 칼슘 자극 시 증가
교양된 인간 keratinocytes 약 50-60% 합칠 후 셀 칼슘 (1.2 m m) 또는 24 및 48 h 차량 자극 했다까지 성장 했다. 우리는 그는 keratinocytes의 형태학 적 변화에 의해 관찰 세포의 증가 차별화와 병렬로 분화 마커 involucrin의 mRNA 표현 크게 증가 칼슘 자극 시 시연 했다. 자극의 24 및 48 h 후 involucrin mRNA 식 5.5-fold 약 증가 하 고 3.5-fold, 각각, 차량 (그림 2)와 비교 했다.
P38 MAPK의 IL 1β 유도 인 산화
교양된 keratinocytes IL 1β로 자극 했다 고립 된 인간의 keratinocytes 세포내 신호 통로의 활성화를 유도 하는 사이토카인에 반응 한다면, 확인 (10 ng/mL) 다양 한 시간 포인트. 5 분 이내 IL 1β 자극을 주도하는 빠른 활성화/인 산화 p38 MAPK의 서쪽 blotting에 의해 결정 됩니다. 1 시간 후 IL 1β 유도 p38 MAPK 인 산화 기저 수준 (그림 3)으로 돌아왔다. IL 1β 자극 했다 p38 MAPK (그림 3)의 총 단백질 수준에 영향을 주지 않습니다만 p38 MAPK의 phosphorylated 모양 증가 되었다.
그림 1 : Keratinocytes의 칼슘 유도 분화의 대표적인 이미지. 교양된 기본 인간의 keratinocytes 차량 (dH2O) 또는 칼슘 (1.2 m m) 표시 시간 포인트 자극 했다. (A-E) Keratinocytes 하루 0 (A), (B 와 C), 1 일과 2 일에 (D 및 E) 칼슘 자극 후의 위상 대비 이미지. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 증가 칼슘 자극 시 involucrin의 mRNA 표정. 칼슘 (1.2 m m) 또는 차량 (dH2O) 표시 시간 포인트에 대 한 교양된 기본 인간의 keratinocytes에 추가 되었습니다 (n = 3). RNA 분리 되었고 분화 마커 involucrin의 식 정량 분석. RPLP0 (Ribosomal 단백질 큰 P0) mRNA 식 정규화를 위해 사용 되었다. 결과 3 개의 다른 실험에서 평균 ±를 사 우 스 다코타를 나타냅니다. p < 0.05 차량에 비해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : P38 MAPK의 인 산화 IL 1β 유도. 교양된 기본 인간의 keratinocytes 차량 (PBS + 0.15 %BSA) 또는 IL 1β 자극 했다 (10 ng/mL) 표시 시간 포인트. 단백질 추출 했다 p38 MAPK의 phosphorylated 수준을 측정 하는 데 사용 되는 절연 및 서쪽 더 럽 히 분석 및 p38 MAPK 총. 동일한 로드 안티-β-말라 항 체를 가진 외피에 의해 확인 되었다. 3에서 한 대표적인 실험에서 데이터 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기, 우리가 쉽게 기본 인간의 keratinocytes 성인 피부에서 분리 하는 방법과 생체 외에서문화를 설명 합니다. 이 모델의 표 피 세포 생물학, 조사에 대 한 광범위 한 응용 프로그램을 가질 수 있으며 연구자 피부 질병을 공부에 관심이 더 유용할 수 있습니다.
여기에 설명 된 프로토콜의 장점 중 일부입니다 keratinocytes 신생아 남성 할례를 받고에서 얻은 신생아 포 피에서 분리, 달리 성인 환자에서 1 차 인간의 keratinocytes 남성과 여성 모두에서 격리 그리고 모든 나이 ≥18 년 포함 될 수 있습니다. 따라서, 생물 다양성은이 세포와 keratinocytes 신생아 포 피에서 비교에 훨씬 더 큰. 또한, 피부 샘플의 비교적 큰 조각 성형 수술, 유 방 감소 수술 체중 감소 수술 등 환자에 게 서 얻어질 수 있다.
위에서 언급 한 표 피는 keratinocytes의 특정 분화 단계에 해당 하는 여러 계층에 구성 됩니다. 피부 생물학을 공부 하기 위하여 여기에서 설명 하는 모델은 3 차원 microenvironment의 부족에 의해 제한 됩니다. 표 피는 피부에 다른 세포 유형의 다른 층이이 모델에서 유사 하지는. 이것을 극복 하기 위해 인간의 피부 등가 모델 사용할 수 있습니다, 이루어져 있는 다층된 상피 keratinocytes는 공기 액체 인터페이스에 노출 되 면 차별화 고 따라서, 더 밀접 하 게 흉내 낸 기본 표 피17, 18,19. 피부 생물학을 공부 하기 위해 얻을 수 있는 또 다른 모델은 ex vivo 피부 모델, 피부 생 검에서 앞에서 설명한20공기 액체 interphase 문화에 보관 됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. 저자는 충돌의 관심이 있다.
Acknowledgments
저자는 아네트 Blak 라 스무 센과 크리스틴 Moeller 그들의 기술 지원에 감사 하고자
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | - |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | - |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | - | - | Forceps from any company can be used |
| Scissors | - | - | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | - | - | - |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | - | - | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | - |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | - |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
References
- Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J.
- Nickoloff, B. J., Turka, L. A.
- Fuchs, E., Raghavan, S.
- Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. The skin immune system Its cellular constituents and their interactions. Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).
- Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G.
- Gilliet, M., Lande, R. Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation. Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).
- Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes. J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).
- Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).
- Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes. Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).
- Liu, S. C., Karasek, M. Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture. J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).
- Otkjaer, K., et al. IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms. J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).
- Watt, F. M. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19 Unit 19.19 (2008).
- Kamsteeg, M., et al. Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent. Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).
- van den Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases. J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).
- Raaby, L., et al. Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment. Exp Dermatol. , (2017).
